全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (3): 246–253, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00246
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收稿日期: 2013-08-05; 接受日期: 2013-10-31
基金项目: 江苏省农业科技自主创新基金(No.CX(11)4011)、农业部948项目(No.2011-G23)和国家油菜产业技术体系(No.ARS-13)
* 通讯作者。E-mail: qckjaas@gmail.com
应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因
李春宏, 付三雄, 戚存扣*
江苏省农业科学院经济作物研究所, 国家油菜改良中心南京分中心, 南京 210014
摘要 以甘蓝型油菜(Brassica napus)野生型(宁油10号)及其柱头授粉功能缺失突变体FS-M1为材料, 使用油菜基因表达
谱芯片筛选甘蓝型油菜柱头特异表达基因。在含有16 540个基因的油菜基因表达谱芯片中(43 803探针), 获得了4 410条差
异表达探针, 选择部分差异表达基因进行实时定量PCR, 所得结果与芯片检测结果相吻合。其中, 野生型较FS-M1显著上调
且获得209个功能注释的探针, 对应198个基因, 这些特异表达的基因主要富集在水解酶、转移酶、氧化还原酶和转录因子
中; 涉及较大的基因家族包括: 细胞色素P450基因、GDSL脂肪酶/水解酶基因、ABC转运蛋白基因、myb转录因子基因、
bHLH转录因子基因、过氧化物酶家族和受体激酶基因等。推测这些基因与甘蓝型油菜柱头发育及授粉功能有关。
关键词 甘蓝型油菜, 基因表达谱, 基因芯片, 实时定量PCR, 柱头
李春宏, 付三雄, 戚存扣 (2014). 应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因. 植物学报 49, 246–253.
授粉反应是显花植物繁殖过程中的首要阶段。在
授粉过程中, 柱头排斥非亲和性花粉粒, 特异性地接
受亲和性花粉粒在其表面黏附、水合和萌发, 以及随
后的花粉管在乳突细胞穿越(Kang and Nasrallah,
2001; Li et al., 2007)和花柱中延伸, 从而到达胚珠进
行下一步的受精反应。柱头是授粉反应的主要场所,
授粉反应中柱头将发生一系列极其重要的生理生化
变化, 涉及复杂的特异性互作事件(Kang and Nas-
rallah, 2001)。授粉反应过程必然涉及柱头中许多重
要的基因, 了解植物授粉反应过程中柱头基因的调控
对于揭示作物生长和发育规律及籽粒形成机理具有
重要意义。然而, 目前柱头中仅有少数几个参与授粉
反应的基因, 如受体激酶(SRK)基因、糖蛋白SLG基
因(Li et al., 2007)和囊泡亚基Exo70A1基因(Samuel
et al., 2009)等的分子作用被鉴定。
本实验室1 99 6年在自交亲和的甘蓝型油菜
(Brassica napus)品种宁油10号中发现了柱头授粉功
能缺陷的自然突变体。该突变与自交不亲和无关(陈
新军等, 2003, 2005)。取该突变株与宁油10号植株进
行多代授粉自交, 测交, 获得了除柱头授粉功能缺陷
外, 其它生物学性状与宁油10号植株无差异的近等
基因系, 并命名为FS-M1。FS-M1的突变性状由2对

隐性基因控制, 遗传性状稳定, 植株花粉育性正常,
是研究甘蓝型油菜柱头分子功能机理的理想突变体
材料(李春宏, 2012a; Li et al., 2012)。我们基于蛋白
质组学的方法, 利用野生型宁油10号和该突变株成
熟柱头为材料, 已获得了一些在野生型柱头中显著上
调表达的蛋白, 推测这些蛋白与油菜柱头授粉功能的
调控有关(李春宏, 2012b)。本研究继续利用FS-M1
及其野生型成熟柱头为材料, 基于转录组学的方法,
采用基因表达谱芯片技术, 筛选出在野生型柱头特异
性上调表达的基因, 并分析这些表达基因的性质和功
能, 以期结合基因转录水平与蛋白水平揭示甘蓝型油
菜柱头授粉的分子功能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)突变体FS-M1及其野
生型宁油10号于2010年9月种植于江苏省农业科学
院经济作物研究所实验圃中。在盛花期, 选取发育进
程和长势一致的FS-M1及其野生型宁油10号植株 ,
分别取其将开花的成熟柱头迅速贮存在液氮中, 并在
–80°C冰箱中保存备用。
·研究报告·
李春宏等: 应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因 247
1.2 实验方法
1.2.1 油菜样品总RNA的提取与纯化
采用改良的CTAB法提取总RNA(陈小平等, 2011)。使
用QIAGEN RNAeasy mini kit纯化RNA, 具体方法参
见试剂盒操作手册。用Agilent BioAnalyzer 2100检测
28S和18S rRNA的比例, 以评估总RNA的完整性。用
紫外分光光度计分别测定RNA在260 nm和280 nm
处的吸收峰, 计算总RNA的浓度与纯度(付三雄和戚
存扣, 2009)。

