全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (3): 248–256, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00248
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收稿日期: 2011-10-17; 接受日期: 2012-02-08
基金项目: 国家重点基础研究发展计划(No.2009CB119104)和中国科学院知识创新工程重要方向项目(No.KSCX2-EW-J-1)
* 通讯作者。E-mail: yhailing@yahoo.com.cn
毛白杨两个Phi类GST基因的克隆及生化特性
李迪1, 唐振鑫1, 刘海静2, 曾庆银2, 杨海灵1*
1北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083
2中国科学院植物研究所, 系统与进化植物学国家重点实验室, 北京 100093
摘要 谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST)在植物的抗逆反应、细胞信号转导和抗病等方面发挥着重要作用。
从毛白杨(Populus tomentosa)中克隆到2个Phi类GST基因(PtoGSTF1和PtoGSTF2), 它们分别编码215和218个氨基酸残
基的蛋白质。DNA序列分析显示这2个基因均含有2个内含子。组织表达模式分析表明, 这2个基因在毛白杨的根、茎、叶、
韧皮部和顶芽组织中均表达 , 是组成型表达基因。在大肠杆菌中表达这2个基因并纯化重组蛋白。酶活性分析显示
PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白对底物CDNB、NBD-Cl、NBC和Cum-OOH都具有酶学活性, 但活性差异较大。动力学分析显
示, PtoGSTF2对NBD-Cl的亲和力是PtoGSTF1的2.5倍, 但PtoGSTF1的催化效率是PtoGSTF2的56.8倍。热力学稳定性分
析显示, PtoGSTF1比PtoGSTF2具有更高的热力学稳定性。因此, 酶学性质的差异预示着这2个Phi类GST基因可能存在功
能上的分化。
关键词 克隆, 酶活性, 谷胱甘肽转移酶, 毛白杨, 蛋白结构
李迪, 唐振鑫, 刘海静, 曾庆银, 杨海灵 (2012). 毛白杨两个Phi类GST基因的克隆及生化特性. 植物学报 47, 248–256.
谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST,
EC 2.5.1.18)是一类具有多种生理功能的蛋白质超家
族, 广泛存在于植物、动物、细菌和真菌中。植物谷
胱甘肽转移酶的主要功能是参与植物体内的解毒代
谢, 通过催化还原型谷胱甘肽的巯基与某些内源或外
源有害的亲电子基团偶联, 增加其亲水性使其易于排
出细胞膜(Edwards et al., 2000)。植物GST基因家族
可以分为8个类型, 分别是DHAR、Tau、Phi、Zeta、
Theta、Lambda、TCHQD和EF1Bγ(Lan et al., 2009)。
植物Tau、Phi和Zeta类GST的晶体结构已被解析, 结
构比较显示虽然所有植物GST的三维结构比较保守
(Thom et al., 2002), 但是其C末端结构域有较大变
异, 这与GST的功能相关, 因为植物GST的C末端结
构域主要负责结合特异性底物, 不同的GST能结合
特定底物而发挥不同的生理功能 (Basantani and
Srivastava, 2007)。Phi类GST蛋白以可溶性的二聚体
形式发挥作用, 分子量通常为50 kDa左右。Phi GST
基因在植物的抗逆反应、细胞信号转导和植物抗病等
方面发挥着重要作用 (Dixon et al., 2002; Frova,
2003; Basantani and Srivastava, 2007)。例如在拟南
芥(Arabidopsis thaliana)中过量表达Phi GST基因可
明显增强植株对紫外辐射损伤作用的耐受性(刘新仿
和李家洋, 2002); 在烟草(Nicotiana tabacum)中过量
