全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (4): 427–436, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00427
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收稿日期: 2011-10-28; 接受日期: 2012-03-15
基金项目 : 国家自然科学基金(No.31071800)、浙江省自然科学基金(No.LQ12C150020)和浙江省公益技术研究农业项目(No.2011-
C22007)
* 通讯作者。E-mail: hzyyj@yahoo.com.cn
植物实时荧光定量PCR内参基因的特点及选择
袁伟1, 2, 万红建1, 杨悦俭1*
1浙江省农业科学院蔬菜研究所, 杭州 310021; 2南京农业大学园艺学院, 南京 210095
摘要 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有灵敏度高、特异性强、重复的动态定量范围和高通量等优点, 是进行植物基因表
达和转录分析最常用的技术手段之一。选择合适的内参基因是正确运用实时荧光定量PCR分析目标基因表达变化的前提。
近年来, 大量研究表明, 内参基因的选择应取决于研究者的实验条件; 随着实验条件的变化, 内参基因的选择也随之变化。
因此, 实时荧光定量PCR结果分析的准确性在很大程度上依赖于所选择的内参基因是否适合。该文从内参基因的选择、常
用内参基因的特点、新内参基因的挖掘、应用内参基因组合的优点和内参基因的稳定性评价等几方面进行综述, 以期为研
究者在实验中选择合适的内参基因提供参考和理论依据。
关键词 基因表达分析, 基因表达的稳定性, qRT-PCR, 内参基因
袁伟, 万红建, 杨悦俭 (2012). 植物实时荧光定量PCR内参基因的特点及选择. 植物学报 47, 427–436.
随着基因组技术的发展越来越迅速, 其为进一步
阐明复杂的生物学过程、代谢途径及植物与病原菌的
互作机制等提供了强大的动力(Mascia et al., 2010)。
实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantita-
tive PCR, qRT-PCR)具有灵敏度高、特异性强、重复
性好及高通量等特点(Huggett et al., 2005), 已经成
为植物科学领域中进行基因组研究的常用技术之一。
利用该技术可进行基因表达和转录组分析等(Gac-
hon et al., 2004)。然而, 在其分析过程中, RNA的质
量和产量、反转录效率的差异以及其它阻碍因素等都
会对目的基因表达分析结果的准确性产生影响
(Pfaffl, 2006)。因此需要选择合适的内参基因进行校
正和标准化 , 从而减小检测样本之间的差异(Qua-
ckenbush, 2002; Nolan et al., 2006)。理想的内参基
因应该在所有的细胞中和生理状态下都能较稳定地
表达, 可以完全用于不同类型的样品。但是随着实验
条件的变化, 没有任何一种内参基因的表达是始终稳
定的, 即在一种实验条件下合适的内参基因并不一定
适用于另一种实验条件(Volkov et al., 2003); 或者不
同植物间的内参基因也可能是不同的。因此在具体实
验条件下选择表达稳定的内参基因至关重要。由于常
用的内参基因是作为构成细胞器骨架的基本组分
(ACT、TUA、TUB等)或参与生物体的基本生化代谢
过程(GAPDH、EF-1α、UBQ等)(Huggett et al., 2005;
Gutierrez et al., 2008), 使得其在某些组织器官中基
本可以稳定地表达(胡瑞波等, 2009)。但是qRT-PCR
是对基因表达的准确定量分析, 而近年来的研究发现,
这些常用内参基因均存在缺陷, 在不同类型的细胞和
组织中、细胞和器官发育的不同阶段以及各种实验条
件等情况下, 它们的表达水平通常变异较大(Hu et al.,
2009; Die et al., 2010), 已经不能满足定量分析对内
参基因的要求。因此, 新内参基因的挖掘已然成为重
中之重。目前, 基于基因芯片的表达数据和EST数据库
逐渐成为筛选新内参基因的主要渠道。
鉴于内参基因在植物基因组研究特别是qRT-
PCR分析中的重要性, 本文从内参基因的选择、常用
内参基因的特点、新内参基因的挖掘、应用内参基因
组合的优越性和评价内参基因稳定性的方法等几方
面进行分析, 以期为针对不同植物在某种实验条件下
选择合适的内参基因提供理论依据。
1 植物中内参基因的选择
1.1 内参基因的选择标准
qRT-PCR是目前在mRNA水平上探测基因表达最有
