全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2016, 51 (1): 68–73, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB15057
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收稿日期: 2015-03-31; 接受日期: 2015-09-25
基金项目: 国家自然科学基金(No.31171571, No.91131008, No.31271743)
* 通讯作者。E-mail: yangsuxin@iga.ac.cn
一种快速、无损大豆种子DNA提取方法的建立和应用
程文1, 2, 夏正俊3, 冯献忠2, 杨素欣2*
1山东师范大学生命科学学院, 济南 250014; 2中国科学院东北地理与农业生态研究所中国科学院大豆分子设计育种重点实验室, 长
春 130102; 3中国科学院东北地理与农业生态研究所中国科学院大豆分子设计育种重点实验室, 哈尔滨 150081
摘要 基因分型是进行植物基因功能的遗传分析和分子标记辅助育种的重要环节。该研究以大豆(Glycine max)成熟种子为
材料, 建立了通过钻孔采集样品、快速提取DNA进行基因型鉴定的方法。用此方法, 一个熟练的工作人员可以在1个小时内
完成120个样品的采集和DNA提取; 同时种子钻孔取样后, 不会对大豆种子的萌发造成影响。利用该方法获得的DNA可满足
PCR扩增的要求。实验重复性好, 成功率在98%以上。这种快速且无损的大豆种子基因型鉴定方法可以用于鉴定杂交种子、
品种纯度以及遗传分析等研究工作。
关键词 大豆种子, DNA提取, 无损基因型鉴定
程文, 夏正俊, 冯献忠, 杨素欣 (2016). 一种快速、无损大豆种子DNA提取方法的建立和应用. 植物学报 51, 68–73.
随着大豆(Glycine max)基因组测序的完成, 大
豆功能基因组学研究呈现突飞猛进的局面, 许多控制
大豆重要农艺性状的基因或位点已被克隆或鉴定, 为
大豆分子育种研究提供了优良的基因资源(Schmutz
et al., 2010; 冯献忠等 , 2014; 曲梦楠等 , 2014;
Wang et al., 2014)。这些优良的基因资源在育种材料
和自然群体中的鉴定和发掘利用, 成为今后大豆分子
育种的一个基础环节。由于受栽培季节的限制, 目前
大豆材料的种植多为一年一季, 在南繁加代的情况
下, 可以使遗传材料繁殖2代, 遗传材料的繁殖周期
远落后于优良基因发掘利用的需求。因此建立快速且
无损的大豆基因型鉴定方法, 对于推动大豆分子育种
工作的进程具有重要意义。
目前, 实验室常用的大豆基因型鉴定方法是以幼
嫩叶片为材料, 采取CTAB或SDS法提取DNA进行分
子标记的鉴定。虽然此法可以获得质量较好的DNA,
满足常规基因型鉴定的需要, 但是由于植物叶片材料
的获得是以种子的萌发和生长为基础, 这不仅需要时
间来培育适合的植物材料, 而且所鉴定的种子由于萌
发而无法保存, 这给特定基因型杂合状态的保存带来
困难。目前, 利用种子材料进行无损基因型鉴定已成
为国际上快速鉴定基因型的趋势。这种方法不仅能够
省去育苗时间, 而且可以保证取样后的种子能正常萌
发。因此, 许多大的种子公司研发了可以大规模采集
种子样品的专用设备, 如孟山都公司的自动无污染种
子取样器可用于大豆等植物种子材料的取材。
Kamiya和Kiguchi (2003)提出用钻孔法从大豆种子取
样, 获取的豆粉利用SDS法提取DNA, 虽然其取样时
间已经缩短, 但是需要专用的仪器设备, 样品DNA提
取程序需要使用氯仿抽提。尽管目前已经有专用的设
备可以实现对大豆种子样品的大规模无损取样, 但是
对于普通实验室而言, 开发一种简单、快速、无损且
低成本的中小通量的基因型鉴定方法显得尤为必要。
本研究在综合前人种子无损取样和微量DNA提
取方法的基础上, 以市售普通微型手持电钻替代昂贵
的专用种子样品器, 建立了一种简单且快速的大豆种
子DNA提取方法, 并成功地应用于杂交种子鉴定、品
种纯度鉴定及遗传分析等。该方法可以满足常规实验
室对于大豆基因型鉴定的要求, 广泛用于大豆基因分
型的研究工作。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
大豆(Glycine max (L.) Merr) Williams 82、菏豆12和
吉林35种子由济宁市农业科学院提供。菏豆12与
·技术方法·
程文等: 一种快速、无损大豆种子 DNA提取方法的建立和应用 69