1.2.2 芯片实验
实验所用基因芯片为Agilent公司油菜基因表达谱芯
片(Agilent Brassica Oligo Microarray)。芯片实验由
上海生物芯片有限公司-生物芯片上海国家工程研究
中心完成。该油菜基因表达谱芯片涵盖43 803种探
针, 代表了16 540个基因的29 803个转录本, 序列来
源于RefSeq、UniGene、TIGR Plant TA和TIGR Gene
Indices等数据库。实验设3次重复。基因芯片的检测
包括cDNA的合成, cRNA探针的合成、标记及纯化,
基因芯片的杂交等, 具体操作步骤遵照Agilent基因
表达谱芯片“单标芯片实验操作流程”(中文版)进行。
使用2565CA Agilent Microarray Scanner扫描芯片、
Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies,
Santa Clara, CA, US)软件读取及处理信号值数据,
获得归一化后的信号值、信号检出(P, A, M)以及实验
和对照组的比值 (Chen et al., 2010; Wu et al.,
2011)。将筛选到的宁油10号/FS-M1比值大于2.0的
差异表达基因与NCBI拟南芥(Arabidopsis thaliana)
蛋白数据库进行Blastx比对 , 通过GenMAPP2程序
(http://www.genmapp.org/)进行GO基因功能注释 ,
GO取富集值P<0.01(Chen et al., 2010; Wu et al.,
2011; Yu et al., 2011)。

1.2.3 转录差异基因的实时定量PCR验证
在已注释的差异表达基因中, 选取20个表达改变倍
数分布在各个区间的候选基因, 并依据其芯片上探针
组对应的代表性序列设计特异性引物, 进行实时定量
PCR(qRT-PCR)分析。实时PCR仪器为Roche-Light-
Cyler 480II, 试剂使用SYBR Green Realtime PCR
Master MIX(TOYOBO)试剂盒。每个样品以ACTIN为
内参, 设3次重复(杜士云等, 2010)。
2 结果与讨论
2.1 油菜柱头的总RNA分析
所抽提的油菜柱头总RNA, 经分光光度计检测 ,
A260/A280的吸光度比值介于2.06–2.14之间, 表明其
纯度较高, 没有蛋白质和DNA残留。经1%甲醛变性
琼脂糖凝胶电泳检测后, 18S和28S rRNA电泳条带清
晰, 28S rRNA条带无明显降解, 28S与18S rRNA条带
的亮度比大于1(图1), 说明总RNA完整性好, 结果合
格, 可以进行芯片实验。
2.2 基因芯片的检测结果
基因芯片检测结果表明, 杂交荧光信号强、均一且基
因检出率高(67.08%–75.84%), 重复探针点CV值变
化小(为5.44%–6.68%), 实验体系稳定, 符合质控标
准。按照P<0.05差异显著性标准筛选出宁油10号与
FS-M1样本中差异表达的基因, 宁油10号表达上调
2、5、10倍的探针分别有2 168、924和620条, 表达
下调2、5、10倍的探针分别有2 242、1 050和595条。
差异表达基因的筛选结果表明, 该突变导致油菜柱头
许多表达基因发生了显著改变。图2显示宁油10号与
FS-M1基因表达的信号值范围及对比情况。




图1 FS-M1及宁油10号柱头总RNA的样本电泳图
1–3: FS-M1的RNA; 4–6: 宁油10号RNA

Figure 1 Gel electrophoresis picture of total RNA sample of
FS-M1 and NY10 stigma
1–3: RNA from FS-M1; 4–6: RNA from NY10