·专题论坛·
428 植物学报 47(4) 2012
效、精确的方法, 常用于相对定量分析生物体内生理
和病理过程中mRNA的变化(Wong and Medrano,
2005)。由于PCR过程中存在各种各样的差异, 对结
果的校正和标准化仍是当前面临的最具挑战性的问
题(Guénin et al., 2009)。而内参基因的使用被认为是
最适当的标准化方法(Huggett et al., 2005), 因为其
能够有效地校正RNA起始量和反转录效率等的差异
(Udvardi et al., 2008), 从而获得反映目标基因特异
性表达的真正差异。理想的内参基因应满足以下条件:
(1) 在不同类型的细胞和组织中及不同的生长发育阶
段都稳定表达(Quackenbush, 2002); (2) 表达不受
环境、生物或非生物胁迫等内源性和外源性因素的影
响(Thellin et al., 1999); (3) 不存在假基因(pseudo
gene), 以避免基因组DNA的扩增; (4) 其稳定表达量
与目的基因的表达量近似(Dheda et al., 2004)。但是
目前尚未发现这样理想化的内参基因, 因为没有任何
一种内参基因在不同的植物组织、器官中或不同的实
验条件下都恒定表达(Die et al., 2010)。而且, 选择不
适当的内参基因往往会导致错误结论(Dheda et al.,
2005)。因此选择合适的内参基因已成为应用qRT-
PCR进行基因组功能分析的重要前提。
1.2 内参基因的选择不存在通用性
在植物内参基因研究中, 没有任何一种内参基因在不
同的实验条件下表达是恒定的。首先, 不同物种间的
同源内参基因表达存在差异, 即在某种植物中表达稳
定性高的内参基因在另一种植物中不一定会有较好
的表达稳定性, 即不存在通用性。例如在葡萄(Vitis
amurensis)浆果中表达稳定性较好的GAPDH在小麦
(Triticum aestivum)中的表达稳定性则最差(Reid et
al., 2006; Long et al., 2010); 而在小麦中表达稳定
性较好的ACT和UBI在番茄(Solanum lycopersicum)
中的表达稳定性最差(Long et al., 2010; Mascia et
al., 2010)。此外, 同一内参基因家族内的各成员表达
稳定性也存在差异, 并不能因为基因家族中的某一个
成员表达稳定性好, 适合作内参基因, 就推论出该基
因家族其它成员的表达也相对稳定, 即这种情况也不
存在通用性。肌动蛋白基因家族作为细胞骨架结构蛋
白被广泛用作内参基因, 主要包括ACT2/7、ACT8、
ACT11等。Hu等(2009)在对大豆(Glycine max)内参
基因的研究中发现, ACT11的表达稳定性明显高于
ACT2/7。Tubulin基因家族同样作为细胞骨架结构蛋
白被用作内参基因, 在对大豆(Hu et al., 2009)和桃
(Amygdalus persica)(Tong et al., 2009)的研究中发
现, TUA的表达稳定性也普遍高于TUB。泛素基因家
族在细胞的蛋白质降解中发挥重要作用并被广泛用
作内参基因, 主要包括多聚泛素(polyubiquitin)和泛
素延伸蛋白(ubiquitin extension protein)2类(胡瑞波
等, 2009)。Gutierrez等(2008)分析了拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana)中内参基因的表达 , 发现ubiquitin
extension protein(UBQ5)的表达稳定性明显高于同
一家族的polyubiquitin(UBQ4、UBQ10、UBQ11)。
2 常用内参基因的特点
2.1 常用内参基因的表达稳定性
在植物的qRT-PCR分析中, 内参基因常常是看家基
因, 常用的内参基因主要包括肌动蛋白基因(ACT)、
18S核糖体RNA(18S rRNA)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基
因(GAPDH)、转录延伸因子基因(EF-1α)、多聚泛素
酶基因(UBQ)、α微管和β微管蛋白基因(TUA、TUB)
以及亲环蛋白基因 (CYP)等 (表 1)(Dheda et al.,
2004)。在众多的内参基因中, 根据其在实验体系内
的表达稳定性选择适当的内参基因是进行标准化的
关键, 因此越来越多的研究者对植物内参基因的稳定
性进行评价与鉴定。目前, 在豌豆(Pisum sativum)
(Die et al., 2010)、水稻(Oryza sativa)(Jain, 2009)、
