全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (2): 230-235, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.02.013
收稿日期: 2008-05-26; 接受日期: 2008-09-17
基金项目: 国家自然科学基金(No.30571003)和海南省自然科学基金(No.80660)
* 通讯作者。E-mail: luoljd@126.com
.技术方法.
植物石蜡制片中透明和脱蜡技术的改良
杨虎彪, 李晓霞, 罗丽娟*
海南大学园艺园林学院, 儋州 571737
摘要 石蜡切片是植物科学研究领域中一项重要的实验技术, 为组织学的发展做出了卓越贡献。制片过程中采用不同试剂和
处理程序对切片质量有较大的影响。该文针对常规石蜡切片方法在操作步骤上存在的繁琐及试剂安全性等问题, 摸索出改进
方法。实验结果表明, 采用histolene(C1O H16)、环保透明剂van-clear、正丁醇(n-butanol)和松节油(oil of turpentine)代替
二甲苯(xylene), 可避免二甲苯的毒性危害; 同时精简了传统石蜡切片的操作程序, 缩短了实验周期并提高了制片质量。
关键词 改良方案, 石蜡切片, 植物组织学
杨虎彪, 李晓霞, 罗丽娟 (2009). 植物石蜡制片中透明和脱蜡技术的改良. 植物学报 44, 230-235.
石蜡切片是组织学研究中的重要实验技术。其基
本步骤包括样品的采集、固定、脱水、透明、浸蜡、
包埋、切片、贴片、烘片、脱蜡、染色和封片等
一系列特殊处理(李正理, 1987)。
石蜡切片技术在植物科学技术研究领域扮演着十分
重要的角色, 并随着化学技术的发展而不断完善。传统
石蜡切片中通常采用二甲苯(xylene)作为透明和脱蜡剂
并取得较好的效果。但据报道二甲苯能够通过呼吸道
和皮肤粘膜进入人体, 损害神经和血液系统, 引起神经衰
弱、植物神经紊乱和皮肤粘膜刺激等症状(颜士勇等,
2002)。近年来, 国外普遍采用环保产品histolene代替
二甲苯(Argall and Armati, 1990; Wills et al., 2000;
Moravski et al., 2003; Sharma and Millam, 2004)。
国内采用histolene(田子强等, 2004; 樊明寿等, 2005;
辛颖等, 2006)和van-clear的做法也偶有报道, 但无详细
的操作程序, 不便于初学者采用。其次, 传统石蜡切片
技术中脱水、包埋、展片、贴片、烘片及染色等步
骤尚存在可简化的空间。针对以上问题本研究通过大
量摸索性实验, 对传统石蜡切片技术的不足之处进行合
理改良, 并将技术流程作详细的介绍, 以便于初学者准确
把握, 以期提高植物石蜡制片的质量、缩短制片周期和
减少有毒物质在实验过程中的扩散。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为禾本科(Gramineae)植物巴哈雀稗(Paspal-
um notatum Flugge)叶片及百合(Lilium brownie O.E.
Br. var viridulum Baker)子房。筛选无病斑、无虫害
且生长状况良好的所需部分作为实验材料。
1.2 样品采集与固定
采集新鲜材料固定于70%乙醇浓度的FAA 混合固定液
(福尔马林:冰醋酸: 70%乙醇=1:1:18)中, 幼嫩材料用
50%乙醇浓度的 FAA固定。真空抽气15-20分钟迅
速杀死细胞, 防止细胞自溶, 保存完整的细胞结构。
1.3 脱水与透明
材料经固定24小时之后用梯度浓度为70%-100%的乙
醇彻底脱水, 经脱水后再分别用 his to le ne、v a n-
clear、正丁醇和二甲苯作透明处理。
1.4 浸蜡与包埋
本研究中选用熔点为52-56°C的石蜡浸蜡, 于55°C下
完成浸蜡过程。浸蜡结束后便立即包埋材料, 将蜡液渗
231杨虎彪等: 植物石蜡制片中透明和脱蜡技术的改良
入包埋盒中并平置于湿毛巾上降温, 待底层蜡液稍有凝
固后迅速将材料移入包埋盒中(使待切面与包埋盒底部垂
直 )。
1.5 切片、展片与脱蜡
本研究中的切片规格均为12 mm。在恒温箱中展片, 用
有机溶剂逐步脱蜡。
1.6 染色与封固
采用番红与固绿复染, 并以封片胶封存。
2 结果与讨论
2.1 样品脱水时间的合理调整
直接采用无水乙醇脱水会导致材料组织硬化, 因此通常
采用梯度浓度法脱水。如因材料表皮角质化或栓化致
使脱水剂的穿透力受阻, 可采用摇床摇动脱水, 增加脱水
剂与材料表面的接触机会, 从而提高脱水效率并缩短脱
水时间, 但应严格控制时间, 不宜过长且起始脱水剂浓度
也不宜过高, 否则组织会过硬变脆。本实验中选择
70%(60分钟)®85%(60分钟)®95%(40分钟)®95%
(40分钟)®100%(40分钟)®100%(40分钟)的乙醇浓度
梯度脱水, 与常规方法相比脱水时间大为缩减。材料坚
硬则应适当延长脱水时间; 材料柔软且含水量高时则应
降低FAA固定液的乙醇浓度, 降低起始脱水乙醇浓度并
相对延长时间。
2.2 透明试剂选择及最佳透明时间
为了使石蜡易于渗入材料的组织中, 必须对脱水后的材
料用有机溶剂进行透明处理。最常用的透明剂是二甲
苯(xylene), 此试剂易挥发、具刺激性气味且毒性较大,