表达玉米(Zea mays)的Phi GST基因明显增强了植株
对除草剂甲草胺的抗性(Karavangeli et al., 2005)。
毛白杨(Populus tomentosa)为杨柳科、杨属落叶
大乔木, 是我国特有的优良乡土树种。由于毛白杨树
干通直挺拔, 树形优美, 也是一个优良的造林绿化树
种。毛白杨具有生长快、材质优良、抗逆性强和适应
性广等特点, 已在国内进行大面积速生丰产林的营造
(朱之悌, 2006), 对于河滩的绿化、防止荒漠化和改善
环境都具有重要的生态意义。我们先前对毛果杨
(Populus trichocarpa)GST基因家族进行了系统发育
关系、基因表达模式和酶学性质的研究, 发现毛果杨
GST基因家族存在不同层次的功能分化(Lan et al.,
2009)。而对于我国特有的优良乡土树种毛白杨, 其
GST基因家族是否也存在着广泛的功能分化, 其适
应性意义是什么?为了探索这些问题, 本研究从毛白
杨中克隆得到2个Phi类GST基因, 并对该基因的基
因结构、系统进化、表达模式、蛋白结构和生化功能
·研究报告·
李迪等: 毛白杨两个 Phi 类 GST 基因的克隆及生化特性 249
进行了详细的研究, 以期为深入揭示Phi类GST基因
在林木植物中的抗逆机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 毛白杨GST基因的克隆
取新鲜毛白杨(Populus tomentosa Carr.)叶片组织
0.1 g, 按照BioTeKe公司RNA提取试剂盒和TIAN-
GEN公司DNA提取试剂盒提供的说明书提取毛白杨
叶片组织的总RNA和DNA, 并将总RNA反转录合成
cDNA。
根据毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & A)Pt-
GSTF1和PtGSTF2基因的序列(GenBank No. GQ37-
7241和GQ377242)分别设计2对引物PtGSTF1-CL3/
CL5(PtGSTF1-CL3: 5′-TGCGTGGCTATAAGTGA-
AGTG-3′; PtGSTF1-CL5: 5′-CAGACCGAGCAAAA-
AACGAC-3′)和PtGSTF2-CL1/CL2(PtGSTF2-CL1:
5′-GAAAAGGCAGCAATAACCAAT-3′; PtGSTF2-
CL2: 5′-CAAAACACAGCAACCTCGTAA-3′)。分别
以毛白杨叶cDNA和基因组DNA为模板, 利用2对引
物分别进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电
泳检测, 目的条带割胶回收纯化, 将纯化产物连接入
pGEM-T载体。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌
JM109感受态细胞 , 挑选多个阳性克隆进行双向
测序。
1.2 系统发育关系分析
将PtoGSTF1和PtoGSTF2的蛋白序列与其它植物的
GST序列通过Clustal X1.83进行氨基酸序列比对, 然
后经BioEdit手动校对。利用MEGA V.4.0的neigh-
bour-joining(NJ)模型构建进化树 (Tamura et al.,
2007), Bootstrap值为1 000。
1.3 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2基因的组织
表达模式分析
根据PtoGSTF1和PtoGSTF2基因的序列分别设计2
对特异性引物PtoGSTF1-SP1/SP2(PtoGSTF1-SP1:
5′-ATGGCAACTCCGGTGACTATT-3′; PtoGSTF1-
SP2: 5′-AGGCTTCGTCTACTGGGACAC-3′)和Pto-
GSTF2-SP1/SP2(PtoGSTF2-SP1: 5′-ATGGCAAC-
TCCAGTGAAGGTG-3′; PtoGSTF2-SP2: 5′-CACC-
CTGGTCTTGTGGGATAT-3′)。分别提取毛白杨顶
芽、叶、韧皮部、茎和根等组织的总RNA, 并反转录
合成cDNA。在PCR反应中以含有目的基因的pGEM-