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图2 油菜基因表达谱芯片杂交信号散点图
在基因表达谱的散点图上, 每个点表示1个基因探针, X轴和Y
轴分别表示宁油10号与FS-M1柱头的信号强度。散点图中共有
6条斜线, 由上至下分别为–10、–5、–2、2、5和10。在±2平行
线以内的基因表达无明显差异, 以外的基因差异表达。在2和–2
线外有较多的散点, 且分布较为分散, 表明FS-M1柱头突变导
致油菜柱头许多表达基因发生了显著改变。

Figure 2 Scatter plots for hybridization signals by gene-
expression in Brassica napus microarray
In the scatter plots for microarray hybridization, every one of
these points denoted one gene probes. Y-axis and X-axis
denoted the signal strength of FS-M1and NY10, respectively.
There are six slash in the scatter plots, as they descend from
the –10, –5, –2, 2, 5, and 10, which represented signal ration
of FS-M1/NY10. Some genes in ±2 parallel lines showed no
significant differential expression, other genes outside ±2
parallel lines showed significantly differential expression. The
plots outside ±2 parallel lines were rich and scattered which
indicated the altered expression of many genes notably
happened as the stigma mutant.

2.3 qRT-PCR分析
利用qRT-PCR技术, 比较分析了20个候选基因在2份
样品中的表达。qRT-PCR结果符合芯片表达差异趋
势的有18个, 占90%(图3)。所检测候选基因的表达趋
势与芯片杂交中获得的表达整体趋势基本一致, 表明
由基因芯片筛选出的表达基因的信息可靠。
2.4 差异表达基因的功能注释
将宁油10号上调表达探针对应的基因序列与NCBI拟
南芥蛋白数据库进行Blastx比对, 结果发现其中很大
部分差异表达探针很难通过生物信息学的序列相似


图3 FS-M1及其野生型宁油10号柱头表达差异基因qRT-PCR
结果与芯片数据比较
横轴标值1–20分别为EV163217、 EV096602、TC133130、
GR441766、AB270768、CN726381、 EE462557、MYB31、
EV101793、TC113410、BQ705023、EE471402、EE438314、
NAC023、 ES903549、ES913885、EV113659、ES959547、
ES911991和GR456745的基因编号。变化倍数均取以2为底数
的对数。

Figure 3 Comparison of qRT-PCR and genechip for genes
differentially expressed from stigma of NY10/FS-M1
The scale values 1 to 20 for abscissa axis indicated Gene No.
EV163217, EV096602, TC133130, GR441766, AB270768,
CN726381, EE462557, MYB31, EV101793, TC113410,
BQ705023, EE471402, EE438314, NAC023, ES903549,
ES913885, EV113659, ES959547, ES911991 and GR-
456745, respectively. The change-folds are represented by
the 2-based logarithm.


性分析注释其生物学功能。这暗示了上述结果中有大
量的基因需要进一步的研究确定其功能, 其中某些基
因可能是柱头特有的功能基因。可获得功能注释的探
针有209个, 对应198个基因。这些基因按功能可分
为: 水解酶活性、转移酶活性、氧化还原酶活性、转
录因子、四吡咯结合蛋白、氧结合蛋白及电子载体活
性蛋白基因, 其中水解酶活性、转移酶活性、氧化还
原酶活性和转录因子功能基因所占的比例较高, 分别
为28%、23.6%、18.8%和17%(图4), 有26个基因具
有两种或两种以上功能。共发现有22个基因家族, 其
中较大的基因家族包括: 细胞色素P450(cytochrome
P450)基因、GDSL脂肪酶/水解酶(GDSL-motif li-
pase)基因、ABC转运蛋白(ABC transporter)基因、
myb转录因子(myb transcription factor)基因、bHLH
李春宏等: 应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因 249


图4 宁油10号柱头中上调表达基因的功能归类

Figure 4 Functional classification of the up-regulated (over
twice) genes in the NY10 stigma