对于长期操作者的健康构成了潜在的危险。考虑到二
甲苯在安全性方面存在隐患, 为此本研究进行了一系列
透明试剂选择的探索性实验, 对透明剂的选择和最佳透
明时间的安排作合理改良, 所用的透明试剂及相应透明
时间见表 1。
针对材料性状差异应对透明时间作适度调整, 幼
嫩材料的透明时间不宜过长, 过长会引起组织脆化甚
至收缩变形。
2.3 最佳浸蜡时间及包埋技术的优化
浸蜡是将包埋剂代替透明剂且渗透入整个组织, 支撑整
个组织并稳定其结构的过程。该步骤至关重要, 往往影
响最终切片质量。冬季宜采用低熔点的石蜡浸蜡, 夏季
宜用高熔点石蜡。本研究中选用熔点为52-56°C的石
蜡浸蜡, 于55°C下完成浸蜡过程。浸蜡温度过高会引
起组织收缩; 过低则石蜡不能完全熔化, 难以均匀地渗
透到组织内部且易混有气泡。浸蜡处理程序见表 2。
石蜡未充分熔融, 包埋时易混有大量气泡且会附着
在材料表面, 切片时易发生断片、掉片或切片呈空洞蜡
带。充分熔融的蜡, 凝固后色泽清亮、质地坚硬且细
腻、结构性良好; 熔融不全则色呈乳白、质地疏松且
粗糙、结构性差。郑兴峰(2003)认为按照常规包埋因
石蜡散热和凝固慢, 会给一些嫩小材料的包埋造成困难,
易使材料经高温收缩变形。针对此问题, 包埋前应事先
备好湿毛巾平置于台面, 包埋时纸盒放于其上, 以物理方
法降低纸盒底层蜡液温度使之快速凝固, 此时再放入材
料可使其稳定性提高。此方法易于掌握, 如有石蜡包埋
表 1 透明试剂及最佳透明时间
Table 1 Optimization of the process of clearing with different clearing reagents
Methods Clearing reagents Pretreatment (45 min) aProcess of clearing
I (40 min) II (40 min) III (40 min)
General method Xylene Xylene/abs ETOH (1:1) mix Xylene Xylene Xylene
Improved method I N-butanol N-butanol N-butanol N-butanol
Improved method II Histolene Histolene/abs ETOH (1:1) mix Histolene Histolene Histolene
Improved method III Van-clear Van-clear Van-clear Van-clear
a 室温下透明. abs ETOH: 无水乙醇; van-clear: 环保透明剂
a Clearing at room temperature. abs ETOH: Absolute alcohol; van-clear: An organic clearing reagent
232 植物学报 44(2) 2009
机, 则包埋的操作过程更加简单易行。
2.4 展片的简化及最佳脱蜡处理
切片成败不仅与切片前的系列处理有关, 而且与切片的
操作也密切相关(路健和王伶, 2001)。切片时用力应均
匀一致, 不宜过重过猛, 否则容易造成切片厚薄不均。
常规贴片是将蜡带放到贴片板上, 在一定的温度下进行
摊片、贴片、展片, 其过程较烦琐, 初学者难以准确
把握。本研究采用改良的方法, 切片前事先准备好盛满
蒸馏水的培养皿, 将切成的蜡带浮于培养皿水面中(注意
亮面朝下), 接着将洗净的载玻片一端浸入培养皿中并将
蜡带轻轻位移到载玻片上整齐排列, 紧接着倾斜放置于
恒温箱中, 33°C下将明水蒸发后调至37°C烘12-24小
时便可进行脱蜡染色。采用此改良方法, 可使蜡带不起
皱、硬度适中且不粘连, 操作简便, 不损伤材料组织。
常规的脱蜡试剂为二甲苯。本研究以二甲苯作对
照, 采用不同脱蜡试剂松节油(o i l o f turpent ine)、
histolene和van-clear进行比较处理。脱蜡试剂及最佳
脱蜡时间见表 3。
二甲苯的脱蜡效果显著, 因此在常规方法中普遍采
用, 但必须在通风橱中操作。松节油、histolene和van-
clear的脱蜡效果也较好, 且安全无毒、操作简易。一
般情况下2遍脱蜡(20分钟)便可获得较好效果。为节省
试剂, 可视情况作重复利用。
2.5 染色程序的简化
常规染色中番红、固绿以水或低浓度乙醇配制, 脱蜡后
进行“复水”方可染色, 增加材料在溶液中的移动次数往
往会发生掉片或破坏表皮细胞。本研究中改用95%的
乙醇来配制番红与固绿染液, 免去“复水”操作, 精简了
染色程序且染色效果良好(图 1)。具体步骤为: 脱蜡结
束后®100%乙醇(3分钟)®95%乙醇(1分钟)®95%乙
醇番红染液(1%浓度, 12小时)®85%乙醇(去浮色)1分
钟®95%乙醇固绿染液(0.5%浓度, 5-10秒)®95%乙
醇(1分钟)®100%乙醇(1分钟)®2步透明(5-10分钟)
®封片®自然风干。
2.6 观察结果与分析
常规方法和改良方法(I、II和III)的处理结果表明: 不同
处理所制切片其结构均趋于完整, 然而叶片表皮细胞、
薄壁细胞和维管束的结构完整性在不同处理间仍存在明
显差异(图 1)。二甲苯透明力强易穿透组织, 因此其透
表 2 常规方法及改良方法(I、II和 III)的浸蜡程序