T质粒作为阳性对照, 以不加任何cDNA模板的PCR
反应液作为阴性对照, 并以毛白杨Actin基因作为内
标。PCR反应程序: 94°C预变性3分钟; 94°C30秒,
58°C40秒, 72°C1分钟, 共35个循环; 最后72°C延伸
5分钟。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的结构
模拟
选取玉米GST-III蛋白(PDB: 1AW9)的X衍射晶体结
构为模板, 以Align 2D程序(InsightII的Homology模
块)进行序列比对, 运用InsightII的Modeler模块构建
蛋白质三维结构, 产生5个结构。每个结构产生5个不
同的环区结构, 优化水平为高等, 以Profiles-3D对各
结构进行评价, 选取最优结构。
1.5 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2融合蛋白的
表达与纯化
根据PtoGSTF1和PtoGSTF2的cDNA序列设计2对引
物PtoGSTF1-EX1/EX2(PtoGSTF1-EX1: 5′-GTCA-
GATATCATGGCAACTCCGGTGACTAT-3′; PtoGS-
TF1-EX2: 5′-GTCAGTCGACTTATCAAGCATTTTT-
CCTCATTT-3′)和PtoGSTF2-EX1/EX2(PtoGSTF2-
EX1: 5′-GTCAGATATCATGGCAACTCCAGTGAA-
GGT-3′; PtoGSTF2-EX2: 5′-GTCAGTCGACTTAT-
CAACCACTTTTCCTCATCT-3′)。通过定向克隆技术
将PtoGSTF1和PtoGSTF2基因的编码序列亚克隆到
带有6×His标签的PET30a表达载体中, 转化大肠杆
菌BL21感受态细胞。将测序验证正确的重组表达菌
于含50 μg·mL–1卡那霉素的LB液体培养基中培养过
夜 , 以1:100稀释后扩大培养至OD600为0.5, 加入
IPTG至终浓度为0.1 mmol·L–1, 37°C诱导过夜。诱导
表达后的菌液于4°C、6 500×g离心10分钟, 收获菌
体, 用缓冲液A(20 mmol·L–1咪唑、0.5 mol·L–1NaCl、
20 mmol·L–1Na3PO4, pH7.5)重悬, 冰上超声破碎裂
解。4°C、10 000×g离心10分钟, 分别取少量原菌液、
超声破碎离心后的上清液和沉淀, 经SDS-PAGE检
测是否具有目的蛋白。重组蛋白质的纯化: 首先用缓
冲液A平衡Ni亲和柱(购于Amersham Pharmacia Bio-
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tech公司), 将超声破碎后离心获得的上清液上样, 然
后以缓冲液A平衡, 最后用缓冲液B(0.5 mol·L–1咪唑、
0.5 mol·L–1NaCl、20 mmol·L–1Na3PO4, pH7.5)洗脱
目的蛋白, 收集目的蛋白洗脱峰。
1.6 酶活性、动力学参数和热力学稳定性的测定
本实验共采用6种底物对重组蛋白进行酶活性的测
定, 包括1-氯-2,4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitroben-
zene, CDNB)、7-氯 -4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑
(7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole, NBD-Cl)、
4-硝基苄氯(4-nitrobenzyl chloride, NBC)、枯烯氢过
氢化物酶(cumene hydroperoxidase, Cum-OOH)、
2,2’-二硫二乙醇(2-hydroxyethyl disulfide, HED)和脱
氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid, DHA)。其中对
CDNB和NBC这2种底物的测定方法参照Habig等
(1974)的方法; 对NBD-Cl的催化活性测定参照Ricci