转录因子(bHLH transcription factor)基因、过氧化物
酶家族(peroxidase)和受体激酶(receptor kinase)基
因等。这些基因家族由3–11个推测基因组成。表1列
出了野生型中32个上调表达10倍以上且获得功能注
释的基因, 对应34个差异表达探针。
2.5 讨论
植物特异组织或细胞的结构与功能依赖于相应的特
异基因及其产物的表达。利用特异组织或细胞同源突
变体材料鉴定特异表达基因及其产物是一种常用的
方法(Zhao et al., 2010; 李春宏等, 2012b)。FS-M1
柱头授粉功能缺陷, 相应的, 其授粉功能的一些表达
基因必然缺失或者下调, 因而为获得甘蓝型油菜柱头
授粉功能相关的一些表达基因, 本实验只关注在野生
型柱头上调表达(即FS-M1柱头下调表达)的基因。
Jiang和Deyholos (2010)利用甘蓝型油菜寡核苷酸芯
片分析了甘蓝型油菜种皮及下胚轴的转录谱, 通过
NCBI数据库中的blastx工具将差异表达基因与拟南
芥蛋白数据库进行比对, 获得了基因的功能注释, 进
一步用qRT-PCR验证了部分基因功能分析的结果。
本研究利用突变体FS-M1及其野生型柱头为材料, 参
照Jiang和Deyholos(2010)所述方法, 获得了许多甘
蓝型油菜柱头特异表达的基因及其授粉功能相关的
重要信息, 部分基因经qRT-PCR分析验证了芯片数
据的可靠性。
柱头表皮细胞(乳突细胞)表面完全被具蜡质的角
质层所覆盖, 角质层只有在角质酶(脂酶)作用下破裂
或降解后花粉粒才能水合和萌发。这些脂酶来源于柱
头表面的蛋白质膜和花粉壁, 移除柱头表面蛋白质膜
或用脂酶抑制剂处理柱头将导致花粉管不能穿过柱
头胞壁(Hiscock et al., 2002)。本研究中野生型柱头
有15个脂酶基因高表达, 主要为GDSL家族脂肪酶基
因, GDSL家族脂肪酶能够水解多种酯类物质。目前,
已克隆和鉴定的这类脂肪酶在调控植物的生长发育、
开花、次生代谢以及防御反应等生理活动中发挥重要
作用。因而推测这些基因可能参与甘蓝型油菜柱头角
质层破裂(或降解)的生物学过程。
活性氧(reactive oxygen species, ROS)是生物
体内有氧代谢产生的一类活性含氧化合物的总称, 主
要包括O2–.、·OH、H2O2和单线态氧(1O2)等, ROS在植
物生长发育、抗病响应和抵御逆境胁迫中发挥重要作
用(Bailey-Serres and Mittler, 2006)。近年来有研究
表明, ROS也是花粉管生长及花粉与柱头互作等植物
生殖过程中的重要信号分子(Hiscock et al., 2007)。
ROS/H2O2在木兰花(Magnolia liliflora)、百合(Lilium
browni)、睡菜(menyantehes trifolia)和牵牛花(Phar-
hiris nil qianniuhua)等被子植物的柱头有很高的积累
(McInnis et al., 2006)。我们的研究结果表明, 野生型
柱头中ROS产生途径的相关基因, 如过氧化物酶、细
胞色素P450、聚胺氧化酶和呼吸爆发氧化酶基因等
有较高的表达, 这与前人的研究结果类似。过氧化物
酶和细胞色素P450等基因在水稻(Oryza sativa)和拟
南芥等植物柱头中亦有较高的表达 (Tung et al.,
2005; Swanson et al., 2005; Li et al., 2007)。这暗示
了ROS是柱头授粉功能中较普遍的信号调控分子。蛋
白质组学研究显示, 在野生型柱头中抗坏血酸过氧
(化)物酶、含CBS域蛋白和醌氧化还原酶等防御过氧
化酶系统的相关蛋白显著上调, 过氧化酶系统可清除
植物体内产生的多余ROS, 减弱氧化伤害(李春宏,
2012b)。因而结合蛋白质组学与转录组学方法可深入
探讨ROS在柱头授粉功能中的作用。
植物类受体蛋白激酶是一类重要的植物蛋白激
酶, 位于细胞膜上, 它作为信号分子的受体, 能够感
受外界刺激, 并参与胞内信号转导过程, 在植物生长
发育过程中起着重要作用。本研究中有9个植物类受
体蛋白激酶的同源基因在野生型植株中表达上调, 其
250 植物学报 49(3) 2014

