全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (1): 11–27, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00011
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收稿日期: 2011-05-07; 接受日期: 2011-08-17
基金项目: 国家高技术研究发展计划(No.2007AA021403)和国家转基因生物新品种培育重大专项(No.2009ZX08009-060B)
* 通讯作者。E-mail: deng@ibcas.ac.cn
复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1
参与植物对ABA的反应
张兰军, 姬飞腾, 王丽丽, 亓岽东, 朱燕, 邓馨*
中国科学院植物研究所植物分子生理学重点实验室, 北京 100093
摘要 为揭示植物抗旱的调控机理 , 对复苏植物旋蒴苣苔 (Boea hygrometrica)的一个编码C2结构域小蛋白的基因
BhC2DP1进行研究。Real-time PCR和ProBhC2DP1:GUS报告基因检测显示, 该基因只在干旱早期和外源Ca2+处理0.5小时时
受诱导表达; 分别施加Ca2+螯合剂EGTA和逆境激素ABA均抑制该基因表达, 但二者同时处理则显著诱导其表达, 表明
ABA对该基因转录水平的调控是Ca2+依赖型的。过表达BhC2DP1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)对ABA的敏感性增强,
EGTA处理可消除其与野生型的差异, 表明Ca2+是BhC2DP1蛋白参与ABA反应所必需的。综上所述, ABA和Ca2+信号途径
的精细调控可能是决定干旱诱导旋蒴苣苔中BhC2DP1基因表达时间、丰度和功能的重要机制。
关键词 ABA, C2结构域, 干旱, 复苏植物
张兰军, 姬飞腾, 王丽丽, 亓岽东, 朱燕, 邓馨 (2012). 复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1参与植物对ABA的反
应. 植物学报 47, 11–27.
生物和非生物胁迫如强光、干旱、低温和病原菌
侵害等往往导致植物生长受抑制, 产量下降。在植物
适应各种生物和非生物胁迫的过程中, Ca2+作为重要
的第二信使 , 发挥着重要的作用 (McAinsh et al.,
1992; Bowler and Fluhr, 2000; Xiong et al., 2002;
Hetherington and Brownlee, 2004)。胁迫和激素信号
会引起胞质Ca2+含量发生震荡性变化, Ca2+浓度的震
荡触发植物细胞内一系列的信号转导过程, 进而实现
胁迫响应基因的诱导表达(Bush, 1993; Knight et al.,
1997)。各种Ca2+感受器(calcium sensor)通过与Ca2+
结合将信号转导至下游信号通路。根据结构域的不同,
可将Ca2+结合蛋白分为3类: 含EF-hands结构域的蛋
白(Kretsinger, 1980; Falke et al., 1994)、膜联蛋白
(annexin)(Concha et al., 1993; Weng et al., 1993)和
含有C2结构域的蛋白(Sutton et al., 1995; Essen et
al., 1996)。
C2结构域包含大约130个氨基酸残基, 最初发现
于蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)中(Coussens
et al., 1986), 目前已发现的包括磷脂酶(phospho-
lipases)和突触结合蛋白I (synaptotagmin I)在内的多
种蛋白中都含有C2结构域 (Kopka et al., 1998;
Merithew and Lambright, 2002; Schapire et al.,
2008; Yamazaki et al., 2008)。含C2结构域的蛋白大
多定位于细胞膜系统 , 在信号转导途径或膜运转
(membrane trafficking)中起作用(Cho and Stahelin,
2006)。研究发现, 含有C2结构域的PKC蛋白亚基受
Ca2+调控, 而缺少C2结构域的PKC蛋白亚基不依赖
于Ca2+ (Nishizuka, 1988)。在结合Ca2+的情况下, C2
结构域可与磷脂结合, 还可能与蛋白相互作用(Li et
al., 1995)。一些蛋白中的C2结构域可能已经失去了
结合Ca2+的能力, 只作为结构蛋白发挥作用。
利用X衍射分析突触结合蛋白I的C2A结构发现,
C2结构域的显著特征是其β-三明治结构。该结构由2
个4链的β折叠片形成, 加上顶端的3个loop和底部的
4个loop一起组成完整的C2结构域。Ca2+的结合发生
在顶端的3个loop上, 其中有4–5个Asp在Ca2+结合中
起配体作用, 可同时结合多个Ca2+; 成簇的Ca2+可能
通过改变结构的电平衡而促进脂质与C2结构域的结
合(Sutton et al., 1995)。因此含C2结构域的蛋白可能
在Ca2+触发的反应中发挥重要作用。在C2结构域中,
·研究论文·
12 植物学报 47(1) 2012
核心β-三明治结构比较保守, 而loop结构的保守性较
低, 尤其是顶端的loop1和底部的3个loop, 因此loop
可能决定了C2结构域的功能特异性 (Rizo and
Südhof, 1998)。
线虫和酵母中的一些跨膜蛋白含有3或4个C2结
构域 , 这些蛋白的生物学功能目前还不清楚(Rizo
and Südhof, 1998)。近来在植物中发现了一些仅含有
1个C2结构域的小蛋白 , 但对它们的报道还很少
(Kopka et al., 1998), 其功能尚未得到阐释。有报道
表明这些蛋白可能参与了逆境信号通路。在真菌诱导
或者施加Ca2+通透促进剂(ionophore)的条件下, 水
稻(Oryza sativa)OsERG1的转录水平增加, 并从胞
质转位到细胞膜上, 参与植物防御信号系统(Kim et
al., 2000, 2003a)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的
BAP1是膜相关蛋白, 参与Ca2+依赖的磷脂结合, 在
植物体内有多种功能, 如负调控植物的防御反应(过
表达BAP1增加了拟南芥对真菌的易感性)以及抑制
植物细胞的程序性死亡(Hua et al., 2001; Yang et
al., 2006)。水稻OsSMCP1在拟南芥中的过表达则增
加了植物对生物和非生物胁迫的抗性(Yokotani et
al., 2009)。
在干旱、盐和低温等非生物胁迫下, 植物体通过
激活脱落酸(abscisic acid, ABA)的合成途径及抑制
其降解途径来实现逆境激素ABA的积累。ABA参与多
种植物生长发育过程, 如抑制种子萌发、促进休眠和
抑制生长等(吴耀荣和谢旗, 2006)。在干旱和高盐等
胁迫条件下, ABA缺失突变体如aba1、aba2和aba3
等比野生型植物更容易枯萎和死亡, 而ABA超敏感突
变体era1对干旱胁迫的抗性增强, 说明ABA在植物的
胁迫耐受过程中发挥重要作用(Zhu, 2002)。目前对于
植物从感知胁迫信号到体内开始积累ABA之间的
信号转导过程尚不清楚, Ca2+信号途径和蛋白质磷
酸化可能参与了这个过程(Xiong et al., 2001; Zhu,
2002)。
复苏植物是一类能忍耐严重干旱胁迫的植物的
总称, 在失去自身95%的水分后仍能以一种类似休眠
的状态维持细胞活力, 在重新获得水分供应后几天内
迅速恢复生活状态。这类植物通常不具备明显的保水
机制和系统抗性, 研究发现它们主要是以维持细胞结
构和生物大分子及其复合物的稳定性来实现其耐旱
性(Wang et al., 2009a, 2009b)。我们前期利用我国
境内广泛分布的苦苣苔科复苏植物旋蒴苣苔(Boea
hygrometrica)进行了植物耐旱相关基因的筛选, 从
中发现了一个C2结构域蛋白编码基因的部分序列
(Wang et al., 2009a)。本文报道对该基因全长cDNA
的克隆、表达调控以及功能的研究, 以期揭示其在参
与复苏植物耐旱保护过程中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 植物材料和胁迫处理
复苏植物旋蒴苣苔(Boea hygrometrica (Bunge) R.
Br.), 俗称牛耳草, 采自北京植物园樱桃沟, 在培养室
中盆栽培养, 培养温度为25°C, 相对湿度为50%, 光
照周期为16小时/8小时。
将旋蒴苣苔停止浇水5天和14天进行干旱胁迫处
理, 在干旱14天之后再重新浇水进行复水处理3天,
取样后分别提取根和叶的RNA。另外, 取正常生长的
旋蒴苣苔的叶片分别用5 mmol·L–1CaCl2、5 mmol·L–1
MgCl2和H2O浸泡0.5小时、8小时和24小时后取样, 用
液氮迅速冷冻保存, 用于RNA提取。
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为Columbia生态
型。拟南芥种子经4°C保湿冷藏3天打破休眠后, 用
70%乙醇清洗1分钟, 用10%次氯酸钠消毒15分钟,
再用无菌水洗3–5次后播种于MS培养基上。6天后移
至土壤中生长, 培养温度为25°C, 光照周期为16小时
/8小时。
取MS培养基上生长6–10天的拟南芥幼苗分别用
5 mmol·L–1CaCl2、5 mmol·L–1EGTA、20 μmol·L–1
