全 文 ：第 34 卷 第 2 期
2012 年 3 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol． 34，No． 2
Mar．，2012
收稿日期:2011--05--10
基金项目:“863”国家高技术研究发展计划项目(2007AA021403)、林业公益性行业科研专项(200904050)。
第一作者:黄河，博士生。主要研究方向:花卉分子生物学。电话:010--82380429 Email:101navy@ 163． com 地址:100083 北京市清华东
路 35 号北京林业大学园林学院。
责任作者:戴思兰，教授，博士生导师。主要研究方向:园林植物分子育种。电话:010--82376017 Email:silandai@ sina． com 地址:同上。
本刊网址:http:∥ journal． bjfu． edu． cn
甘菊内参基因 ClTUA的克隆与表达分析
黄 河 牛雅静 杨 可 戴思兰
(北京林业大学园林学院)
摘要:根据前期工作已获得的甘菊 α-tubulin 基因 EST 序列，使用 RACE 技术获得了该基因的全长序列，命名为
ClTUA。生物信息学分析表明，ClTUA 基因全长 cDNA 序列为 1 580 bp，编码 432 个氨基酸残基。利用 MEGA4. 0 软
件对推测的氨基酸序列进行系统关系分析发现，其为植物中Ⅰ类 α-tubulin 基因。RT-PCR 分析发现:ClTUA 基因不
仅在盐、干旱、冷、热、脱落酸和水杨酸各种非生物胁迫下稳定表达，而且在不同生长发育阶段的样本中稳定表达;
而作为对照的两个内参基因，ClActin 和 26S rRNA 基因在不同非生物胁迫下表达稳定，但在不同生长发育阶段的样
本中表达强度不同。这一结果表明，ClTUA 基因的表达稳定性优于 ClActin 和甘菊 26S rRNA 基因，可以作为内参基
因用于甘菊抗逆性和生长发育过程中基因表达规律研究。
关键词:甘菊;内参基因;ClTUA;基因表达分析
中图分类号:S682. 1 + 1 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2012)02--0112--06
HUANG He;NIU Ya-jing;YANG Ke;DAI Si-lan． Isolation and expression analysis of a reference
gene:ClTUA of Chrysanthemum lavandulifolium． Journal of Beijing Forestry University (2012)34(2)
112--117［Ch，32 ref．］College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，100083，P． R．
China．
Selection and validation of reference genes constitute a key point for gene expression analysis of
Chrysanthemum lavandulifolium． An EST encoding α-tubulin from C． lavandulifolium was identified in
our previous study． By using RACE approach，we isolated the full length sequence of this gene and
designated it as ClTUA． ClTUA contained an open reading frame of 1 580 bp that encoded a protein of
432 amino acids． Phylogenetic analysis using MEGA4. 0 software indicated that ClTUA belonged to class
Ⅰ of α-tubulin genes． To assess the usability of ClTUA as a reference gene，we compared the expression
patterns of ClTUA with two other housekeeping genes，ClActin and 26S rRNA under salt，drought，cold，