Table 2 Process of infiltration waxing of general method and improved method (I, II and III)
Methods Clearing reagents Pretreatment aProcess of infiltration waxing
I (3 h) II (3 h) III (3 h)
General method Xylene Xylene/wax (1:1) mix (36°C, 6 h) Wax Wax Wax
Improved method I N-butanol N-butanol/wax (1:1) mix (50°C, 6 h) Wax Wax Wax
Improved method II Histolene Histolene/wax (1:1) mix (36°C, 2 h) Wax Wax Wax
Improved method III Van-clear Van-clear/wax (1:1) mix (38°C, 2 h) Wax Wax Wax
a 55°C下浸蜡; van-clear: 见表 1 a Infiltration waxing at 55°C; van-clear: See Table 1
表 3 脱蜡试剂及最佳脱蜡时间
Table 3 Optimization of the process of dewaxing with different dewaxing reagents
Methods Dewaxing reagents aProcess of dewaxing
　 I (10 min) II (10 min) III (10 min)
General method Xylene Xylene Xylene Xylene
Improved method I Oil of turpentine Oil of turpentine Oil of turpentine Oil of turpentine
Improved method II Histolene Histolene Histolene Histolene
Improved method III Van-clear Van-clear Van-clear Van-clear
a 室温下脱蜡; van-clear: 见表 1 a Dewaxing at room temperature; van-clear: See Table 1
233杨虎彪等: 植物石蜡制片中透明和脱蜡技术的改良
明时间需严格把握, 过长容易引起组织变脆变硬, 导致切
片时部分叶肉细胞破碎而降低切片质量(图1A), 若脱水
不净则后果更为严重, 二甲苯与水混合呈乳白色污浊状,
并直接影响渗蜡。正丁醇用作组织透明剂其操作简
便、不需严格控制时间且效果相对明显, 代替二甲苯用
图 1 巴哈雀稗(Paspalum notatum)叶片横切面 (A-D)和百合(Lilium brownie var viridulum)胚囊纵切面 (E, F)
(A) 二甲苯透明与脱蜡; (B) 正丁醇透明, 松节油脱蜡; (C) Histolene透明与脱蜡; (D) Van-clear透明与脱蜡; (E) Histolene透明与脱蜡,
大孢子母细胞; (F) Histolene透明与脱蜡, 二核期 (Bar=100 mm)
Figure 1 Leaf transverse section of Paspalum notatum (A-D) and embryo sac longitudinal section of Lilium brownie var
viridulum (E, F)
(A) Clearing and dewaxing by xylene; (B) Clearing by n-butanol and dewaxing by oil of turpentine; (C) Clearing and dewaxing by
histolene; (D) Clearing and dewaxing by van-clear; (E) Clearing and dewaxing by histolene, megasporocyte; (F) Clearing and
dewaxing by histolene, binucleate embryo sac stage (Bar=100 mm)
作透明剂的同时便于去除脱水不净的残留水分可以一举
两得。然而正丁醇也有不足之处, 其穿透力较弱需适当
延长透明时间。改良方法 I 采用正丁醇透明、松节油
脱蜡, 脱蜡彻底且无残留物阴影, 由本研究结果可见, 维
管束鞘细胞与外围叶肉细胞组成的“花环结构”(Kranz
234 植物学报 44(2) 2009
anatomy)清晰可辨, 但透明程度有所欠缺, 部分细胞呈
云雾状阴影, 导致切片整体质量相对降低(图1B)。建议
根据实验材料的大小、柔软度和含水量等指标对透明
时间作相应调整, 适当延长正丁醇透明时间不会引起组
织硬化。对长叶雀稗(Paspalum longifolium)、宽叶雀
稗( Pa spa lum we tts te in i i )和两耳草( Pa sp al um
conjugatum)等20多种禾草材料进行石蜡切片, 结果表
明histolene和van-clear是优良的组织透明和脱蜡试剂,