ABA和 60%PEG8000溶液浸泡 0.5小时 ; 或用 20
μmol·L–1ABA和5 mmol·L–1EGTA共同处理0.5小时;
或先用5 mmol·L–1EGTA处理0.5小时, 之后再用60%
PEG8000溶液处理0.5小时。取样, 用于GUS检测。
1.2 DNA和RNA的提取
取新鲜叶片或组织10–50 mg, 于液氮中研磨成粉末
后 , 加入 400 μL新配制的DNA提取缓冲液 (50
mmol·L–1Tris-HCl(pH7.6), 50 mmol·L–1EDTA (pH8.0),
100 mmol·L–1NaCl, 0.5%SDS), 剧烈震荡悬浮。65°C
水浴20分钟, 每5分钟混匀1次, 之后加入150 μL酚/
氯仿, 剧烈摇晃, 室温下放置2分钟。10 000–12 000 x
g离心5分钟, 取上清, 加入6倍体积的异丙醇或者2倍
张兰军等: 复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1参与植物对ABA的反应 13
体积的无水乙醇沉淀DNA。再离心15分钟, 去上清,
用70%乙醇冲洗沉淀1次, 小心倒去乙醇。离心, 去掉
残留乙醇, 晾干后, 将DNA溶于30–50 μL ddH2O中,
–20°C保存。
用RNA pure试剂盒(BioTeke)提取RNA。
1.3 BhC2DP1基因及其启动子的克隆
从脱水2小时的旋蒴苣苔叶片cDNA文库中筛选得到
脱水诱导表达的BhC2DP1 cDNA片段(Wang et al.,
2009a), 经5’RACE扩增得到全长cDNA。RNA反转录
所用基因特异性引物为BhC2DP1-race1: 5’-TTTCC-
TTCCATCCACC-3’, PCR反应引物分别为BhC2DP1-
race2: 5’-TGATTGGCAGAAACAAC-3’和Anchor pri-
mer-1: 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGG14-3’及
另外一对 BhC2DP1-race3: 5’-CATCCTCCATCC-
CAATCTCA-3’和Anchor primer-2: 5’-GGCCACG-
CGTCGACTAGTAC-3’。扩增程序为: 94°C预变性2
分钟, 运行35个循环(每个循环94°C变性30秒, 55°C
退火30秒, 72°C延伸1.5分钟), 最后72°C延伸10分
钟。
用QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit 提取旋蒴苣
苔基因组DNA, 用5’RAGE方法克隆得到BhC2DP1启
动子(Cormack and Somssich, 1997), 分别用EcoRI、
EcoRV、HindIII、SalI和BamHI对DNA进行酶切, 随
后进行2步PCR反应。引物分别为BhC2DP1-rage1:
5’-TGCGACTCTCCTGCACTTGAT-3’和Anchor pri-
mer-1: 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGG14-3’及
BhC2DP1-rage2: 5’-CTATCTTGCCTAAGAAGTCT-
G-3’和Anchor primer-2: 5’-GGCCACGCGTCGACT-
AGTAC-3’。
1.4 半定量RT-PCR和Real-time PCR
采用RT-PCR方法检测旋蒴苣苔中BhC2DP1在外源
CaCl2处理下的表达情况。基因特异性引物序列为
5’-GCCAGACAACCATCCATTTG-3’和 5’-TATGCT-
TTCCTTCCATCCAC-3’。PCR反应程序如下: 95°C
预变性5分钟; 94°C变性30秒, 55°C退火30秒, 72°C
延伸1分钟 , 30个循环 ; 72°C延伸10分钟。以18S
rRNA作为对照 , 所用引物序列为5’-TTGTGTTGG-
CTTCGGGATCGGAGTAAT-3’和 5’-TGCACCACC-
ACCCATAGAATCAAGAA-3’, 退火温度为58°C, 循
环数为24。
用Real-time PCR方法检测BhC2DP1在旋蒴苣
苔脱水-复水过程中、外源ABA和EGTA处理下以及在
转基因拟南芥中的表达情况。用oligo d(T)18 (TA-
KARA)进行反转录 , PCR所用引物序列为5’-GCC-
AGACAACCATCCATTTG-3’和 5’-TATGCTTTCCT-
TCCATCCAC-3’。以actin2为对照 , 引物序列为5’-
AGGAACACCCTGTTCTCCTGACTG-3’ 和 5’-CAG-
AGAAAGCACAGCCTGGATAG-3’。用MX3000P软
件进行相对定量分析, 比较不同处理的样品中BhC-
2DP1基因表达水平的高低。
1.5 转基因拟南芥的获得
用BhC2DP1的全长引物5’-CAGGATCCTTCAAGAT-
GATAGGAATC-3’和 5’-CAGTCGACATTAAAATAT-
GCTTTCC-3’, 扩增得到全长cDNA产物, 将其用内
切酶BamHI和SalI双酶切消化, 插入到同样酶切处理
过的植物表达载体 pBin19-35S-polyA(Liu et al.,
2009)中 , 构建 35S:BhC2DP1过表达载体。根据
BhC2DP1的启动子序列, 设计引物5’-TCGCTCGA-
GTTCAAAGTTATTTTATTCC-3’和5’-TAGTCTAGA-
CATCTTGAAATTTTTGGATG-3’, 从旋蒴苣苔基因
组DNA中扩增出启动子片段。将PCR产物用内切酶
XhoI和XbaI双酶切消化, 插入到用XbaI和SalI(XhoI
的同尾酶 )双酶切消化的 pBI121载体中 , 构建
ProBhC2DP1:GUS载体。分别将2个载体转化入大肠杆
菌, 挑选阳性克隆, 经测序验证序列正确。电击转化
农杆菌C58, 挑取阳性克隆用浸花法转化拟南芥
(Clough and Bent, 1998)。T1–T3代种子经50 mg·L–1
卡那霉素(Kan)筛选最终得到纯合转基因株系。
1.6 GUS酶活性的组织化学检测及定量分析
GUS报告基因酶活性采用组织化学染色法检测。将植
物浸入GUS染液(8 mL GUS histochemical buffer,
120 μL 50 mg·mL–1 x-Gluc, 2 mL methanol)后抽真空
15分钟 , 然后37°C下孵育14小时(Bertrand et al.,
2003)。经70%乙醇脱色数次, 在Nikon正置显微镜下
观察。
用分光光度计法检测GUS酶活性 (Jefferson,
1987; 陈雅蕙, 2005; 曾凡锁等, 2009)。GUS以对硝
基苯基 -β-D-葡萄糖醛酸苷 (P-nitrophenyl-β-D-glu-
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curonide, PNPG)为底物, 催化其水解, 生成对硝基苯
酚(P-nitrophenol), 在pH值为7.15时, 离子化的发色团
吸收波长为400–420 nm的光, 溶液呈黄色。根据反应
所生成的对硝基苯酚在415 nm下的吸光值计算GUS基
因表达活性。GUS基因表达活性以每毫克蛋白每分钟
水解PNPG生成1 nmol对硝基苯酚的酶量表示。
1.7 表型分析
在添加0.5 μmol·L–1ABA的MS培养基上观察和统计种
子萌发情况与子叶展绿情况。将MS培养基上正常生长
4天的拟南芥幼苗分别转移到以下培养基上垂直培养:
MS+0.5 μmol·L–1ABA、MS+40 mmol·L–1CaCl2、MS+5
mmol·L–1EGTA、MS+0.5 μmol·L–1ABA+5 mmol·L–1
EGTA、MS+PEG8000(40%)(van der Weele et al.,
2000; Verslues and Bray, 2004)。于2周之后观察表
型。用SPSS软件进行数据处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1 BhC2DP1基因的克隆
为鉴定复苏植物旋蒴苣苔干旱胁迫诱导早期表达的基
因, 我们构建了脱水2小时叶片的cDNA文库, 从中筛
选到434个受干旱诱导表达的克隆 (Wang et al.,
2009a)。序列分析显示, 其中一个克隆23–45编码一
个C2结构域的C-端部分序列(666 bp)。通过5’RACE
获得其cDNA 5’序列(395 bp), 拼接获得764 bp的
cDNA序列, 经分析确定其包含1个完整的CDS。该
cDNA开放读码框 (ORF)长度为465 bp, 5′-UTR和
3′-UTR分别为78 bp和220 bp, 编码一个含有154个
氨基酸残基的蛋白质 (图1), 理论分子量为17.453
kDa, 预测等电点为6.53。在Pfam数据库中进行结构
域搜索, 发现该蛋白仅在N-端有1个C2结构域, 占全
序列的60%, 除此之外无其它结构域, 因此命名为
BhC2DP1蛋白。
系统进化树分析结果表明, BhC2DP1蛋白属于
C2 ERG(elicitor responsive gene)亚家族(图2A), 这
个亚家族中有很多成员作为应激响应蛋白参与植物的
逆境早期信号事件(Kim et al., 2000, 2003a)。Clustal
W比对结果表明, BhC2DP1的C2结构域与植物中已
报道的一些蛋白的C2结构域相似性较高, 具有结合
Ca2+所需的5个天冬氨酸残基(D)和3个loop结构(图
2B)。在GenBank数据库中进行BLAST比对发现, 该