heat，ABA，and SA treatments as well as in different developmental stages． Our results showed that the
transcript levels of ClActin and 26S rRNA were stable under abiotic treatments but varied in different
developmental stages，while that of ClTUA was expressed consistently in all samples． The data suggest
that ClTUA is more suitable than ClActin and 26S rRNA as a reference gene for the analysis of gene
expression patterns under abiotic stress and in different growth stages in C． lavandulifolium．
Key words Chrysanthemum lavandulifolium;reference gene;ClTUA;gene expression analysis
基因表达分析技术为了解基因调控表达的复杂
网络提供了理论证据。在转录水平进行基因表达定
量分析时，通常使用看家基因(housekeeping genes)
作为内参基因(reference genes)对目标基因(target
gene)表达量进行校正［1］。实际上，任何一种看家基
因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞中或特
定实验因素作用下恒定。理想的看家基因应该是参
与植物基础新陈代谢过程中组成型表达的基因，如
蛋白质代谢途径和糖代谢途径中的基因［2
--5］。目前
较多使用的主要有甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因
(GAPDH)、植物延伸因子基因(EF-1a)、多聚泛素基
因(polyubiquitin，polyUB)、肌动蛋白基因(Actin)和
微管蛋白中的 α、β 家族基因(α /β-tubulin)。拟南
芥(Arabidopsis thaliana)中理想的看家基因为参与
DOI:10.13332/j.1000-1522.2012.02.012
泛素降解途径的相关基因，如多聚泛 素 基 因
(polyubiquitin，AtpolyUB )、泛 素 连 接 酶 基 因
(ubiquitin-conjugating enzymes，AtUbcH)和泛素结合
酶基因(ubiquitin conjugating enzyme，AtUCE)［6］;水
稻(Oryza sativa)中为泛素结合酶基因(OsUCE)和植
物延伸因子基因(OsEF-1a)［7］;向日葵(Helianthus
annus)中为 α-tubulin 基因［8］。Brunner 等［2］对 10
个候选的内参基因在 8 个不同的杨树品种中的表达
模式进行研究发现，泛素代谢途径基因和 α-tubulin
基因是适合用于杨属(Populus)植物基因表达分析
的看家基因;但是，盲目地使用一种看家基因作为内
参可能导致错误的结论，很多被广泛使用的内参基
因在某些物种中的表达并不是组成型的［9］。
甘菊［Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch． ex
Trautv．)Makino］是菊科(Compositae)菊属中的二
倍体植物，为栽培菊花(C． × morifolium Ramat．)的
近缘野生种［10
--11］，是一种广布于我国华北山地的盐
生植物，且为典型的短日照成花的植物，目前已经将
其作为栽培菊花研究上的模式植物［12］。对其相关
生物学问题展开研究，可以为解析栽培菊花主要观
赏性状形成的机理提供参考，也将为菊花分子育种
研究奠定基础。目前，关于甘菊抗逆性和成花分子
机理的研究已取得了一定的进展，但只有肌动蛋白
基因(ClActin)和 26S rRNA 基因可供作为内参使
用［13
--14］;因此，在甘菊中发掘更多具有较高的稳定
性和重复性的内参基因，对于提高基因表达研究的
准确性和可靠性极为重要。
微管蛋白(tubulin)是细胞的一种骨架蛋白，参
与细胞内胞质环流、形状维持、运动、分裂、分化、物