白杨(Populus tomentosa)(Brunner et al., 2004)、甘
蔗(Saccharum sinensis)(Iskandar et al., 2004)、拟
南芥(Remans et al., 2008)、马铃薯(Solanum tubero-
sum)(Nicot et al., 2005)、棉花(Gossypium hirsu-
tum)(Tu et al., 2007)、大豆(Jian et al., 2008; Hu et
al., 2009)、番茄(Mascia et al., 2010)、草类(Hong et
al., 2008)、咖啡(Coffea arabica)(Cruz et al., 2009)、
小麦(Paolacci et al., 2009)、葡萄(Reid et al., 2006)、
桃(Tong et al., 2009)和茶树(Camellia sinensis)(孙
美莲等, 2010)等植物中都鉴定出了在各自不同的实
验条件下表达最稳定的内参基因。
选择正确的内参基因很大程度上取决于所研究
的组织、细胞及实验条件等。例如不同的组织器官、
生长发育阶段、生物或非生物胁迫和激素影响等都会
引起内参基因的特异性表达。因此, 每一特定条件下
袁伟等: 植物实时荧光定量 PCR内参基因的特点及选择 429
表1 常用的植物内参基因及其功能
Table 1 Common reference genes of plants and their function
简称 中文全称 英文全称 功能 适用植物物种及参考文献
ACT 肌动蛋白 Actin 细胞骨架结构蛋白 葡萄(Reid et al., 2006)
18S
rRNA
18S核糖体
RNA
18S ribosomal RNA 胞质核糖体小亚基, 翻译 水稻(Kim et al., 2003)
GAPDH 3-磷酸甘油醛
脱氢酶
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
糖酵解、糖异生及光合作用碳固
定循环过程中的关键酶
大麦(Faccioli et al., 2007)
EF-1α 转录延伸因子 Elongation factor 1-α 转录延伸 马铃薯(Nicot et al., 2005)
UBQ 多聚泛素酶 Polyubiquitin 蛋白质修饰、结合、降解 棉花(涂礼莉等, 2007)
TUA α微管蛋白 α-tubulin 细胞骨架结构蛋白 番茄(Coker and Davis, 2003)
TUB β微管蛋白 β-tubulin 细胞生长, 参与光刺激反应 杨树(Brunner et al., 2004)
CYP 亲环蛋白 Cyclophilin (peptidyl-prolyl
cis-trans isomerase)
调节肽基脯氨酸顺反异构酶活性 大豆(Jian et al., 2008)


都有特定的稳定表达的内参基因, 内参基因的选择是
否合适需要在不同的实验系统中进行评价与鉴定。
Iskandar等(2004)分析了4个内参基因(ACT、TUB、
GAPDH、25S rRNA)在甘蔗不同组织、器官和不同
品种中的表达稳定性, 结果表明, 25S rRNA的表达水
平在所有样品间差异较小 , 而在不同组织器官中
GAPDH的表达稳定性最好。Jian等(2008)分析了10
个大豆内参基因(ACT2/7、ACT11、TUA、TUB、EF1α、
UBC2、ELF1b、CYP2、G6PD、UBQ10)在21个不
同发育时期和组织器官等样本中的表达稳定性, 结果
表明, ELF1b和CYP2在所有样品中表达都相对最为
稳定, 而ACT2/7和TUA仅在不同发育时期的样品中
表达稳定性最好。Mascia等(2010)分析了番茄的8个
内参基因(ACT、CYP、EF-1α、GAPDH、TUB、UBI、
GAPDH、18S rRNA)在5种不同植物病毒侵染条件下
的表达稳定性, 结果表明, UBI和GAPDH在所有样品
中表达都相对稳定, 而ACT在侵染样品中表达稳定性
最好。Hong等(2008)分析了9个短柄草(Brachypo-
dium distachyon)内参基因(ACT7、RCA、EF1α、
GAPDH、SamDC、TUA6、UBC18、UBi4、UBi10)
在21个不同发育时期和组织器官中逆境胁迫(干旱、
盐、冷、热)和激素条件下的表达稳定性, 结果表明,
UBC18在所有样品中表达稳定性最好, UBi4和UBi10
在不同组织器官和激素处理的样品中表达最为稳定,
而在逆境胁迫条件下的样品中SamDC的表达稳定性
最好。
综上所述, 在不同的实验条件下, 内参基因的表
达存在变化; 然而在各自不同的条件下又都有特定的
相对稳定表达的内参基因。因此, 根据具体的样品类