操作简便。然而 histolene和 van-clear在组织透明性
能方面仍有区别, 前者处理的材料切片其叶肉细胞及表
皮细胞轮廓较后者更清晰, 维管束鞘细胞与外围叶肉细
胞间的层次对比较后者更鲜明 (图 1 C , D )。并且
histolene的脱蜡性能更优越, 脱蜡10分钟即可收到明
显效果。
本研究在常规制片的基础上, 克服了常规操作中的
不足, 通过改进脱水、透明、包埋和展片等操作程序,
优化了植物石蜡制片的技术流程, 缩短了制片周期。尤
其是对透明和脱蜡试剂的调整, 有效减少了有毒物质对
操作人员的危害, 提高了实验的安全性, 提供了便捷安全
的实验方法。改良后的操作流程简易, 便于初学者短期
内熟练应用。综合分析, 笔者认为改良方法 I较易掌
握、药品易得且价格低廉, 但其切片质量稍差于改良方
法II和III; 改良方法II的效果稳定且可靠性强, 在石蜡切
片中更易获得清晰的细胞和组织结构, 只是试剂价格略
高于方法 I和III; 改良方法III操作简单、试剂价格适中,
仅透明与脱蜡效果略差于改良方法II。由此可见, 以上
3种方法在综合性能上存有差异, 研究者根据材料性质作
适度调整后均能满足石蜡切片的要求。本研究将以上
改良方法II用于百合(Lilium brownie var viridulum)胚珠
和花药的微形态观察中, 同样取得良好的观察和定位结
果(图 1E, F)。
一直以来, 石蜡切片技术都被认为是组织学研究中
的重要实验方法。尽管随着新设备的出现不断涌现出
一些新的切片方法, 但这些方法仍然是以经典的石蜡切
片技术为基础, 由此可见石蜡切片技术在组织学研究中
具有重要地位, 现代植物分子生物学研究中仍需石蜡切
片技术支持。然而石蜡切片技术本身存在局限性, 如实
验时间相对较长, 影响实验成败的因素较多等。针对这
些问题众多实验工作者在改良传统石蜡切片技术方面做
了大量的工作, 然而他们的研究主要集中在动物组织学
上(路健和王伶, 2001; 郑兴峰, 2003; 郭丽荣, 2004), 对
植物组织的针对性不强, 植物组织学研究中通常只能借
鉴他们的方法而不能直接运用。杨捷频(2006)的改良方
案中也提到了二甲苯毒性危害的问题, 但仅强调在操作
上避免, 并没有从根本上解决这一问题。本研究提出的
透明和脱蜡技术的改良方法为植物组织切片技术的创新
与改良提供了可靠的资料。
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235杨虎彪等: 植物石蜡制片中透明和脱蜡技术的改良
An Improved Clearing and De-waxing Method for Plant
Paraffin Sectioning
Hubiao Yang, Xiaoxia Li, Lijuan Luo*
College of Horticulture and Garden Architecture, Hainan University, Danzhou 571737, China
Abstract Paraffin sectioning plays an important role in plant science research. It is used widely in histology to observe and
explain microstructure and provides a credible method for development of plant histology. This study aimed to investigate the
limitations in traditional paraffin sectioning, such as the complex and time-consuming traditional protocol for improved measure.
Xylene, a kind of neurotoxicant, is often used as a dewaxing and clearing chemical in the materials-preparation process. We
substituted histolene (C1OH16), van-clear, oil of turpentine and n-butanol for xylene, to avoid a toxic effect. We improved the method
to simplify the process of paraffin sectioning, shorten the cycle of the experiment and obtain quality slides.
Key words improved protocol, paraffin sectioning, plant histology
Yang HB, Li XX, Luo LJ (2009). An improved clearing and de-waxing method for plant paraffin sectioning. Chin Bull Bot 44, 230-235.
* Author for correspondence. E-mail: luoljd@126.com
(责任编辑: 刘慧君)