图1 BhC2DP1的序列分析
BhC2DP1的cDNA序列以及推导出来的氨基酸序列。C2结构域用下划线标注。

Figure 1 Sequence analysis of BhC2DP1
Nucleotide and deduced amino acid sequences of BhC2DP1. The putative C2 domain is underlined.

张兰军等: 复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1参与植物对ABA的反应 15
蛋白与葡萄 (Vitis vinifera)中的一个同源蛋白 (XP_
002283485)的序列一致性最高, 达到57%, 但在C2
结构域之外的序列相似性很小, 表明该蛋白是一个新
的C2结构域小蛋白。
2.2 BhC2DP1基因对脱水复水的响应
为了检测BhC2DP1对干旱的响应, 将旋蒴苣苔进行
干旱-复水处理, 分别在植物停止浇水5天(叶片相对含
水量接近70%, 叶片刚刚出现萎蔫现象)、14天(叶片
相对含水量小于5%, 叶片完全脱水卷曲)和复水3天
(叶片相对含水量基本接近100%)时取叶片和根, 提取
RNA, 用real-time PCR技术检测BhC2DP1在叶和根
中的表达变化情况。结果如图3A所示, 干旱失水导致
BhC2DP1表达量在叶片刚刚出现萎蔫现象时就显著
升高, 达到对照的3倍水平; 在干旱后期反而下降至
对照的1/52水平; 但复水后再次升高, 达到对照的
11倍。BhC2DP1在根中的表达情况如图3B所示 ,
其表达量在根失水5天时超过对照的3倍 ; 而在干
旱后期降至与对照表达量相当 ; 复水时再次升高 ,
为对照的9倍。BhC2DP1的mRNA可以快速响应植
物水分状态的变化而累积或降解 , 表明BhC2DP1
可能参与复苏植物旋蒴苣苔的早期脱水保护和复
水后的快速修复过程。
2.3 BhC2DP1启动子分析
为了深入了解BhC2DP1基因的表达和调控, 我们通
过5’RAGE方法获得了长度为1 113 bp的BhC2DP1启
动子序列。用PLACE软件分析发现, 该序列包含多个
干旱响应元件以及光、热、低温和伤害等环境信号响
应元件, ABRE-like/related元件和ARR1AT等激素信
号响应元件, 以及MYB、MYC、WRKY、bZIP等转录
因子的结合序列(表1)。在BhC2DP1启动子上还发现