等(1994)的方法; 对HED和DHA的催化活性测定参
照Edwards等的方法(Edwards and Dixon, 2005)。催
化活性的测定在Evolution 300紫外可见分光光度计
(Thermo)上进行。在进行酶促动力学分析时, 固定
GSH(glutathione)的浓度(1 mmol·L–1), NBD-Cl的浓
度在0.04–1.6 mmol·L–1之间变化 , 然后测定酶对
NBD-Cl的催化活性, 最后得到的酶促动力学数据用
Hyper32program程序 (http://www.liv.ac.uk/~jse/Hy-
per32.html)进行非线性回归分析。酶的热力学稳定性
分析方法如下: 将纯化的蛋白分别在25–55°C之间,
每5°C设定1个温度梯度下保温15分钟, 保温结束后
检测酶对底物NBD-Cl的催化活性。
2 结果与讨论
2.1 毛白杨Phi GST基因的序列与结构分析
分别以毛白杨叶cDNA以及基因组DNA为模板, 用引
物PtGSTF1-CL3/CL5克隆得到PtoGSTF1的cDNA及
基因组序列(图1A)。PtoGSTF1 cDNA序列包含一个
648 bp的开放阅读框(包括终止密码子)、64 bp上游非
编码序列和8 bp下游非编码序列。其编码蛋白产物包
含215个氨基酸残基 , 预测分子量为24.32 kDa。
PtoGSTF1的基因组序列长914 bp, 包含2个内含子,
内含子长度分别为82 bp和112 bp(图1A)。PtoGSTF1
与毛果杨PtGSTF1的cDNA序列相似性为97.8%, 蛋
白质序列仅有2个氨基酸的差异。
以引物PtGSTF2-CL1/CL2分别克隆得到Pto-
GSTF2的cDNA及基因组序列 (图1B)。PtoGSTF2
cDNA序列包含一个657 bp的开放阅读框(包括终止
密码子)、22 bp上游非编码区和74 bp下游非编码区。
其编码的蛋白包含218个氨基酸残基, 预测分子量为
24.57 kDa。PtoGSTF2的基因组序列长961 bp, 包含
2个长度均为104 bp的内含子(图1B)。PtoGSTF2与毛
果杨PtGSTF2的cDNA序列相似性为98.1%, 蛋白质
序列也仅有2个氨基酸的差异。PtoGSTF1与Pto-
GSTF2的蛋白序列相似性为74.3%。
2.2 毛白杨Phi GST基因的系统发生关系分析
选取裸子植物银杉(Cathaya argyrophylla), 单子叶
植物水稻(Oryza sativa)、玉米、小麦(Triticum aes-
tivum)和双子叶植物拟南芥的Phi GST基因为研究对
象。同时, 将植物GST基因家族的其它类型, 包括
Tau、DHAR、Lambda、Theta和Zeta GST序列也加
入到系统发育分析中。系统发育树显示所有Phi GST
基因聚成一大支, 而且支持率均大于94%(图2), 充分
说明本研究克隆的2个基因为Phi类GST基因。而
PtoGSTF1 与 PtGSTF1 聚 在 一 起 , PtoGSTF2 与
PtGSTF2聚在一起 , 说明PtoGSTF1与PtGSTF1是
直系同源基因, PtoGSTF2与PtGSTF2也是直系同源
基因, 这2组基因可能是通过最近的基因重复事件产
生的。
2.3 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2基因的组织
表达模式分析
利用RT-PCR方法研究PtoGSTF1和PtoGSTF2基因
在正常生长条件下毛白杨不同组织(根、茎、叶、韧
皮部和顶芽 )中的表达分布模式。结果发现 , Pto-
GSTF1和PtoGSTF2基因在毛白杨所有组织中均表
达(图3), 表明PtoGSTF1和PtoGSTF2基因是组织构
成性表达基因, 在毛白杨的生长发育中可能发挥着重
要作用。
2.4 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的三维
结构模拟
利用InsightII模拟毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2的
三维结构(图4A, B)。优化后的构象用Profile-3D进行
李迪等: 毛白杨两个 Phi 类 GST 基因的克隆及生化特性 251