李春宏等: 应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因 251

中探针号A_46_P076116在野生型柱头中上调2 500
多倍, 在拟南芥蛋白数据库进行Blastx比对时所对应
的基因为植物类受体激酶家族基因(ARK3和AT4G-
21380)。ARK3基因与芸薹属中S位点柱头特异性受
体激酶(SRK)同源, 在芸薹属中SRK由雌蕊S基因编
码, 是自交不亲和反应中的核心因子, 它不仅是雌蕊
的决定因子, 而且在花粉的识别中扮演着重要角色
(张幸果, 2008; 彭一波等, 2011)。Dwyer等(1994)研
究表明, ARK3基因在营养器官与生殖器官中表达,
在植株叶片受到损伤或者病菌感染后, ARK3基因被
显著积累(Pastuglia et al., 2002)。Samuel等(2008)
研究发现ARK3也能与泛素连接酶E3互作。此外, 植
物类受体蛋白激酶还参与植物抗病和病原菌识别、植
物体应答逆境和与防御相关的过程, 而授粉与逆境压
力反应可能具有相同的信号转导途径 (Li et al.,
2007)。
转录因子对高等植物的生长发育及生理代谢调
控均具有十分重要的作用(杨致荣等, 2004), 在野生
型样品中有39个转录因子基因表达上调, 其中, MYB
和bHLH转录因子基因家族都含有4个基因。在植物组
织中, 木质素具有增强细胞壁及黏合纤维的作用(蔺
占兵等, 2003), MYB31转录因子负调控木质素合成
基因的表达, MYB31基因过表达会导致植物细胞木质
素含量明显降低(Fornalé et al., 2006, 2010)。在野生
型柱头中, MYB31上调了140多倍, 推测MYB31的高
量表达使柱头乳突细胞木质素较其它组织表皮细胞
明显降低, 这有利于柱头乳突细胞胞壁的松弛和延
伸, 进而有利于花粉管穿过乳突细胞胞壁向下生长。
综上所述, 本实验利用甘蓝型油菜柱头授粉功能
缺陷突变体FS-M1获得了大量的柱头特异表达上调
基因, 这些特异表达基因中部分基因与前人的研究结
果相一致, 也发现了一些新的推测与柱头授粉功能有
关的基因。本研究中甘蓝型油菜野生型柱头上调表达
的基因水平与前文对应的蛋白之间的直接相关性很
低(李春宏, 2012b), 这也与Jiang等(2007)对酵母、拟
南芥以及一些动物的研究结果相一致(Jiang et al.,
2007)。采用基因转录组与蛋白质组技术相结合的方
法对甘蓝型油菜柱头分子功能进行研究, 可补充单一
技术的不足, 为更加全面揭示甘蓝型油菜柱头授粉应
答分子调控机制奠定了基础, 也为阐明其它十字花科
作物的生殖调控机理提供了重要参考。
252 植物学报 49(3) 2014
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Microarray Analysis of Genes Expressed in Brassica napus Stigma
Chunhong Li, Sanxiong Fu, Cunkou Qi*
Nanjing Sub-center of National Rapeseed Development Center, Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of
Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract Genes expressed in stigma were screened for a pollination-deficient mutant FS-M1 in Brassica napus and its
wild type (NY10) by using B. napus gene microarray. Among the 16 540 genes (43 803 probes) represented on the array,
4 410 showed significant differential expression; the differential expression of selected genes was validated by qRT-PCR.
We identified 198 genes (209 probes) that were significantly upregulated in the wild-type stigma and were markedly en-
riched in function of hydrolase activity, transferase activity, oxidoreductase activity and transcription factors, and some
considerable gene families were involved, including cytochrome P450, GDSL-motif lipase, ABC transporter, myb trans-
cription factor, bHLH transcription factor, peroxidase and receptor kinase, which may be related to development and pol-
lination of B. napus stigma.
Key words Brassica napus, gene expression profiling, gene microarray, qRT-PCR, stigma
Li CH, Fu SX, Qi CK (2014). Microarray analysis of genes expressed in Brassica napus stigma. Chin Bull Bot 49, 246–
253.
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* Author for correspondence. E-mail: qckjaas@gmail.com
(责任编辑: 孙冬花)