表1 BhC2DP1上游调控序列重要顺式作用元件分析
Table 1 Some important cis-acting regulatory elements in the upstream regulatory sequences of BhC2DP1
Name of cis-acting
element
Sequence of
cis-acting element
Function of cis-acting element Position
ABRE-like ACGTG ABRE-like sequence
Early responsive to dehydration
–230, –1 112
ABRE-CE MACGYGB

ABRE-related sequence
Ca2+-responsive upregulated
–231, –1 113
ACGTATERD1 ACGT Required for etiolation-induced expression of
erd1 (early responsive to dehydration)
–229, –1 111
AGCBOXNPGLB AGCCGCC An elicitor responsive factor binding site –760
ARR1AT NGATT A cytokinin-regulated transcription factor
binding element
–416, –480 etc. (four sites in total)
CACTFTPPCA1 YACT Mesophyll expression module 1 –46, –51 etc. (eight sites in total)
CCAATBOX1 CCAAT Heat responsive –336, –690 etc. (four sites in total)
CGCGBOXAT VCGCGB Ca2+-/calmodulin binding site –998, –999 etc. (three sites in total)
DPBFCOREDCDC3 ACACNNG bZIP transcription factors DPBF-1/2 binding site –858
GT1CONSENSUS GRWAAW Light regulated –812, –951 etc. (five sites in total)
IBOXCORE GATAA Light regulated –239, –397 etc. (four sites in total)
LTRE1HVBLT49 CCGAAA Low temperature responsive element –1 016
MYBCORE CNGTTR MYB binding site
Dehydration responsive
–903, –970
MYB1LEPR GTTAGTT Defense related –507
MYBST1 GGATA MybSt1 binding site –75, –858
MYCCONSEN-
SUSAT
CANNTG MYC recognition site
Dehydration responsive
–244, –854 etc. (three sites in total)
WBOXATNPR1 TTGAC Recognized specifically by salicylic acid
(SA)-induced WRKY DNA binding proteins
–130, –154 etc. (five sites in total)
WBOXNTERF3 TGACY Wounding responsive –186, –248 etc. (four sites in total)
WRKY71OS TGAC WRKY71(a transcriptional repressor of the
gibberellin signaling pathway) binding site
–153, –211 etc. (five sites in total)
PLACE用于启动子分析(Prestridge, 1991; Higo et al., 1999)。M=C/A; Y=T/A; B=T/C/G; N=G/A/C/T; V=A/C/G; R=A/G; W=A/T。
PLACE was used for promoter analysis (Prestridge, 1991; Higo et al., 1999). M=C/A; Y=T/A; B=T/C/G; N=G/A/C/T; V=A/C/G;
R=A/G; W=A/T.
16 植物学报 47(1) 2012
了3个拷贝的Ca2+/Calmodulin结合序列和2个同时响
应ABA和Ca2+的ABRE-CE元件(Kaplan et al., 2006),
表明BhC2DP1基因的表达可能受外源环境信号、
内源激素信号和Ca2+第二信使等在转录水平的共同
调控。
2.4 BhC2DP1基因对外源ABA和Ca2+的响应
为了解BhC2DP1在转录水平上的调控机制, 我们利
用半定量RT-PCR和real-time PCR手段检测了外源
ABA和Ca2+处理下该基因的诱导表达情况。结果显示
BhC2DP1受Ca2+诱导表达, 外源Ca2+处理旋蒴苣苔
叶片0.5小时, BhC2DP1诱导表达量最大, 随后降至
极低水平(图3C)。而对照组(Mg2+和H2O处理)中Bh-
C2DP1表达量很低, 在检测的3个时间点没有检测到
诱导表达。外源施加胞外Ca2+螯合剂EGTA 0.5小时明
显抑制了BhC2DP1的表达, 说明BhC2DP1基因对
Ca2+的响应是特异性且迅速的。与此相反, 外源ABA
处理明显地抑制了BhC2DP1的表达, 在处理0.5小时
后表达量就下降近一半, 而且这种抑制作用随着处理
时间的延长而加大 , 在24小时后降至未处理前的



张兰军等: 复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1参与植物对ABA的反应 17
1/32(图3D)。值得注意的是, EGTA可以显著地逆转
ABA对BhC2DP1转录的抑制作用 , 同时外源施加
ABA和EGTA 0.5小时后BhC2DP1的转录水平达到未
处理对照的1.5倍, 而较单独ABA或EGTA处理的叶
片提高1–2倍(图3E)。
2.5 组织化学法检测ProBhC2DP1:GUS在转基因拟
南芥中的表达
为了研究BhC2DP1基因的表达调控 , 我们构建了
ProBhC2DP1:GUS植物表达载体并转化拟南芥。T2代纯
合体幼苗用于GUS染色分析, 结果如图4所示。在去皮
的种子和4天的幼苗(2片子叶)中, 较强的GUS染色信
号出现在子叶前端, 在下胚轴部分也有GUS信号的表
达(图4A, B)。6天和10天的幼苗(2–4片真叶)中, GUS
在子叶、下胚轴和根中均有表达, 且在根中表达较强,
但真叶中检测不到GUS信号(图4C, D)。在成熟植物中
基本不能检测到GUS信号。
以2–4片真叶期的幼苗为材料, 我们进一步研究
了BhC2DP1启动子对干旱、ABA和Ca2+信号的响应。
实验结果表明, 外源施加CaCl2主要提高了子叶顶部
和茎尖的GUS信号强度(图4E); EGTA处理主要抑制
了子叶和根中的GUS信号强度, 而对下胚轴的GUS
表达基本无影响(图4F)。外源ABA处理主要抑制了子
叶和根下半部分的GUS信号强度, 而对下胚轴和根上
半部的GUS表达没有明显影响(图4G); 而一旦添加钙
离子螯合剂EGTA则可以恢复GUS报告基因在子叶和
根的下半部中的表达强度(图4H)。利用PEG模拟干旱
胁迫条件, 发现在真叶中可以检测到明显的GUS信