型选择适当的内参基因进行标准化是qRT-PCR分析
中至关重要的一步。
2.2 常用内参基因的缺陷
长期以来, 人们之所以选择常用内参基因首先是因为
它们具有以下功能: (1) 生物体维持生命活动所必需
的细胞器骨架的基本组分(ACT、TUA、TUB等); (2)
参与生物体的基本生化代谢过程(GAPDH、EF-1α、
UBQ等)(具体见表1)。正因为这些特点使得其在某些
组织器官中通常可以稳定地表达。其次是因为在以往
的基因表达分析中, 研究者主要采用Northern杂交、
组织化学染色或RT-PCR等技术, 而这类分析基本上
是定性分析或相对定量分析, 由于内参基因表达丰度
高, 目标基因表达的上调或下调能够明显地表现出来
(胡瑞波等, 2009)。但是qRT-PCR是对基因表达的准
确定量分析, 灵敏度较高, 而且有些常用内参基因的
表达在不同实验条件下变异较大(Hu et al., 2009; Die
et al., 2010), 已经不能满足定量分析对内参基因的
要求。最后, 研究者们由于惯性和依赖性一直沿用常
用内参基因来进行标准化, 而忽略了其在不同实验条
件下的表达是否存在差异。最近, 一些研究结果已经
表明, 常用内参基因在某些条件下由于表达不稳定而
不适合作为内参基因, 它们已逐渐被新的内参基因所
取代。Die等(2010)分析了豌豆的8个常用内参基因和
3个新候选内参基因在26个不同组织和不同基因型的
豌豆样品中的表达稳定性, 结果表明, 18S rRNA作为
最常用的内参基因表达却最不稳定, 差异最大; 而
430 植物学报 47(4) 2012
GH720838(transcription factor IIA) 和 GH720808
(histone H3)作为新基因则显示出了较好的表达稳定
性。Hu等(2009)分析了大豆7个常用内参基因和7个新
候选基因在116个样品(不同的组织器官、生长发育阶
段、光周期处理和栽培种)中的表达稳定性, 新基因中
的SKIP16、UKN1和UKN2超越常用的内参基因成为
表达最稳定的基因, 而常用内参基因UBQ10则表达
稳定性最差, 不适合作为内参基因。
3 新内参基因的挖掘
常用内参基因由于表达稳定性差已逐渐被新的内参
基因所取代。因此, 新内参基因的挖掘已经成为重中
之重。目前, 基于基因芯片的表达数据和EST数据库
逐渐成为筛选新内参基因的主要渠道。图1显示了通
过这2种方法结合qRT-PCR分析筛选新的内参基因,
并对其稳定性进行评价与鉴定的主要流程。
3.1 基于基因芯片的筛选
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray), 随着
基因芯片技术越来越成熟, 大量的基因芯片数据为新
内参基因的挖掘提供了良好的数据基础和平台。
Czechowski等(2005)利用Affymetrix ATH1全基因组
基因芯片数据, 对模式植物拟南芥的内参基因进行评
价和鉴定, 发现了数以百计的新基因, 其表达稳定性
均优于常用内参基因, 筛选出在不同发育时期、逆境
(盐分、干旱、冷害)和生物胁迫、激素影响、营养(硫
素、碳源、磷)缺乏以及不同光照条件下都稳定表达
的22个基因, 并将其与5个常用内参基因(ACT2、
TUB6、EF-1α、UBQ10、GAPDH)在不同的实验条



图1 qRT-PCR内参基因稳定性的鉴定

Figure 1 Identification of reference genes for qRT-PCR normalization

袁伟等: 植物实时荧光定量 PCR内参基因的特点及选择 431
件下进行比较。结果表明新基因的表达稳定性普遍优
于常用内参基因 , 例如At1g13320(PP2A)在不同的
样品中均显示出较高的表达稳定性, 而在以往研究中
常用的内参基因ACT2则表现出较差的表达稳定性,
不适合用作内参基因。Long等 (2010)从小麦Affy-
metrix基因芯片中选出32个基因作为候选内参基因,
在不同的组织器官、生长发育阶段以及不同的实验条
件下通过qRT-PCR技术进行分析, 筛选出表达稳定
性较高的15个新基因, 并将其与13个常用内参基因
相比较。结果表明, 在所有样品中7个新基因的表达
稳定性优于常用内参基因, 可以作为新的内参基因;
而在常用内参基因中只有EF-1α表现出较高的表达稳
定性, 18S rRNA、TUA、ACT和GAPDH的表达稳定
性均较差, 不适合作为内参基因。
基于基因芯片技术筛选新的内参基因将为新基
因的挖掘提供良好的数据基础, 也为内参基因的选择
提供了更广阔的空间。但是近年来使用基因芯片数据
筛选新基因的研究较少, 且研究成果并没有引起足够
的重视, 许多研究者仍然沿用常用基因作为内参, 这
成为目前基因表达分析研究的一个弊端。