质运输、信号转导以及极性建成等重要的生理活动，
可以分为 α、β、γ、δ、ε 等多种亚家族［15］，其中 α-
tubulin 蛋白和 β-tubulin 蛋白组成一种异源二聚体
蛋白，其基因通常呈现组成型表达［16］;因此很多物
种将其作为研究基因差异表达的内参基因。本研究
使用前期研究获得的甘菊 α-tubulin 基因 EST 为模
板，使用 RACE 技术克隆到了一个新的甘菊 α-
tubulin 基因(ClTUA)。通过对不同非生物胁迫处理
和处于不同发育阶段的试材进行分析发现，甘菊
ClTUA 基因为组成型表达。据此我们推测其为一个
新的看家基因，可以作为内参基因用于甘菊基因表
达分析。
1 材料与方法
1. 1 材 料
甘菊种子于 2009 年 12 月采自北京林业大学苗
圃内，经次氯酸钠消毒后播种于 1 /2MS 培养基中，
培养至 4 对真叶，移入蛭石穴盘中，在长日照(14 h
(L)/10 h(D) ，光照度 2 500 lx)人工气候室中培养
(培养温度(23 ± 2)℃，湿度 60% ～ 80%)。待植株
生长至 6 对真叶时进行如下胁迫诱导:200 mmol /L
NaCl 溶液和 3 mmol /L 水杨酸(SA)溶液浇灌穴盘
苗 2、12、24 h 模拟盐胁迫和水杨酸胁迫;将穴盘苗
从穴盘中取出，用蒸馏水洗净根系，放置于润湿的脱
脂棉中 2、12、24 h 模拟干旱处理;将穴盘苗置于 4
和 40 ℃培养箱中分别处理 2、12、24 h 模拟冷胁迫
和热胁迫;将 200 μmol /L ABA 溶液喷施甘菊叶片
2、12、24 h，进行 ABA 诱导。
甘菊各生长发育阶段的样本为甘菊种子、幼叶
(种子萌发后的第一对真叶)、成年植株功能叶片
(13 ～ 14 对真叶，取材部位为由顶芽向下第 6 ～ 7 对
真叶) ，短日照(12 h(L)/12 h(D) )诱导 30 d 后的
叶片、花蕾、花瓣、茎段，开花后 55 ～ 60 d 趋于衰老
叶片、根系。上述材料采集后于液氮中速冻，保存于
－ 80 ℃超低温冰箱中备用。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 总 RNA 提取和反转录
使用改进的 TRIzol 法［17］提取甘菊中上述样品
的总 RNA，经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测质量，并使
用 Smart Spec Pluss 分光光度计测定浓度，合格样品
(OD260 /OD280≥ 2. 0)定量为 1 000 ng /μL，保存于
－ 70 ℃ 超低温冰箱中备用。参照 Promega 公司
M-MLV反转录酶说明书进行反转录合成 cDNA第
一链。
1. 2. 2 甘菊 α-tubulin 基因同源基因全长扩增
根据课题组获得的甘菊 ClTUA 基因 EST 序列
为模板，设计 3和 5端特异性引物(表 1)。参照胡
可等［18］方法和英俊公司 5RACE 试剂盒说明书分
别扩增其 3末端和 5末端，回收得到的目的片段并
连接到 pMD18--T 载体上，转化感受态大肠杆菌
TOP10，蓝白斑筛选后选取阳性克隆送至上海生工
公司测序。
1. 2. 3 序列的生物信息学分析
使用 DNAMAN 生物软件进行序列的比对、翻译
和全序列拼装，在 NCBI(www. ncbi. nlm. nih. gov /
BLASTx)网站上进行 BLASTx 搜索。下载杨树和拟
南芥的所有 TUA 基因蛋白序列及 BLASTx，采用
MEGA4. 0 程序进行序列比对，利用 Neighbor-Joining
法将比对结果生成辐射型系统进化树。
1. 2. 4 基因表达分析
使用 RT-PCR 技术，以本课题组已经获得的甘
菊内参基因 ClActin 和 26S rRNA 基因为阳性对照，
对 ClTUA 在各种胁迫处理下及不同器官组织中的
表达特性进行分析。
311第 2 期 黄 河等:甘菊内参基因 ClTUA 的克隆与表达分析
表 1 本试验所用引物列表
Tab． 1 Primers in this study
引 物 序 列 引物用途
AP 5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)16 -3 3RACE 反转录引物
AUAP 5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 3RACE 锚定引物
ClTUA-3RACE 5-GCAGTGCTTTTGAGCCATCTTC-3 3RACE 特异性引物