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图2 含C2结构域的蛋白的进化树构建以及序列保守性分析
(A) 基于BhC2DP1蛋白和来自不同亚家族的含C2结构域的同源蛋白构建的进化树。用Bioedit和Mega 4软件建树, 用邻接法
(neighbor-joining method)计算, 用bootstrap(1 000 replicates)进行评估。图中各蛋白序列的来源物种和GenBank序列号为: 玉米
ZmERP1(Zea mays, NP_001148526.1)、高粱SbERP1(Sorghum bicolor, XP_002456619.1)、水稻Os-FIERG2(Oryza sativa,
AAC04628.1)、水稻Os-FIERG1(O. sativa, AAC04627.1)、拟南芥AtERP2(Arabidopsis thaliana, AAG52148, 1WFJ)、大豆
GmERP1(Glycine max, ACU14574.1)、 鹰嘴 豆 CaERP1(Cicer arietinum, CAA10133.1) 、拟 南芥 AtERP1(A. thaliana,
NP_191107.1)、南瓜Cmpp16-1(Cucurbita maxima × C. moschata, ACA02977.1)、拟南芥AtGAP1(A. thaliana, AAM64708.1)、水
稻OsGAP1(O. sativa, NP_001062683.1)、北美云杉PsGAP1(Picea sitchensis, ABK23084.1)、水稻OsSMCP1(O. sativa,
BAF20631.2)、北美云杉PsGAP2(P. sitchensis, ABR16527.1)、拟南芥AtBAP1(A. thaliana, Q941L2.1)、玉米ZmSRC2-1(Z. mays,
ACN27314.1)、朝天椒CaSRC2-1(Capsicum annuum, ABE98328.1)和水稻OsSRC2-1(O. sativa, AAK53845.1); (B) BhC2DP1蛋
白与植物中一些代表性的C2结构域蛋白的同源性比对。蛋白的来源物种和GenBank序列号: 拟南芥AtC2-1(A. thaliana, AAG52148,
残基1–95)、水稻OsERG1a(O. sativa, AAP47157.1, 残基1–103)和玉米ZmC2-1(Z. mays, AAB06331.1, 残基1–94)。其余蛋白同
(A)。黑色和浅灰色部分分别代表氨基酸的一致性和相似性。其中可能在Ca2+结合中发挥作用的5个天冬氨酸残基用#标注, 3个钙结
合区域loop CBR1–3用横线标注。

Figure 2 Phylogenic tree of C2 domain proteins and sequence conservation analysis
(A) Phylogenic tree of C2 domain proteins from different plants, including ZmERP1 (Zea mays, NP_001148526.1), SbERP1
(Sorghum bicolor, XP_002456619.1), Os-FIERG2 (Oryza sativa, AAC04628.1), Os-FIERG1 (O. sativa, AAC04627.1), AtERP2
(Arabidopsis thaliana, AAG52148, 1WFJ), GmERP1 (Glycine max, ACU14574.1), CaERP1 (Cicer arietinum, CAA10133.1),
AtERP1 (A. thaliana, NP_191107.1), Cmpp16-1 (Cucurbita maxima × C. moschata, ACA02977.1), AtGAP1 (A. thaliana,
AAM64708.1), OsGAP1 (O. sativa, NP_001062683.1), PsGAP1 (Picea sitchensis, ABK23084.1), OsSMCP1 (O. sativa,
BAF20631.2), PsGAP2 (P. sitchensis, ABR16527.1), AtBAP1 (A. thaliana, Q941L2.1), ZmSRC2-1 (Z. mays, ACN27314.1),
CaSRC2-1 (Capsicum annuum, ABE98328.1), and OsSRC2-1 (O. sativa, AAK53845.1); (B) Comparison of the deduced amino
acid sequence of BhC2DP1 with representative C2 domain proteins from various plants, including AtC2-1 (A. thaliana,
AAG52148, residues 1–95), OsERG1a (O. sativa, AAP47157.1, residues 1–103) and ZmC2-1 (Z. mays, AAB06331.1, residues
1–94). The rest proteins are the same as in (A). The amino acids showing identity and similarity are shaded, respectively, in dark
and light gray. The putative Ca2+ binding aspartate residues are indicated by “#”. 3 loops of calcium binding regions (CBR1–3)
are indicated by lines.

18 植物学报 47(1) 2012

图3 BhC2DP1对干旱、ABA、Ca2+和EGTA的响应
(A) BhC2DP1在脱水和复水的旋蒴苣苔叶片中的表达变化; (B) BhC2DP1在脱水和复水的旋蒴苣苔根中的表达变化; (C) BhC2DP1
对外源Ca2+的响应。5 mmol·L–1CaCl2处理旋蒴苣苔0.5小时、8小时和24小时, 以5 mmol·L–1MgCl2处理和H2O处理作为对照; (D)
BhC2DP1对外源ABA的响应。20 μmol·L–1ABA处理旋蒴苣苔0.5小时、8小时和24小时; (E) BhC2DP1分别对20 μmol·L–1ABA、5
mmol·L–1EGTA以及20 μmol·L–1ABA和5 mmol·L–1EGTA共同处理0.5小时的响应

Figure 3 Expression analysis of BhC2DP1 in response to dehydration, ABA, exogenous Ca2+ and EGTA in the resurrection
plant Boea hygrometrica
(A) Expression of BhC2DP1 in response to dehydration and rehydration in leaves; (B) Expression of BhC2DP1 in response to
dehydration and rehydration in roots; (C) Expression analysis of BhC2DP1 in response to exogenous Ca2+. Quantitative RT-PCR
analysis of BhC2DP1 was performed with total RNA isolated from B. hygrometrica leaves under treatment of 5 mmol·L–1CaCl2 for
indicated hours. 5 mmol·L–1MgCl2 and H2O treatment served as controls; (D) Expression analysis of BhC2DP1 in response to 20
μmol·L–1ABA for indicated hours; (E) Expression analysis of BhC2DP1 in response to 20 μmol·L–1ABA, 5 mmol·L–1EGTA, and 20
μmol·L–1ABA plus 5 mmol·L–1EGTA for 0.5 h.


号, 表明BhC2DP1启动子受PEG诱导表达(图4I); 但
如果提前用EGTA进行预处理, 则在除下胚轴之外的
其它部位均无法检测到GUS信号(图4J)。这些现象与
Real-time PCR的检测结果相一致。
张兰军等: 复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1参与植物对ABA的反应 19



图4 组织化学染色法检测转基因拟南芥中GUS酶活性
(A) 去皮的种子, Bar=100 μm; (B) 4天的幼苗; (C) 6天的幼苗; (D) 10天的幼苗; (E) 6天的幼苗经5 mmol·L–1CaCl2处理0.5小时; (F) 6
天的幼苗经5 mmol·L–1EGTA处理0.5小时; (G) 6天的幼苗经20 μmol·L–1ABA处理0.5小时; (H) 6天的幼苗经20 μmol·L–1ABA+5
mmol·L–1EGTA处理0.5小时; (I) 10天的幼苗经60%PEG8000处理0.5小时; (J) 10天的幼苗先经5 mmol·L–1EGTA处理0.5小时, 再经
60%PEG8000处理0.5小时。(B)–(J) Bar=1 mm