Williams 82及其杂交所获得的F1和F2种子群体在中
国科学院东北地理与农业生态研究所农业试验站种
植。
实验中使用市售微型手持电钻, 型号为施力特
P-500-1, 其余为实验室常用设备。化学试剂均为国
产分析纯(图1A)。
1.2 DNA提取方法
采用微型电钻在大豆种子的侧面中间部分打孔, 转子
直径为1.5 mm, 转速为200–400 r·min–1。钻孔的位置
选取种子上远离胚芽和胚轴的一侧, 钻头钻取的材料
主要是子叶的组织, 粉碎的豆粉滑落在1.5 mL离心
管的管盖(图1B, C)。
用移液器200 μL枪头将种子钻孔所得到的豆粉
(枪头沾满即可)转移到PCR 96孔板中(大约2 mg) (图
1D, E)。同时将钻孔后的大豆种子放入相应的位置储
存(图1 F)。使用75%乙醇清洗钻头, 并用吸水纸擦拭
干净后, 用于下个样品的处理。向每个样品中加入30
μL 0.1 mol·L–1 NaOH。在PCR仪中, 99°C处理10分
钟(图1G)。然后在每个样品中加入30 μL 0.1 mol·L–1
HCl, 轻轻混匀, 室温放置5分钟, 充分中和。2 500
×g离心30秒, 吸取上清液45 μL转移到新的96孔板
中, 于–20°C储存, 用于后续的PCR反应。
1.3 PCR反应
PCR反应体系中含有1×PCR Buffer (10 mmol·L–1)
Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol·L–1 KCl, 1.5 mmol·L–1
MgCl2), 150 μmol·L–1 dNTPs, 150 pmol·L–1引物, 1U
Taq DNA聚合酶(Takara公司), 2 μL DNA, 总反应体
系为20 μL。PCR反应条件: 94°C预变性3分钟, 1个循
环; 94°C变性30秒, 54°C退火30秒, 72°C延伸1分钟,
42个循环; 72°C延伸5分钟。PCR产物中加入上样缓
冲液2 μL, 于12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳。DL500
DNA Marker和100 bp DNA Ladder购自Takara公
司。引物为实验室自主开发的分子标记(表1), 由华大
基因公司合成。
2 结果与讨论
2.1 样品的快速收集、DNA的提取及检测
大豆种子经电钻钻孔后, 将样品(豆粉)转移到96孔板


图1 大豆种子钻孔DNA提取过程
(A) 大豆种子钻孔所用器材; (B)–(F) 种子钻孔和样品采集的
过程; (G) 将样品材料加入0.1 mol·L–1 NaOH, 于99°C处理10
分钟, 碱解样品; (H) 钻孔的种子播种后10天形成的幼苗; (I)
未钻孔的种子播种后10天形成的幼苗

Figure 1 Procedure of sample collection and DNA extrac-
tion from soybean seed
(A) Equipment used in the sample collecting; (B)–(F) The
major steps of sample collection; (G) Incubation of soybean
powder in 0.1 mol·L–1 NaOH at 99°C for 10 minutes; (H)
Seedling of drilled seed after sowed 10 days grown in
greenhouse; (I) Seedling of soybean seed after sowed 10
days grown in greenhouse