3.2 基于EST数据库的筛选
表达序列标签(expression sequence tag, EST)数据
库作为一种重要的基因组数据库, 已成为新基因发
现、基因及重组蛋白表达等研究中一种有力的分子生
物学工具。Coker和Davis(2003)利用番茄EST数据库
选择了127个基因, 在不同的组织器官样品中进行分
析, 筛选出5个表达稳定性最好的基因(Dan-J蛋白基
因、翻译控制肿瘤蛋白(TPCP)基因、TUA、CYP
和GAPDH), 适合作为该实验条件下的内参基因。
Faccioli等(2007)对大麦(Hordeum vulgare)EST数据
库中的序列进行分类, 从中寻找在特定cDNA文库中
出现频率高的EST序列, 从而筛选出表达稳定性较好
的候选基因, 并通过qRT-PCR分析得到5个表达稳定
性较高、适合用作标准化的内参基因(S2腺苷蛋氨酸
脱羧酶基因、GAPDH、热激蛋白hsp90基因、翻译控
制肿瘤蛋白基因TPCP和一个未知功能基因TC-
139056)。
植物学领域中应用EST数据库筛选新内参基因
的研究相对较少, 可能是由于目标范围较广, 筛选出
的新基因数量较少以及新基因在不同实验条件下表
达水平差异较大等造成的。因此, 仍需寻找更精确有
效的方法, 挖掘新的内参基因以代替不适合的常用内
参基因, 这还有待于进一步研究。
3.3 新内参基因的表达稳定性评价
基于基因芯片技术和EST数据库筛选可以获得新的
内参基因, 但是这些新内参基因的表达稳定性尚不确
定, 必须用qRT-PCR等方法进行评价, 并与传统内
参基因的表达稳定性进行比较。Libault等(2008)通过
分析已发表的大豆基因芯片数据, 发现了多达200个
表达稳定性较好的基因, 并对其中18个基因在不同
发育时期、组织器官、逆境胁迫(创伤、激素、锈病)
下的130个样本进行了qRT-PCR分析, 结果表明多数
基因的表达稳定性优于传统内参基因ACT, 其中肽酶
S16基因和呼吸爆发氧化酶基因的稳定性最差, 最后
筛选出了4个新的内参基因, 分别为ABC转运因子基
因、F-box家族基因、金属蛋白酶基因和CDPK蛋白
激酶基因。说明通过基因芯片数据筛选到的候选基因
必须经过qRT-PCR分析验证, 并与常用内参基因的
表达稳定性相比较, 才能确定新的内参基因究竟能不
能应用于qRT-PCR结果的校正和标准化。表2列出了
目前已开发的一些新的内参基因。qRT-PCR分析证
明, 在相应的样品类型中它们的表达稳定性均优于传
统的内参基因。
4 应用内参基因组合的优越性
在qRT-PCR分析中, 内参基因的使用被认为是最适
当的标准化方法(Nolan et al., 2006), 使用不理想的
内参基因会对数据的分析造成偏差(Dheda et al.,
2005)。但是使用单一的内参基因进行校准和标准化,
也会对结果的精确性产生影响(Zhu et al., 2008)。
Schmid等(2003)认为在一组给定的样本或实验条件
下, 平行测定2个或2个以上内参基因有助于校正系
统偏差。为了消除使用单一内参基因所引起的偏差和
波动, Vandesompele等(2002)建议在标准化过程中
使用至少3个内参基因进行校正。Hu等(2009)对大豆
内参基因在不同实验条件下的稳定性进行分析, 结果
表明: 在不同组织器官中, 内参基因组合(ACT11、
UKN1、UKN2)是最适当的; 在不同生长发育阶段, 内
参基因组合(SKIP16、TUA5、MTP)为最优组合。同
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表2 植物新内参基因的评价
Table 2 Evaluation of new reference genes in plants
植物物种 样品类型 新内参基因 参考文献
发育时期, 组织器官, 营养缺乏(硫、磷、碳
源), 非生物胁迫(激素、冷害、甘露醇、盐)
SAND(At2G28390)
TIP41(At4G34270)
未知功能基因(At4G26410)
Czechowski et al., 2005 拟南芥
逆境胁迫(铜、镉) F-box(At5G15710)
SAND(At2G28390)
YLS8(At5G08290)
Remans et al., 2008
大麦 组织器官, 高温胁迫 S2腺苷蛋氨酸脱羧酶基因
热激蛋白hsp90基因
未知功能基因(TC139056)
Faccioli et al., 2007
番茄 发育时期, 组织器官 TIP41(At4G34270)
SAND(At2G28390)
SGN-U346908
Expósito-Rodríguez et al., 2008
大豆 发育时期, 组织器官, 逆境胁迫(创伤、激素、
锈病)