ClTUA-3RACE-CS 5-AAGACCAAGAGAACCATCCAGT-3 3RACE 巢式引物
ClTUA-5RACE-GSP1 5-GCAGCGTTCACATCCTT-3 5RACE 特异性引物反转
ClTUA-5RACE-GSP2 5-GGTTCTCTTGGTCTTGATTGTTG-3 5RACE 一轮巢式扩增引物
ClTUA-5RACE-GSP3 5-TTACAGGAGCGTATGACGAAAGC-3 5RACE 二轮巢式扩增引物
AAP 5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3 5RACE 锚定引物
ClTUAs 5-TTTCGTCATACGCTCCTGTA-3 序列扩增的上游引物
ClTUAx 5-TGGATGGTTCTCTTGGTCTT-3 序列扩增的下游引物
2 结果与分析
2. 1 甘菊 α-tubulin 基因 cDNA 克隆
使用 3RACE 技术获得长度为 487 bp 的片段
(图 1A) ，使用 5RACE 技术获得长度为 743 bp 的
片段(图 1B) ，经 DNAMAN 软件拼装后获得的基因
全长为1 580 bp，其中开放阅读框为1 296 bp，编码
432 个氨基酸，5UTR 和 3UTR 分别长 81 和 147 bp
(图 2)。
A. 3末端的扩增(1、2 泳道) ;B. 5末端的扩增(3、4 泳道)
图 1 ClTUA 基因的 3末端和 5末端的扩增结果
Fig. 1 Amplification of 3 end sequence and
5 end sequence of ClTUA gene
2. 2 甘菊 α-tubulin 基因的同源性分析和系统进化
树的构建
序列比对分析发现，ClTUA 编码的氨基酸序列
与蓖麻、陆地棉、青杄、垂枝桦的 α-tubulin 蛋白一致
性最高，均超过 98%。由图 3 可知，植物 α-tubulin
蛋白分为Ⅰ和Ⅱ类，在Ⅰ类 α-tubulin 蛋白中，藻类
植物的 4 个 α-tubulin 蛋白单独聚为一类而被区分
出 来 (BignatTUA1、 BignatTUA2、 UlvfasTUA、
VolcarTUA)。 拟 南 芥 ArathaTUA、ArathaTUA1、
ArathaTUA5 和 杨 树 PoptreTUA2、 PoptreTUA4、
PoptreTUA6 聚为Ⅱ类。甘菊 ClTUA 基因编码的蛋
白首先与欧洲山杨和毛果杨的 TUA7 蛋白聚为一
类，继而与蓖麻(RiccomTUA)、青杄(PicwilTUA)、垂
枝桦 (BetpenTUA)、月 季 (RoshybTUA)、陆 地 棉
(GoshirTUA)和大桉(EucgraTUA)的亲缘关系较近，
其与Ⅱ类的拟南芥 Aratha2 /4 /6、杨树 Poptre3 /5、茄
科植 物 α-tubulin 蛋 白 (CapannTUA、SoltubTUA、
NictabTUA )和 单 子 叶 植 物 α-tubulin 蛋 白
(TriaesTUA4A、SetvirTUA、EleindTUA1、HorvulTUA4、
AloaeqTUA、OrysatTUA)等亲缘关系均较远。这些结
果表明，甘菊 ClTUA 基因属于植物Ⅰ类 TUA 基因，
且其蛋白的进化基本符合经典植物学的进化路线。
2. 3 甘菊 α-tubulin 基因的表达分析
鉴于抗逆性和生长发育调控是目前植物分子生
物学研究的两个热点问题，我们选择了甘菊逆境胁
迫下和不同生长发育时期的样品。对 RT-PCR 分析
发现，ClTUA 基因、目前研究中常用的 ClActin 和 26S
rRNA 基因在各逆境条件下均能一致性表达(图 4、
5) ，说明这 3 个基因在分析甘菊抗逆基因表达模式
时是合适的。
在分析甘菊不同生长发育时期的样品时，我们
发现 ClActin 和 26S rRNA 基因在各样品中为非组成
型表达，ClActin 基因在幼叶、茎段、成年叶、短日照
诱导叶、花蕾和花瓣中的表达量一致，但在种子、衰
老叶片和根系中的表达量低于上述样品(图 6) ;甘
菊 26S rRNA 在甘菊种子中不表达，在幼叶、成年
叶、短日照诱导叶片、花瓣中表达量较低，而在茎段、
花蕾、衰老叶片和根系中高丰度表达(图 6) ;ClTUA
基因在上述所有样品中均稳定表达(图 4 ～ 6)。
3 结论与讨论
3. 1 ClTUA 基因的表达特性
本研究结果表明，从甘菊中获得的编码 α-
tubulin 蛋白的同源基因 ClTUA 属于植物中Ⅰ类