Figure 4 Histochemical staining of GUS activity in transgenic Arabidopsis
(A) Seed without seed coat, Bar=100 μm; (B) 4-day-old seedling untreated; (C) 6-day-old seedling untreated; (D) 10-day-old
seedling untreated; (E) 6-day-old seedling treated with 5 mmol·L–1CaCl2 for 0.5 h; (F) 6-day-old seedling treated with 5 mmol·L–1
EGTA for 0.5 h; (G) 6-day-old seedling treated with 20 μmol·L–1ABA for 0.5 h; (H) 6-day-old seedling treated with 20 μmol·L–1
ABA and 5 mmol·L–1EGTA for 0.5 h; (I) 10-day-old seedling treated with 60% PEG8000 for 0.5 h; (J) 10-day-old seedling first
treated with 5 mmol·L–1EGTA, then treated with 60% PEG8000 for 0.5 h. (B)–(J) Bar=1 mm


20 植物学报 47(1) 2012
2.6 ProBhC2DP1:GUS在转基因拟南芥中表达的定
量分析
为进一步检测转基因拟南芥中ProBhC2DP1:GUS的表达
情况, 对不同处理下转基因拟南芥进行GUS定量分
析, 结果如图5所示。经CaCl2处理后, GUS活性达到
未处理的1.4倍, 而经EGTA处理后, GUS活性明显降
低, 约降至未处理的1/3。ABA处理也使GUS活性降低
为未处理的1/3左右, 但是EGTA和ABA共同处理则使
GUS活性大幅提高, 达到未处理植株的1.5倍, 表明
ABA对BhC2DP1的转录抑制可能依赖于Ca2+, 又与
Ca2+信号相拮抗。PEG处理也能提高GUS活性, 但在
EGTA预处理的幼苗中GUS活性不能被PEG提高, 保
持在与EGTA处理相同的水平 , 表明PEG对Bh-
C2DP1的诱导可能依赖于Ca2+信号。
2.7 过表达BhC2DP1拟南芥的表型分析
为了解BhC2DP1蛋白的功能, 我们构建了35S:BhC-
2DP1植物表达载体, 并得到3个转基因拟南芥纯合株
系, 分别为OE1-1、OE2-1和OE6-5。对这3个株系中
BhC2DP1的表达量进行分析 , 发现转基因植物中
BhC2DP1有较高水平的表达, 其中OE1-1和OE2-1表
达量较OE6-5高(图6A)。因此后续分析均以OE1-1和
OE2-1为研究材料。
为了检测BhC2DP1在植物抗逆性中的作用, 我
们首先检测了其过表达株系在PEG模拟干旱胁迫下
的表型(图7B)。结果发现, 40%PEG处理显著抑制了
植物的生长, 相对于野生型植株子叶发黄的严重胁迫
表型而言, 2个BhC2DP1过表达株系幼苗的子叶大多
保持绿色, 部分植株真叶伸展, 存活率高于野生型(图
7H), 但差异不显著。
为了检测BhC2DP1对ABA的敏感性, 我们观察
了转基因植物种子在含ABA的培养基上的萌发情况。
结果表明, OE1-1和OE2-1的种子萌发速率和萌发率
与野生型无差异(图6B, D)。而在萌发之后的子叶转绿
过程中相比于野生型受到更为严重的抑制(图6C, E),
播种后14天, 子叶展开变绿的比例仅为5%左右, 而
同期的野生型比例可达30%, 表现出ABA超敏感表
型。另外, 将在正常培养基上生长4天的小苗转移至添
加0.5 μmol·L–1ABA的培养基上垂直培养, 2周之后观



图5 不同处理下转基因拟南芥中GUS酶活力比较
具体处理条件同图4。

Figure 5 Comparison of GUS activity in transgenic Arabi-
dopsis under different treatments
Each treatment was performed according to Figure 4.


察表型, 发现ABA对转基因株系的根系生长抑制也较
野生型严重。OE1-1平均根长为(1.55±0.27) cm, OE2-
1平均根长为(1.20±0.36) cm, 这2个株系的植物大多
数有2个侧根分支, 而野生型根长为(1.90±0.43) cm,
侧根数基本上为4个, 也表明BhC2DP1过表达株系的
幼苗根系生长对ABA的敏感性超过野生型(图7C, G)。
这些结果说明BhC2DP1蛋白可能参与了ABA调控植
物生长的反应。ABA对BhC2DP1转基因植物根系生长
的抑制可被外源施加EGTA所逆转, 即当培养基中同
时存在ABA和EGTA时, 野生型植物根系长度与单独
施加ABA时相似, 但OE1-1和OE2-1的根系长度恢复
至与野生型根长接近的水平, 不再表现出对ABA的超
敏感(图7D, G), 表明BhC2DP1过表达株系对ABA的
超敏感性可能是通过Ca2+介导的。
另外ABA和EGTA的同时施加导致植物根系弯
曲, 向地性丧失, 但这方面的影响在转基因植物和野
生型对照间没有显著差别(图7D), 说明BhC2DP1可
能不参与Ca2+介导的植物向地性反应。
同时, 我们还检测了CaCl2处理对BhC2DP1过表
张兰军等: 复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1参与植物对ABA的反应 21


图6 过表达BhC2DP1的转基因拟南芥对ABA的敏感性分析
(A) BhC2DP1在不同转基因拟南芥株系中的表达量; (B) 转基因拟南芥在含0.5 μmol·L–1ABA的培养基上的萌发率; (C) 转基因拟南
芥在含0.5 μmol·L–1ABA的培养基上的子叶展绿比例; (D) 转基因拟南芥种子在含0.5 μmol·L–1ABA的MS培养基上的萌发表型观察;
(E) 转基因拟南芥幼苗在含0.5 μmol·L–1ABA的MS培养基上的子叶展绿表型观察。Bar=1 cm

Figure 6 ABA sensitivity analysis of 35S: BhC2DP1 transgenic Arabidopsis lines
(A) Expression levels of BhC2DP1 in different transgenic Arabidopsis lines overexpressing BhC2DP1; (B) The germination rate
of transgenic Arabidopsis seeds on MS medium containing 0.5 μmol·L–1ABA; (C) The ratio of transgenic Arabidopsis seedlings
with green cotyledons on the 14th day after germination on MS medium containing 0.5 μmol·L–1ABA; (D) Transgenic Arabidopsis
seeds on MS medium containing 0.5 μmol·L–1ABA; (E) Transgenic Arabidopsis seedlings with green cotyledons on the 14th day
after germination on MS medium containing 0.5 μmol·L–1ABA. Bar=1 cm
22 植物学报 47(1) 2012


图7 过表达BhC2DP1的转基因拟南芥和野生型对照在不同处理下的根长比较
(A) MS对照; (B) 40%PEG8000处理; (C) 0.5 μmol·L–1ABA处理; (D) 0.5 μmol·L–1ABA+5 mmol·L–1EGTA处理; (E) 40 mmol·L–1
CaCl2处理; (F) 5 mmol·L–1EGTA处理; (G) 不同处理下转基因植物和野生型对照在垂直培养条件下根长的比较; (H) 40%PEG8000
胁迫下转基因拟南芥和野生型对照的绿苗率。Bar=1 cm