中 , 采用碱裂解法提取大豆种子基因组DNA (图1
A–G)。本方法不需要昂贵的仪器, 只需要微型手持电
钻, 所需仪器简单, 操作方便, 成本低, 同时不影响
大豆种子萌发, 钻孔后的大豆种子可在土壤中正常萌
发生长(图1H, I)。
DNA提取过程只有碱裂解和酸中和两步反应,
不使用氯仿和异戊醇等有机试剂, 大大降低了化学药
品对操作者的伤害。由于DNA提取过程的优化, 一个
熟练的工作人员1小时可以完成120个样品的采集及
DNA的提取, 极大地提高了工作效率,可以满足中低
70 植物学报 51(1) 2016

表1 分子标记的引物序列
Table 1 Primer sequences of molecular markers
Primer ID Forward primer (5′–3′) Reverse primer (5′–3′)
MOL0051 CTCACACCCTTTCATTATCTA AAATCGCGCATCTAAATTTAC
MOL0489 CTAAAAGGTGGTACTTTTGGTGTAGG GAGCCTTCTGTCTAGTAGCATGACCTT
MOL0533 ACACTTGAAAACGCCACT ACACTCGAAGGGTCACAT
MOL0591 GAGATCGTTAATGTCGCATCGTG GGTGCTAATACCTTCCTCAAACG
MOL0629 CCGTATTACATACTGTTGGGTGA ACTCGGGTTTGTAGAGTGATACAGT
MOL0679 TACAAGTCACCACTAGCCATCGT GCTCTAATGACGTGGTTGACAGA
MOL0697 AAGGATCACAGGACGTGAGGACA TCCCTTCCCTTAAATGTGGTCAA
MOL0765 ATTTGGTGTCCTTTTCGCTTTGTG AGCATGACATTCATCTGCGTTGT
MOL0897 ACAAACTTGAGTCTATAACTCCCCC GATGGAAGATGAAGTGATGAGTGA
MOL0911 GAAGAGCATGTTGTGATGCTTTG TGCGTGGATAATGCCAGGATA
MOL0981 GCAGGGACTGAGCAATAACAG AGCATAGCCTGAATACACGGA
MOL0997 ACAAGCCCAATAAAGTCCATGTG GGATTCCACGGTGATGGGTG
MOL1225 TCTTTCAAATGAGATTGCGTTGC CGCATAACTTGGAGGCTCTTCTT
MOL1227 GAGCCTTTCCCAAGCCAATG GGTCACTTTGAAAGACACGAAACATA


通量基因分型样品的需求。
为了检测此种方法提取DNA的质量, 我们采用
了紫外分光光度计和PCR方法对DNA的质量进行鉴
定(图2)。结果显示, 此方法提取的DNA浓度为(691.4
±80.34) ng·μL–1, A260/230为 (1.36±0.05), A260/280为
(0.41±0.03)。这表明该方法所提取的DNA中有较高的
蛋白质、糖类和盐类等杂质。为了验证所提取DNA是
否适合于PCR反应, 我们利用9对引物对分别来源于
黄淮海大豆产区的菏豆12、东北大豆产区的吉林35
和美国的大豆品种Williams 82的DNA进行了检测。
PCR产物的电泳结果显示, 在鉴定的样品中, 都能够
通过PCR扩增得到清晰的电泳条带(图2), 说明通过
碱法提取的DNA能够满足分子标记扩增的要求。
2.2 种子钻孔法提取DNA的应用
2.2.1 杂交种子鉴定
通过种子钻孔的方法, 提取母本为菏豆12、父本为
Williams 82的28粒杂交种子的DNA, 从实验室开发
的SSR分子标记MOL0051 (位于大豆第2号染色体
10.538 Mb)为引物鉴定该杂交种子的真伪。MOL-
0051分子标记以Williams 82的DNA为模板的扩增片
段大小为230 bp, 菏豆12所扩增的片段小于230 bp,
菏豆12与Williams 82之间具有多态性(图3A)。PCR
检测结果显示, 在28粒杂交种子中, 有26粒分别产生
与菏豆12和Williams 82相同的2条带(杂合带型), 有2