图1 PtoGSTF1(A)和PtoGSTF2(B)的核酸及推导的氨基酸序列
图中大写字母和阴影部分表示外显子, 小写字母表示内含子, 终止密码子用*表示。

Figure 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PtoGSTF1 (A) and PtoGSTF2 (B)
The extron sequence is marked in gray. The intron sequence is in lower case. The stop codon is denoted by an asterix.


氨基酸残基的兼容性考察, 结果如图4C所示, 可以
看到绝大部分氨基酸残基得分都为正值, 位于合理的
范围。PtoGSTF1和PtoGSTF2的三维结构包括2个结
构域: 由α螺旋和β折叠组成的类硫氧还原蛋白结构
域(N-domain)以及由6个α螺旋组成的C末端结构域
(C-domain)。2个蛋白的N末端结构域氨基酸大约组成
了蛋白全长的三分之一, 包括1个β-α-β-α-β-β-α结构
域。蛋白结构比较发现2个蛋白的结构高度相似, 仅
仅在3个Loop区域处有变化(图4D)。
2.5 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的纯化
和酶活性测定
将重组表达载体pET30a/PtoGSTF1和pET30a/Pto-
GSTF2分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞, IPTG诱
导后发现PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白在细菌中可溶
性表达(图5)。SDS-PAGE结果显示, 重组蛋白的分子
量与预测的PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白大小一致。
通过亲和层析获得纯化的重组蛋白(图5)。

252 植物学报 47(3) 2012


图2 毛白杨Phi GST基因的系统发育分析

Figure 2 Phylogenetic tree showing relationships between
Phi GST in Populus tomentosa and other classes of plant
GST
Homo sapiens mu GST: GenBank accession number
Q03013; Homo sapiens pi GST: GenBank accession number
P09211; PtGSTF1: Populus trichocarpa, GenBank accession
number GQ377241; PtGSTF2: P. trichocarpa, GenBank
accession number GQ377242; AtGSTF9: Arabidopsis
thaliana, GenBank accession number AAK49621; OsGSTF3:
Oryza sativa, GenBank accession number AF309384;
TaGSTF2: Triticum aestivum, GenBank accession number
CAD29475; ZmGSTF: Zea mays, GenBank accession num-
ber NP_001105412; CaGSTF1: Cathaya argyrophylla, Gen-
Bank accession number ACL37469; AtGSTT10: A. thaliana,
GenBank accession number CAA10457; OsGSTT1: O. sa-
tiva, GenBank accession number AAK98534; EeGSTT1:
Euphorbia esula, GenBank accession number AAF64449;
TaGSTZ1: T. aestivum, GenBank accession number O04-
437; AtGSTZ1: A. thaliana, GenBank accession number
NP_178344; MpGSTZ1: Malva pusilla, GenBank accession
number AAO61856; PtGSTU1: Pinus tabulaeformis, Gen-
Bank accession number AY640175; OsGSTU3: O. sativa,
GenBank accession number AAQ02687; CmGSTU3: Cucur-
bita maxima, GenBank accession number BAC21263;
OsGSTL1: O. sativa, GenBank accession number ABC-
74869; AtGSTL1: A. thaliana, GenBank accession number
NM_120356; AtGSTL2: A. thaliana, GenBank accession
number NM_115362; OsDHAR1: O. sativa, GenBank acces-
sion number AAL71856; AtDHAR1: A. thaliana, GenBank
accession number AY039590; OsDHAR2: O. sativa, Gen-
Bank accession number BAD38160


图3 PtoGSTF1和PtoGSTF2在毛白杨不同组织中的表达模式
泳道1–5分别表示叶、顶芽、茎、韧皮部和根组织; +和–分别表
示阳性和阴性对照。

Figure 3 Expression pattern of PtoGSTF1 and PtoGSTF2
gene in various tissues of Populus tomentosa
Lanes 1–5: Leaf, bud, stem, phloem and root tissues; +:
Positive control; –: Negative control

PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白对不同底物的催化
活性如表1所示。PtoGSTF1和PtoGSTF2对底物
CDNB、NBD-Cl、NBC和Cum-OOH具有酶活性, 而
对HED和DHA没有催化活性。PtoGSTF1和PtoGST-
F2对CDNB具有相似的酶活性, 分别为1.65 μmol·
min–1per mg和1.50 μmol·min–1per mg。PtoGSTF1
和PtoGSTF2对NBD-Cl的催化活性差别较大, 分别
为 23.88 μmol·min–1per mg和 1.37 μmol·min–1per
mg, 前者的活性是后者的17.4倍。对于底物NBC,
PtoGSTF1的酶活性是PtoGSTF2的4.94倍。然而对
于底物Cum-OOH, PtoGSTF2的酶活性是PtoGSTF1
的3.75倍。
2.6 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的酶动
力学分析
以NBD-Cl为底物, 对PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白进
行酶动力学分析, 结果如表2所示。米氏常数Km表示
酶对底物的亲和力。PtoGSTF1和PtoGSTF2的Km值
分别为0.35 mmol和0.14 mmol, 说明PtoGSTF1和
PtoGSTF2对底物NBD-Cl的亲和力均很高, 但是Pto-
GSTF2对底物NBD-Cl的亲和力比PtoGSTF1更高。
PtoGSTF1的kcat/Km值为4 805.17, 而PtoGSTF2的
kcat/Km值为84.52, 说明PtoGSTF1的催化效率远高于
PtoGSTF2。
2.7 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的热力
学稳定性分析
对PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白进行热力学稳定性分
析, 结果如图6所示。在35°C时PtoGSTF1仍可保持最
李迪等: 毛白杨两个 Phi 类 GST 基因的克隆及生化特性 253



图4 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白三维结构的比较
(A)和(B)分别显示PtoGSTF1(A)和PtoGSTF2(B)的三维结构, 蓝色代表β折叠; (C) 利用Profile-3D对模拟蛋白的评估结果; (D)
PtoGSTF1和PtoGSTF2的结构比较。图中绿色和红色分别代表PtoGSTF1和PtoGSTF2; 红色箭头显示PtoGSTF1和PtoGSTF2的结
构差异。

Figure 4 Structure modelling of PtoGSTF1 and PtoGSTF2 of Populus tomentosa
(A), (B) The structure of PtoGSTF1(A) and PtoGSTF2(B), β sheet is shown in blue color; (C) Evaluation of the structure of
PtoGSTF1 (green) and PtoGSTF2 (red) by Profile-3D program; (D) Structural comparison of PtoGSTF1 (green) and PtoGSTF2
(red), and the arrows in red indicate the difference of PtoGSTF1 and PtoGSTF2 structure.


表1 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的酶学活性
Table 1 Specific enzymatic activities of the recombinant PtoGSTF1 and PtoGSTF2 towards different substrates
Specific enzymatic activity (μmol·min–1per mg)
GSTs
CDNB NBD-Cl NBC Cum-OOH HED DHA
PtoGSTF1 1.65±0.09 23.88±3.08 3.46±0.06 0.04±0.01 n.d. n.d.
PtoGSTF2 1.50±0.06 1.37±0.02 0.70±0.04 0.15±0.01 n.d. n.d.



高活性的97%, 而PtoGSTF2仅能保持其最高活性的
49%。在45°C时, PtoGSTF1可保持最高活性的24%,
而PtoGSTF2则失去活性。这说明PtoGSTF1和Pto-
GSTF2蛋白的热力学稳定性具有较大差异; 与Pto-
GSTF2相比, PtoGSTF1是一个热力学稳定性较高的
蛋白, 在40°C以下都是稳定的。
254 植物学报 47(3) 2012


图5 PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的表达和纯化
泳道1为蛋白分子量标准; 泳道2为大肠杆菌全菌蛋白; 泳道3
和7分别为诱导表达PtoGSTF1和PtoGSTF2的全菌蛋白; 泳道
4和8分别为诱导表达PtoGSTF1和PtoGSTF2的全菌超声破碎
离心后的上清; 泳道5和9分别为诱导表达PtoGSTF1和Pto-
GSTF2的全菌超声破碎离心后的沉淀; 泳道6和10分别为纯化
后的PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白。