Figure 7 Root length comparison of Arabidopsis BhC2DP1 transgenic lines and wild-type plants grown under different treat-
ments
(A) Arabidopsis seedlings grown on MS plate; (B) Arabidopsis seedlings grown on MS plate with 40% PEG8000; (C) Arabidopsis
seedlings grown on MS plate with 0.5 μmol·L–1ABA; (D) Arabidopsis seedlings grown on MS plate with 0.5 μmol·L–1ABA and 5
mmol·L–1EGTA; (E) Arabidopsis seedlings grown on MS plate with 40 mmol·L–1CaCl2; (F) Arabidopsis seedlings grown on MS
plate with 5 mmol·L–1EGTA; (G) Root length of different Arabidopsis lines grown under 0.5 μmol·L–1ABA, 0.5 μmol·L–1ABA+5
mmol·L–1EGTA, 5 mmol·L–1EGTA, and 40 mmol·L–1CaCl2 treatment; (H) Ratio of green seedlings of different Arabidopsis lines
grown under 40% PEG8000 treatment. Bar=1 cm


达转基因植物生长的影响。结果表明, 40 mmol·L–1的
Ca2+稍微抑制植物根系的生长, 但在转基因植物和野
生型间没有差异(图7E, G), 表明该基因可能不直接参
与Ca2+调控植物生长的反应。与此相反, Ca2+螯合剂
EGTA的施加基本不影响侧根数目, 但导致植物根系
生长受到抑制, 向地性也有一定的改变, 但这些影响
张兰军等: 复苏植物旋蒴苣苔C2结构域小蛋白BhC2DP1参与植物对ABA的反应 23
在BhC2DP1转基因植物与野生型之间没有明显差异
(图7F, G), 进一步表明BhC2DP1可能不参与Ca2+介
导的根系生长和向地性反应。
3 讨论
本文报道了一个从复苏植物旋蒴苣苔中获得的新的
C2结构域小蛋白BhC2DP1。将BhC2DP1与已报道的
含C2结构域的蛋白进行同源性比对发现, 与其序列
相似性较高的蛋白大多属于C2 ERP亚家族。这一亚
家族中的成员多与植物抗逆性相关, 如水稻OsERG1
受真菌诱导表达, 参与水稻的防御信号系统(Kim et
al., 2000, 2003a)。本文报道的C2结构域小蛋白
BhC2DP1在干旱早期诱导表达, 并参与植物对逆境
激素ABA的反应, 与其ERP亚家族同源蛋白的功能相
似。对过表达BhC2DP1拟南芥的分析表明, 该基因过
表达不影响种子的萌发, 但加剧ABA对幼苗转绿和根
生长的抑制(图6, 图7), 表明该基因参与ABA对植物
生长的调控过程。EGTA可消除BhC2DP1过表达植株
对ABA的敏感性, 减轻ABA对过表达植株根系生长的
抑制, 表明该基因是以一种Ca2+依赖的方式在ABA调
控植物生长的反应中发挥作用。这是首次报道仅含C2
结构域的小蛋白参与ABA介导的生长调控, 为此类蛋
白功能的深入解析提供了新的实验证据。
通过对PKC和磷脂酶C(PLC)等含C2结构域的蛋
白进行研究, Cho等认为C2结构域是可以与Ca2+结合
的膜定位序列(Cho and Stahelin, 2006)。C2结构域顶
端3个loop中有4–5个Asp可以在Ca2+结合中起配体作
用, 而Ca2+可能通过改变结构的电平衡而促进脂质与
C2结构域的结合(Sutton et al., 1995), 因此Ca2+的结
合会影响含C2结构域的蛋白对脂类分子的选择性结
合, 进而改变该蛋白的定位和功能(Cho and Stahelin,
2006)。目前发现的C2结构域有些可能与Ca2+有关,
在结合Ca2+的基础上与其它脂质、蛋白或者小分子物
质结合, 如OsERG1和BAP1(Kim et al., 2003a; Yang
et al., 2006); 而有些C2结构域可能与Ca2+无关, 经
过长期的分子进化, 只在有机体内发挥结构蛋白的功
能(Rizo and Südhof, 1998)。本文报道的BhC2DP1过
表达可导致转基因植物在ABA培养基上的绿苗率降低
以及根的长度变短, 但EGTA的施加则使ABA对转基
因植物根长的抑制作用得以回复到野生型对照的水
平, 表明BhC2DP1促进ABA抑制拟南芥生长的反应
是依赖于Ca2+的。但是Ca2+的作用方式仍属未知 ,
Ca2+既可能通过直接与C2结构域的结合而影响Bh-
C2DP1与膜脂的结合或在膜上的定位(Sutton et al.,
1995); 也可能通过与其它Ca2+结合蛋白如钙调蛋白
(calmodulin)、Ca2+依赖的蛋白激酶(Ca2+-dependent
protein kinases, CDPK)或者蛋白磷酸酶 (protein
phosphatases)等的结合而实现其功能 (Kretsinger,
1980; Falke et al., 1994)。
Ca2+作为细胞多种信号通路中很重要的第二信
使, 在植物适应各种生物和非生物胁迫的过程中发挥
重要作用(McAinsh et al., 1992; Bowler and Fluhr,
2000; Xiong et al., 2002; Hetherington and
Brownlee, 2004)。胁迫条件尤其是干旱、低温和盐害
会导致胞内Ca2+浓度升高(Chinnusamy et al., 2004),
起始一系列蛋白磷酸化级联反应MAPK(mitogen-
activated protein kinase), 最终激活一些对细胞具有
保护作用的蛋白以及一些控制应激调节基因表达的转
录因子。这些应激调节基因编码的蛋白往往参与产生
一些植物激素, 如ABA、乙烯和水杨酸等, 而这些植
物激素能够起始植物体内第二轮的信号转导过程, 再
次引发植物体内Ca2+水平的变化(Bush, 1993; Knight,
1999; Sanders et al., 1999)。一些可以与Ca2+结合的
蛋白如钙调蛋白可以通过感受Ca2+变化并激活MAPK
途径来调控目的基因的表达(Dolmetsch et al., 2001)。
也有报道称CDPK能直接进入核内, 激活靶基因的表
达 (Patharkar and Cushman, 2000)。但是过表达
BhC2DP1的拟南芥在添加外源Ca2+和EGTA的培养
基上的生长表型与野生型植株没有明显差异, 表明
BhC2DP1可能不直接参与Ca2+信号介导的反应。
我们在BhC2DP1基因的启动子中发现了多个
ABRE-CE、钙响应元件和CAM结合元件等介导
Ca2+信号的顺式作用元件(表1), 表明BhC2DP1可
能是Ca2+结合蛋白所调控的靶基因。RT-PCR和
ProBhC2DP1:GUS报告基因检测都发现5 mmol·L–1外源
CaCl2对BhC2DP1的表达产生诱导作用, 而EGTA处
理抑制了BhC2DP1的表达, 表明BhC2DP1的转录水
平受Ca2+信号调控诱导。旋蒴苣苔在干旱处理5天和
复水3天时 , BhC2DP1的表达量都大幅增高 , 说明
BhC2DP1参与了旋蒴苣苔快速脱水和复水的响应机
制。与此相一致, 在PEG模拟干旱胁迫条件下0.5小
24 植物学报 47(1) 2012
时 , ProBhC2DP1:GUS转基因拟南芥真叶出现明显的
GUS信号, 表明干旱诱导BhC2DP1基因在真叶中表
达 , 而这种诱导会被EGTA前处理阻断 , 表明Bh-
C2DP1对干旱诱导的快速响应是依赖于Ca2+的。