图2 PCR鉴定所提取DNA质量
对分子标记MOL0679、MOL0981、MOL0697、MOL0489、
MOL0897、MOL0591、MOL0997、MOL0629、MOL0765和
MOL0533进行PCR引物扩增。M: 100 bp DNA Ladder

Figure 2 Electrophoretograms of PCR products for exami-
nation of DNA quality
With MOL0679, MOL0981, MOL0697, MOL0489, MOL0897,
MOL0591, MOL0997, MOL0629, MOL0765 and MOL0533,
for each molecular marker detected. M: 100 bp DNA Ladder


粒只产生与母本菏豆12相同的条带。因此判断, 28粒
种子中的26粒为真正的杂交种, 其它2粒只携带母本
的基因型, 表明杂交不成功。将钻孔的种子种植, 观
察F1以及F2代植株的表型, 发现基因型鉴定为假阳性
的种子, 在F1以及F2代群体中仅表现出菏豆12的表
型; 其它26粒真正的杂交种子在F2代都出现了性状
分离, 从而证明了基因型鉴定的准确性。这说明利用
种子钻孔提取DNA的方法, 可以快速并无损地鉴定
杂交种子的真伪。该方法比依靠观察F1代显性形态表
程文等: 一种快速、无损大豆种子 DNA提取方法的建立和应用 71



图3 大豆杂交种和品种纯度的PCR检测
(A) 杂交种子鉴定(分子标记MOL0051), 泳道1: 菏豆12; 泳道
2, 3: 杂交种(菏豆12×Williams 82)阳性对照; 泳道4: Williams
82; 泳道5–32: 待检测的28个杂交种, 白色箭头(泳道11, 32)
所示为假杂交种DNA的扩增产物, 与母本菏豆12基因型一致;
(B) 种子纯度鉴定(分子标记MOL0911), 泳道1–4: Williams 82
阳性对照; 泳道5–48: 待检测的44个样品, 白色箭头(泳道9、
36和38)示污染种子的带型

Figure 3 Electrophoretograms of PCR products for exami-
nation of soybean hybrid seeds and seed purity
(A) Identification of hybrid seeds (molecular marker MOL-
0051 was used for PCR amplification), Lane 1: Hedou12;
Lane 2, 3: Positive control of hybrids (Hedou 12 × Williams
82); Lane 4: Williams 82; Lane 5–32: 28 examined hybrids,
the white arrows in lanes 11 and 32 indicated PCR products
amplified from failed crossings; (B) Identification of seed
purity (molecular marker MOL0911 was used for PCR ampli-
fication), Lane 1–4: Williams 82 positive control; Lane 5–48:
Tested seeds, the white arrows in lane 9, 36 and 38 indicated
PCR products from contaminated seeds


型的方法更加准确, 可为育种学家利用分子标记鉴定
杂交个体提供一种快速、高效且经济的手段。

2.2.2 品种纯度鉴定
市场上很多作物的种子在出售前都需要进行纯度鉴
定, 以保证种子的质量, 提高农作物的产量。目前大
豆种子的常规鉴定多依据种子和幼苗的形态以及用
物理化学检测方法, 鉴定过程费时费工。为了提高大
豆纯度鉴定准确性和高效性, 可以对大豆种子进行基
因分型抽样检测。在本研究中, 我们对污染了其它品
种的Williams 82种子进行鉴定, 结果显示, 在44粒待
检测样品中, 仅采用1对引物的情况下, 如MOL0911,
发现有3个样品的PCR扩增电泳条带与Williams 82带
型不一致(图3B), 从而检测出这3粒种子为污染的
种子。
在实践操作中, 仅采用了1对分子标记对大豆种
子进行纯度检验, 可能产生假阳性。为了增加鉴定结
果的准确性, 避免近缘品种分子标记无多态性的干
扰, 可以采用覆盖基因组的多对分子标记进行鉴定,
从而避免鉴定结果出现假阳性现象。