ABC转运因子基因
F-box家族基因
金属蛋白酶基因
CDPK蛋白激酶基因
Libault et al., 2008
杨树 形成层 TIP41(At4G34270) Gutierrez et al., 2008
葡萄 发育时期 SAND(At2G28390) Lossos et al., 2003


样, 在葡萄(Reid et al., 2006)、马铃薯(Nicot et al.,
2005)和白杨(Brunner et al., 2004)中的研究结果也
证实, 使用内参基因组合有助于获得更准确的表达分
析结果。但是在使用不同的内参基因组合时, 有几点
需要注意的基本要求: (1) 内参基因组合中的基因在
同一实验条件下其表达丰度应当相近; (2) 应选择退
火温度一致的内参基因进行组合; (3) 选择同源基因
组合, 在设计引物时应考虑到引物之间的二聚体和发
夹结构。总之, 选择不同的内参基因组合, 就必须控
制组合内部内参基因的表达差异和扩增的准确性等,
这样才能更好地进行校正和标准化。
5 评价内参基因稳定性的方法
5.1 扩增效率的评价及其软件
在对内参基因的表达稳定性进行评价之前, 必须先通
过qRT-PCR来分析内参基因的扩增效率(E)。目前,
主要有2种软件可用于扩增效率的评价。第1种是比利
时Biogazelle公司的qBase软件。由于这款软件属于
商业化软件, 应用的范围小, 因此在评价扩增效率时
大多数人会采用第2种方法——Excel软件的标准曲线
法。具体程序是首先运用Excel表格根据qRT-PCR的
结果(Ct值)计算内参基因的相关系数(R2), 然后根据
公式lg(1+E)=R2得出扩增效率的值。目前认为只有扩
增效率在一定的范围内(90%–105%)时, 才符合进行
下一步评价的要求。
5.2 评价内参基因稳定性的方法
在qRT-PCR分析过程中, 评价作为校准和标准化的
内参基因有多种分析方法, 包括2种简单数据分析(稳
定指数分析、ΔCt值分析)和3种基于统计学的软件分
析方法(GeNorm、NormFinder、BestKeeper)。其中
后者为研究者所常用。
稳定指数分析是一种基于单因素方差分析和线
性回归分析的统计学方法, 与植物育种学家评价不同
植物品种产量的相对稳定值的方法类似。通过
MSE(均方误差)、MEAN-Ct(qRT-PCR过程中循环数
的平均值)、CV(变异系数)和Slope(线性回归方程的斜
率)等数值推算出稳定指数。稳定指数越低, 内参基因
的表达越稳定。在鉴定植物内参基因的表达稳定性方
面, Brunner等(2004)首次使用该分析方法对杨树内
参基因进行评价和筛选, 其中UBQ的稳定指数最低,
表明其表达稳定性最高。ΔCt值分析是通过比较2个内
参基因之间的ΔCt(qRT-PCR过程中循环数)值来筛选
袁伟等: 植物实时荧光定量 PCR内参基因的特点及选择 433
表达最稳定的内参基因的分析方法。如果在所有的样
品中2个内参基因之间的ΔCt值没有差异, 就表明这2
个基因均稳定表达; 反之则表明至少有1个基因表达
不稳定, 需要引入第3个或更多的内参基因来进行两
两比较, 直至筛选出ΔCt值最小的一对基因继而筛选
出表达最稳定的基因。Silver等(2006)在评价人网织
红细胞中内参基因的实验中首次提出这种方法, 分析
结果表明GAPDH为表达最稳定的基因。
GeNorm程序是Vandesompele等(2002)开发的
专门用于分析内参基因稳定性的程序。通过计算内参
基因表达稳定性的M值进而分析内参基因在不同样
品中的表达稳定性, M值越大稳定性越差; 反之, 稳
定性越好。还可以对标准化因子(normalization fac-
tor)的配对变异(pairwise variation)V值进行分析, 以
确定所需内参基因的最适数目。将Vn/Vn+1比值与默
认的V值(0.15)进行比较, 如果Vn/Vn+1大于0.15, 则
有必要引入第n+1个基因; 反之, 则不必引入新的内
参基因。GeNorm程序可以用于确定不同实验条件下
最适内参基因的数量, 并选择出最优组合, 而不是通
常地使用单一内参基因。这将有利于校正系统偏差,
从而获得更可靠的表达分析结果, 对于研究基因表达
的细微变化具有极其重要的意义。NormFinder程序是
Andersen等(2004)编写的用于选择合适内参基因的
程序, 其基于方差分析评价内参基因在不同样品中的
表达稳定性。NormFinder的运行原理与GeNorm程序
类似, 也是通过计算基因表达稳定值, 然后根据稳定
值的大小排序, 值越大稳定性越差; 反之, 稳定性越
好。但是不足的是, 它只能选择1个最合适的内参基因。
而GeNorm程序则能够选出合适的内参基因组合及最
适基因数量。BestKeeper程序是Pfaffl等(2004)开发的