Figure 5 Overexpression and purification of recombinant
PtoGSTF1 and PtoGSTF2
Lane 1: Molecular mass markers; Lane 2: Total cellular ex-
tract from E. coli BL21; Lanes 3 and 7: Total cellular extracts
from induced bacteria containing recombinant PtoGSTF1 and
PtoGSTF2, respectively; Lanes 4 and 8: The supernatant
after ultrasonication and centrifugation of cells expressing
recombinant PtoGSTF1 and PtoGSTF2, respectively; Lanes
5 and 9: The cell pellet after ultrasonication and centrifugation
of cells expressing recombinant PtoGSTF1 and PtoGSTF2,
respectively; Lanes 6 and 10: The purified recombinant Pto-
GSTF1 and PtoGSTF2, respectively.


表2 毛白杨PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白对底物NBD-Cl的酶
动力学参数
Table 2 Kinetic constants of the recombinant PtoGSTF1
and PtoGSTF2 using NBD-Cl as substrates
GSTs Km
(mmol)
kcat
(S–1)
kcat/Km
(mmol–1·S–1)
PtoGSTF1 0.35±0.05 1 683.25 4 805.17
PtoGSTF2 0.14±0.01 11.83 84.52

2.8 讨论
谷胱甘肽转移酶在植物抗逆反应、细胞信号转导和植
物抗病等方面发挥着重要作用(Dixon et al., 2002;
Frova, 2003; Basantani and Srivastava, 2007)。我
们先前对毛果杨GST基因家族的研究发现, 毛果杨
中存在9个Phi类GST基因, 其中7个是组织构成性表
达基因(Lan et al., 2009)。而在本研究中, 我们发现