2.2.3 基因分型分析
对研究材料的基因分型是构建遗传图谱、图位克隆和
分子标记辅助育种的重要组成部分。特别是在图位克
隆的精细定位环节, 将目标位点定位在一定的区间范
围后, 随着区间范围的缩小, 交换频率降低, 进一步
缩小定位区间通常需要非常大的群体。如果基因型未
经提前鉴定, 需种植材料, 工作量大且耗时长。利用
在目标区域较近的2个分子标记可以先对分离群体的
种子进行初步筛选, 筛选出在目标区间发生重组的种
子, 然后将其种植, 对重组个体的表型进行鉴定, 结
合基因型鉴定结果, 可加快基因定位的速度。这样既
能节省人力、物力和财力, 又能加快实验的进程。
为验证以种子钻孔取材和碱裂解的方法提取
DNA在基因分型中的适用性 , 我们首先在同一个
PCR反应中利用2对引物对菏豆12和Williams 82杂
交所获F2分离群体中的19个个体进行基因分型。实验
结果显示, 以上述方法所提取的DNA为模板, 利用
MOL1227 (位于第2号染色体14.472 Mb)和MOL-
1225 (位于第2号染色体14.579 Mb) 2对引物可以获
得清晰的可区分基因型的电泳条带(图4)。引物MOL-
1227不仅可以清晰地扩增Williams 82单倍体型的
280 bp片段和菏豆12单倍体型的266 bp片段, 而且
对于两者的杂合子也可以清晰区分(图4, 箭头A和B)。
同样, 在同一PCR反应中, 对于另一个分子量较小的
分子标记MOL1225 (菏豆12单倍体型具有213 bp扩增
片段, Williams 82单倍体型具有193 bp的片段), 亦可
以实现双亲和杂合子的分型(图4, 箭头C和D)。这表
明利用本方法所提得的DNA完全可以满足2对引物同
时扩增和高通量基因型检测的要求。
根据上述实验结果 , 我们对来源于菏豆12与
Williams 82杂交的F2群体中的847粒种子的剩余种子
打孔提取DNA, 采用上述引物MOL1225和MOL1227
进行基因型鉴定。统计结果显示, 在847个样品中, 有
836个样品(占98.70%)得到清晰的电泳条带。对2个分
子标记的基因型统计分析表明, 在836个样品中, 有
792个样品显示2个分子标记为共分离, 其它44个样
72 植物学报 51(1) 2016



图4 MOL1227和MOL1225两对引物在同一反应管中PCR扩
增产物的电泳检测结果
泳道M: DL500 DNA marker; 泳道1–19: 菏豆12与Williams 82
杂交的F2群体的19个个体。箭头A和B分别示MOL1227扩增
Williams 82和菏豆12的单倍体型所得到的PCR产物片段(280
bp和266 bp); 箭头C和D分别示MOL1225扩增菏豆12和
Williams 82的单倍体型所得到的PCR产物片段(213 bp和193
bp)。

Figure 4 Electrophoretograms of PCR products for check-
ing the results of MOL1227 and MOL1225 double pairs of
primers amplification in one tube
Lane M: DL500 DNA marker; Lane 1–19: 19 individual plants
from F2 population of Hedou 12 and Williams 82. Arrow A and
B indicated the PCR products of MOL1227 from Williams 82
haplotype (280 bp) and Hedou 12 haplotype (266 bp), re-
spectively; Arrow C and D indicated the PCR products of
MOL1225 from Hedou 12 haplotype (213 bp) and Williams 82
(193 bp) haplotype, respectively.