TUA 基因。基因表达模式分析表明，ClTUA 基因在
逆境诱导、生长发育不同阶段的样品中表达量均一，
可以作为甘菊基因表达模式分析的内参基因加以使
用。同甘菊其他内参基因 ClActin 及 26S rRNA 基因
相比，其优势主要表现为在甘菊各生长发育阶段、不
同器官中和不同逆境诱导下均呈现组成型表达，且
表达量丰度未达到饱和状态，定量结果准确。
411 北 京 林 业 大 学 学 报 第 34 卷
图 2 ClTUA 基因的 cDNA 序列及推定氨基酸序列
Fig. 2 cDNA sequence and amino acid sequence of ClTUA gene
3. 2 广泛作为内参基因使用的 Actin 基因和 α-
tubulin 基因的表达特点
Actin 曾广泛作为内参基因应用于动植物的基
因表达分析中;但是近期越来越多的研究证明，仅使
用 Actin 基因作为内参会造成实验的精确性降低，如
β-Actin 的表达易受基质胶浓度的调控［9］。我们的
结果证明 ClActin 在部分组织(幼叶、茎段、花瓣、花
蕾)中表达丰度很高，这有可能导致当目标基因丰
度较低时，定量结果的准确性降低。目前已经有很
多研究均表明，核糖体 RNA 不适合作为内参在基因
表达研究中使用，尤其是当不同组织中的 mRNA 和
rRNA 含量比例不同，往往导致试验结果出现错误，
例如在有丝分裂期间，18S rRNA 明显减少或停止表
达［28］。这与我们试验中看到的 26S rRNA 在甘菊不
同生长发育阶段的表达模式一致，因此，开发有效的
内参基因对于基因表达研究极为重要。
α-tubulin 基因在高等植物中以小基因家族发挥
作用，其在拟南芥、杨树、葡萄(Vitis vinifera)和大麦
中的数目分别为 6、8、7、5［19--22］，这些基因按照其编
码氨基酸 C 端的多态性可分为 2 类(Ⅰ和Ⅱ)［20］，
这 2 类 α-tubulin 基因在植物中的表达模式有很大
差异。欧洲山杨中的Ⅰ类 α-tubulin 基因，除 PtTUA7
(即 ClTUA 基因的同源基因)外，其余成员均在木质
部中高丰度表达，而Ⅱ类 PtTUA 基因在各器官中表
达丰度均很低［20］;拟南芥中的Ⅰ类 α-tubulin 基因
(AtTUA2 /4)在各器官中组成型表达，而Ⅱ类基因中
的 AtTUA1 只在花部表达［23］;大麦中，HvTUA2 /4 基
因在叶部分生组织表达，HvTUA1 /5 在有丝分裂后期
表达，而 HvTUA3 只在分裂中期微丝形成时表
达［22］。鉴于 α-tubulin 基因在多种植物不同器官中
的非组成型表达特性，已有大量文献针对 α-tubulin
基因能否作为候选基因使用进行了探讨。结果表
明，其在亚麻(Linum usitatissimum)和珊状臂形草
(Brachiaria brizantha)中不适合作为内参使用［24--25］，
而在龙眼 (Dimocarpus longgana)、黄瓜 (Cucumis
sativus)、向日葵中适用［26--27，8］;因此，α-tubulin 基因
在不同物种中的表达模式尚待进一步分析。
3. 3 内参基因研究前景
目前已有研究者进行了菊属植物候选内参基因
的筛选，Gu 等［29］研究表明:EF1-α 在研究菊花响应
511第 2 期 黄 河等:甘菊内参基因 ClTUA 的克隆与表达分析
图 3 ClTUA 基因的系统进化位置
Fig. 3 A phylogenetic analysis of ClTUA gene
注:构建系统进化树使用的其他物种 α-tubulin 蛋白信息:ArathaTUA(拟南芥，AAA32888. 1)、ArathaTUA1(AAD38249. 1)、ArathaTUA2
(AAA32889. 1)、ArathaTUA4(AAA32890. 1)、ArathaTUA5(AAA32891. 1)、ArathaTUA6(AAA32892. 1)、PoptreTUA (欧洲山杨 Populus tremula，
AAO23139. 1)、PoptreTUA1(AAO63781. 1)、PoptreTUA2(AAO63773. 2)、PoptreTUA3(ABQ59633. 1)、PoptreTUA4(ABR67425. 1)、PoptreTUA5
(ABQ59634. 1)、PoptreTUA6(ABV55994. 1)、PoptreTUA7(ABV55999. 1)、PoptriTUA7(毛果杨 P. trichocarpa，XP_002324047. 1)、TriaesTUA4A