图6 PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的热力学稳定性

Figure 6 Thermal stability of recombinant PtoGSTF1 and
PtoGSTF2

克隆的2个Phi类GST基因在毛白杨的根、茎、叶、韧
皮部和顶芽组织中均有表达, 说明Phi类GST基因在
植物的生长发育中可能发挥着重要作用。
PtoGSTF1与毛果杨PtGSTF1是直系同源基因,
序列高度相似。我们先前已对PtGSTF1的生化性质进
行了研究(Lan et al., 2009), 结果对比发现PtoGST-
F1与毛果杨PtGSTF1对底物CDNB和NBC具有相似
的酶学活性, 但是PtoGSTF1对底物NBD-Cl的活性
比PtGSTF1高2.3倍, 2个蛋白对DHA都没有显示酶学
活性。有意思的是, PtoGSTF1和毛果杨PtGSTF1蛋
白对底物NBD-Cl的Km分别为 0.35±0.05 mmol和
0.32±0.03 mmol, 说明这2个蛋白对底物NBD-Cl具
有相同的亲和力, 但是由于PtoGSTF1对底物NBD-
Cl的转换数(kcat)比PtGSTF1高, 导致PtoGSTF1的催
化效率高于PtGSTF1, 说明在PtoGSTF1和PtGST-
F1催化NBD-Cl的反应中, 与底物结合并不是该催化
反应的限速步骤, 而与底物结合后所发生的电子转移
或者产物的释放可能是这2个酶催化反应的限速步
骤。
PtoGSTF2与毛果杨PtGSTF2也是直系同源基
因, 在蛋白序列上仅有2个氨基酸的差异, 对比Pt-
GSTF2的生化性质发现(Lan et al., 2009), PtoGST-
F2蛋白对底物CDNB、NBD-Cl和NBC的酶活性均高
于PtGSTF2。PtoGSTF2和PtGSTF2蛋白对底物NBD-
李迪等: 毛白杨两个 Phi 类 GST 基因的克隆及生化特性 255
Cl的Km分别为0.14±0.01 mmol和0.31±0.03 mmol,
说明PtoGSTF2蛋白对底物NBD-Cl的亲和力显著高
于PtGSTF2蛋白。因此, 酶催化活性和动力学参数分
析预示着毛白杨PtoGSTF2比毛果杨PtGSTF2蛋白
具有更为有效的催化能力。
谷胱甘肽转移酶(GST)基因家族可分为8个亚家
族, 分别是DHAR、Tau、Phi、Zeta、Theta、Lambda、
TCHQD和EF1Bγ(Basantani and Srivastava, 2007)。
植物Tau、Phi和Zeta类GST的晶体结构已被解析, 结
构显示所有植物GST的结构域均比较保守 (Neue-
feind et al., 1997a, 1997b; Thom et al., 2001, 2002;
Axarli et al., 2009)。蛋白结构比较发现PtoGSTF1和
PtoGSTF2两个蛋白的结构高度相似, 预示着这2个
蛋白具有相似的生化功能。实际上, 酶学活性测定结
果发现, PtoGSTF1和PtoGSTF2两个蛋白具有相似
的底物谱: 即对底物CDNB、NBD-Cl、NBC和Cum-
OOH都具有酶学活性, 而对HED和DHA均没有活性。
但是PtoGSTF1与PtoGSTF2对底物NBD-Cl、NBC和
Cum-OOH的活性差异较大, 例如对于底物NBD-Cl,
PtoGSTF1的酶活性是PtoGSTF2的17.43倍; 而对于
底物Cum-OOH, PtoGSTF2的酶活性是PtoGSTF1的
3.75倍。酶动力学分析发现, PtoGSTF2对NBD-Cl的
亲和力是PtoGSTF1的2.5倍。另外, 热力学稳定性测
定结果表明, PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白的热力学
稳定性有较大差异(图6)。这些生化功能的差异可能与
蛋白结构的微小变异相关。实际上, 蛋白结构比较发
现PtoGSTF1和PtoGSTF2两个蛋白仅仅在3个Loop
区域有变异(图4D), 这几处结构的变异可能引起生化
功能的改变。总之, 蛋白质结构预测和生化实验结果
预示着这2个蛋白可能存在功能上的分化。
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Molecular Characterization of Two Phi Glutathione S-transferases
from Populus tomentosa
Di Li1, Zhenxin Tang1, Haijing Liu2, Qingyin Zeng2, Hailing Yang1*
1College of Life Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
2State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100093, China
Abstract Plant glutathione S-transferases (GSTs) play important roles in stress tolerance and detoxification metabo-
lism. We cloned two Phi GST genes (PtoGSTF1 and PtoGSTF2) from Populus tomentosa. PtoGSTF1 and PtoGSTF2
encode a protein of 215 and 218 amino acid residues, with a calculated molecular mass of 24.32 and 24.57 kDa, respec-
tively. Genomic sequence analysis showed that PtoGSTF1 and PtoGSTF2 contained 2 introns. RT-PCR revealed
PtoGSTF1 and PtoGSTF2 constitutively expressed in P. tomentosa. Recombinant PtoGSTF1 and PtoGSTF2 proteins
were overexpressed in E. coli and purified by Ni-affinity chromatography. PtoGSTF1 and PtoGSTF2 showed enzymatic
activities towards the substrates CDNB, NBD-Cl, NBC and Cum-OOH. The affinity to substrate NBD-Cl was 2.5-fold
higher for PtoGSTF2 than PtoGSTF1, but the catalytic efficiency to NBD-Cl was 56.85-fold greater for PtoGSTF1 than
PtoGSTF2. PtoGSTF1 showed greater thermal stability than PtoGSTF2. These results indicate the functional divergence
between PtoGSTF1 and PtoGSTF2.
Key words cloning, enzyme activity, glutathione S-transferase, Populus tomentosa, protein structure
Li D, Tang ZX, Liu HJ, Zeng QY, Yang HL (2012). Molecular characterization of two Phi glutathione S-transferases from
Populus tomentosa. Chin Bull Bot 47, 248–256.
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* Author for correspondence. E-mail: yhailing@yahoo.com.cn
(责任编辑: 刘慧君)