用于分析基因表达稳定性及基因表达水平的程序, 可
以对内参基因和目标基因进行单独分析。BestKeeper
程序主要通过比较Ct值的标准偏差和变异系数来选择
表达最稳定的基因, 标准偏差和变异系数越小, 稳
定性越好; 反之, 稳定性越差。其不同于GeNorm和
NormFinder的优点是不但可以分析内参基因表达的稳
定性, 而且可以比较目标基因的表达水平。
6 小结
总之, 目前还没有一种理想的内参基因可以完全用于
不同类型的样品, 且其表达恒定不变。内参基因一般
都表现为在某些实验条件下表达较稳定, 但在其它实
验系统中则是变化的。所以研究目标基因的表达情况
时, 研究者需要结合各自的实验条件和样品类型, 根
据物种、基因家族等的不同, 选择合适而稳定的内参
基因进行校正和标准化, 才能有助于得到可靠的实验
结果。
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436 植物学报 47(4) 2012
Characterization and Selection of Reference Genes for Real-time
Quantitative RT-PCR of Plants
Wei Yuan1, 2, Hongjian Wan1, Yuejian Yang1*
1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
2College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) is one of the most common technologies used for gene expression
and transcriptome analysis, with its high sensitivity, specificity, good reproducibility, wide dynamic quantification range
and high-throughput capacity. Selecting the appropriate reference genes is the first step in analyzing the expression of
genes of interest. Selecting appropriate reference genes depends on experimental conditions, and selection of reference
genes changes after the experimental conditions. Therefore, the accuracy of results from qRT-PCR analysis largely de-
pends on the reference genes used. In this paper, we give a comprehensive summary of reference genes for qRT-PCR,
including their selection, characteristics of traditional reference genes, mining new reference genes, the advantage of
combining different reference genes, and how to assess stable reference gene expression. The results provide a theo-
retical foundation for selecting appropriate reference genes for qRT-PCR of plants.
Key words gene expression evaluation, gene expression stability, qRT-PCR, reference genes
Yuan W, Wan HJ, Yang YJ (2012). Characterization and selection of reference genes for real-time quantitative RT-PCR
of plants. Chin Bull Bot 47, 427–436.
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* Author for correspondence. E-mail: hzyyj@yahoo.com.cn
(责任编辑: 刘慧君)