(普 通 小 麦 Triticum aestivum，ABD92937. 1)、BignatTUA1 (Bigelowiella natans，AAT09063. 1)、CapannTUA (辣 椒 Capsicum annuum，
ABP65320. 1)、BignatTUA2(Bigelowiella natans，AAT09064. 1)、CamsinTUA1(茶 Camellia sinensis，ABC59068. 2)、SetvirTUA(狗尾草 Setaira
viridis，CAE52515. 1)、UlvfasTUA(裂片石莼 Ulva fasciata，ACH70610. 1)、VolcarTUA(团藻 Volvox carteri f． nagariensis，XP _002951007. 1)、
RoshybTUA(月季 Rosa hybrida，AAK81858. 1)、EleindTUA (牛筋草 Eleusine indica，CAA06619. 1)、HorvulTUA (大 麦 Hordeum vulgare，
CAM58977. 1)、AloaeqTUA(看麦娘 Alopecurus aequalis，BAJ06362. 1)、EucgraTUA(大桉 Eucalyptus grandis，ABS50670. 1)、GoshirTUA(陆地棉
Gossypium hirsutum，ABO47740. 1)、NictabTUA(烟草 Nicotiana tabacum，CAD13177. 1)、OrysatTUA(水稻，CAA62916. 1)、SoltubTUA(马铃薯
Solanum tuberosum，ACH68563. 1)、BetpenTUA(垂枝桦 Betula pendula，ACJ60905. 1)、PicwilTUA(青杄 Picea wilsonii，ABX57816. 1)、CucmelTUA
(厚皮甜瓜 Cucumis melo，ADN33817. 1)、RiccomTUA(蓖麻 Ricinus communis，XP_002510010. 1)。
图 4 ClTUA、ClActin 和甘菊 26S rRNA 基因在盐、
干旱和冷胁迫下的表达模式
Fig. 4 Expression patterns of ClTUA，ClActin and
26S rRNA under salt，drought and cold stress treatment
图 5 ClTUA、ClActin 和甘菊 26S rRNA
基因在热、ABA 和 SA 胁迫下的表达模式
Fig. 5 Expression patterns of ClTUA，ClActin and
26S rRNA under heat，ABA and SA stress treatment
生物胁迫时适用，而在水分胁迫过程中表达量变化
较大;PP2A 基因则与之相反，在生物胁迫过程中表
现不稳定，在热、水分胁迫过程中表达恒定;而广泛
使用的内参基因 Actin 在上述胁迫过程中均表现得
不够稳定。
图 6 ClTUA、ClActin 和甘菊 26S rRNA 基因在甘菊不同
生长发育阶段的表达模式
Fig. 6 Expression patterns of ClTUA，ClActin and 26S rRNA
in different growth stages of C . lavandulifolium
后基因组学的到来为发掘更多的植物内参基因
奠定了基础。大量基因数字表达谱数据为新的内参
基因的筛选提供了一条新的途径［30］。Libault 等［31］
通过分析大豆(Glycine max)已发表的基因芯片数
据，发现了多达 200 个稳定性较好的基因;Faccioli
等［32］基于大麦 EST 数据库，筛选出一批稳定性较好
的候选基因，通过分析发现可以作为大麦中新的内
参基因加以使用，如 GAPDH、hsp90 基因和一个未知
基因(TC139056)。目前多数研究结果均证明，在进
行基因表达分析时选择 2 个以上的内参基因作参照
有助于得到更为准确的试验结果，我们获得的
ClTUA 基因将有助于提高菊属植物基因表达分析的
611 北 京 林 业 大 学 学 报 第 34 卷
准确性，也为其他内参基因的开发提供了参考。
参 考 文 献
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(责任编辑 董晓燕)
711第 2 期 黄 河等:甘菊内参基因 ClTUA 的克隆与表达分析