另外, 值得注意的是, BhC2DP1的表达受干旱早
期和Ca2+的诱导, 却被ABA抑制, 表明BhC2DP1的转
录可能受到ABA和Ca2+信号转导途径的精细调节。干
旱可直接引起Ca2+浓度的升高, 这个过程早于ABA的
积累(Knight, 1999; Sanders et al., 1999), 可能是
BhC2DP1受干旱早期诱导表达的主要调控点。随后,
干旱导致植物体内ABA逐渐积累, ABA进一步引起
Ca2+震荡, ABA和Ca2+的拮抗作用有效抑制BhC2DP1
转录水平的进一步增加, 从而有助于在干旱后期过程
中稳定该基因的转录水平。而当细胞吸水时, 胞质
Ca2+变化再次出现 , ABA浓度下降 , 于是导致了
BhC2DP1转录水平的再次上升。前人的研究已经证实
ABA是参与植物多种胁迫反应过程的“逆境激素”, 尤
其是植物干旱应答反应中的重要信号物质。植物干旱
相关基因中有一大部分是通过依赖于ABA的信号途径
调控表达的, 但也有部分干旱诱导的关键基因是不依
赖于ABA信号途径的, 如DREB2和ZFHDR等(Naka-
shima et al., 2009)。甚至有的ABA信号途径的关键成
员, 包括6个ABA受体编码基因(PYL5、PYL8、PYL6、
PYL4、PYL1和PYR1)的表达受到ABA的强烈抑制,
其中PYL5和PYL8均已被证明其过表达可导致转基因
植物对ABA的敏感性增加, 表明它们在ABA诱发的反
应中具有重要功能。在干旱早期(0.25小时), PYL8、
PYL6和PYL4的转录水平均有一定程度的上调, PYL5
在干旱处理24小时表达增强(Winter et al., 2007)。它
们这种受干旱诱导、ABA抑制的表达方式及过表达增
加转基因植物对ABA的敏感性均与BhC2DP1非常相
似, 表明ABA对在ABA和干旱反应中起作用的基因的
抑制是一种常见的反馈调节, 可能对防止ABA信号的
过度放大有重要意义。
研究发现, 干旱和渗透胁迫可诱导一些依赖于
Ca2+的ABA信号途径的负调控因子 (如CIPK15和
SCaBP5/CBL等)的表达(Guo et al., 2002; Kim et al.,
2003b), 因此我们推测ABA和Ca2+对BhC2DP1基因
转录水平的不同调控效果可能通过这些依赖于Ca2+的
ABA信号途径的负调控因子实现 , 也可能通过与
BhC2DP1启动子上的某种元件结合的ABA信号途径
的负调控因子(如AD1A/WRKY40)和与Ca2+响应元件
/CAM结合元件结合的Ca2+结合蛋白之间的相互作用
而实现(Shang et al., 2010)。事实证明, BhC2DP1启
动子上存在多个WRKY转录因子结合序列。Kaplan等
(2006)报道 , ABA响应元件 (ABRE; CACGTG[T/C/
G])及耦合元件(coupling element; [C/A]ACGCG[T/
C/A])均可介导胞质Ca2+震荡诱导的转录结合, 因此
ABA和Ca2+在BhC2DP1基因转录调控上的拮抗作用
也可能通过ABA信号途径的负调控因子和钙信号途径
的正调控因子与BhC2DP1启动子上的3个ABRE-CE
元件的竞争性结合来实现。Liao等 (2008)在大豆
(Glycine max)中发现了在ABA信号转导途径中起负
调控因子作用且能与ABRE结合的3个bZIP转录因子。
更深入地研究BhC2DP1启动子上的ABA和Ca2+信号
相关元件、相应转录因子以及转录因子之间的相互作
用将为阐明C2结构域小蛋白在逆境反应中的作用及
逆境基因表达的调控机制提供依据。
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A Small C2-domain Protein from the Resurrection Plant Boea hy-
grometrica Promotes Plant Responses to Abscisic Acid
Lanjun Zhang, Feiteng Ji, Lili Wang, Dongdong Qi, Yan Zhu, Xin Deng*
Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093
Abstract Here we report on the cloning and characterization of BhC2DP1, a novel gene encoding a plant-specific small
protein with a single C2 domain from the resurrection plant Boea hygrometrica. Phylogenic analysis of C2-domain pro-
teins and sequence analysis revealed that BhC2DP1 belongs to the C2 elicitor responsive protein subfamily. Real-time
PCR and histochemical study of a GUS reporter gene driven by the BhC2DP1 promoter in transgenic Arabidopsis showed
BhC2DP1 transcripts increased at the early stage after dehydration and exposure to exogenous Ca2+ but decreased with
prolonged treatment. Expression of BhC2DP1 was suppressed by abscisic acid (ABA) and Ca2+-chelating agent EGTA
but was promoted by simultaneous exposure to ABA and EGTA, suggesting that the transcriptional regulation of
BhC2DP1 by ABA is Ca2+ dependent. Constitutive overexpression of BhC2DP1 in Arabidopsis resulted in an
ABA-hypersensitive phenotype, which was rescued by supplementing EGTA to growth media. Therefore, Ca2+ is neces-
sary for the function of BhC2DP1 in responding to ABA. Our results provide new insights into the role of small C2-domain
proteins and the fine-tuning regulation mechanism in response to drought stress.
Key words abscisic acid, C2 domain, dehydration, resurrection plant
Zhang LJ, Ji FT, Wang LL, Qi DD, Zhu Y, Deng X (2012). A small C2-domain protein from the resurrection plant Boea
hygrometrica promotes plant responses to abscisic acid. Chin Bull Bot 47, 11–27.
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* Author for correspondence. E-mail: deng@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 刘慧君)