品显示2个分子标记发生了交换, 经计算2个分子标
记之间的交换率为2.63%。这表明2个分子标记存在
于同一染色体且有紧密连锁的关系。该结果与MOL-
1225和MOL1227两个分子标记位于同一染色体, 且
二者之间的物理距离为107 kb的事实相符。上述实验
结果进一步表明, 采用本方法提取的DNA完全可以
满足常规实验室的基因分型检测需要。
2.3 讨论
2.3.1 快速、无损大豆种子DNA提取方法的优点和
改进之处
近年来, 有关从大豆中提取基因组DNA的报道很多,
但多数为不同组织材料或是不同方法提取DNA的比
较。大豆种子中含有较多的蛋白质、脂类、酚类和糖
类及其它物质, 不利于高质量DNA的提取, 并且大豆
干种子中的蛋白质和油脂的含量非常高, 所以从大豆
种子中提取DNA相对较难。传统的提取方法操作相对
繁琐, 费用较高, 对种子会造成伤害使之无法正常萌
发。在本研究中, 我们通过种子钻孔的方法, 可以快
速有效地完成对样品的采集和DNA提取, 且采集样
品后的种子能正常萌发。
碱裂解法提取DNA被认为是一种快速有效提取
种子DNA的方法, 已被广泛应用于水稻(Oryza sa-
tiva) 、玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium hirsutum)、
小麦(Triticum aestivum)和花生(Arachis hypogaea)
等作物中, 并且在转基因植物鉴定和分子标记辅助育
种等方面具有重要作用(Hill-Ambroz et al., 2002; Xu
et al., 2005; Collard et al., 2007; 闫双勇等, 2011;
周晶等, 2014)。本研究借鉴碱裂解法提取大豆种子
DNA, 改进了Kamiya和Kiguchi (2003)的种子SDS提
取方法, 具有所需设备简单、操作简便且不使用氯仿
等有毒试剂的优点, 通过这种方法提取的DNA完全
能够满足分子标记的扩增要求, 同时实验的成功率
高, 重复性好。

2.3.2 种子钻孔法提取DNA的应用局限性
由于大豆种子蛋白质含量高, 且通过碱裂解法提取的
DNA没有经过蛋白质等杂质去除的操作, 所以用本
方法所提取的DNA纯度较SDS法和CTAB法低。因此,
其使用范围限于进行实验室常规PCR基因型的鉴定,
对于高质量DNA要求的实验, 可以增加DNA纯化的
步骤来实现。
此外, 在材料收集以及DNA提取过程中, 还需要
注意一些问题。首先, 大豆种子由种皮和胚两部分组
成, 其中种皮来源于母本, 基因型与母本一致, 而胚
(胚芽、胚轴、胚根和子叶)基因型由父本和母本的基
因型共同决定。因此, 在研究分离群体或选择群体中
个体基因型时, 应先用砂纸磨掉一块种皮后再钻孔取
样, 以防止母体DNA的污染。若母体基因型对后续实
验无影响, 可以不去种皮, 如纯合的品种, 种子种皮
与种子内部的基因型一致。另外, 所取的样品材料不
能太多, 以免由于碱裂解不彻底, 影响下一步的PCR
扩增。
致谢 感谢山东省济宁市农业科学院李继存研究员
提供大豆种子。
参考文献
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程文等: 一种快速、无损大豆种子 DNA提取方法的建立和应用 73

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A Rapid and Nondestructive Method for Soybean DNA Extraction
and Its Application
Wen Cheng1, 2, Zhengjun Xia3, Xianzhong Feng2, Suxin Yang2*
1College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China; 2Key Laboratory of Soybean Molecular Design
Breeding, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130102, China;
3Key Laboratory of Soybean Molecular Design Breeding, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese
Academy of Sciences, Harbin 150081, China
Abstract Genotyping is an important work in plant genetic analysis and molecular marker-assisted breeding. This study
established a simple method for genotyping soybean from mature seeds. By this method, a skilled worker can perform the
sample collection and DNA extraction of 120 samples from soybean seeds in 1 h and the treated seeds can germinate
normally. The DNA obtained by this method can meet the requirement for PCR amplification, and the success rate of PCR
reaction is over 98%. This method can be widely used for identifying soybean hybrid seeds, seed purity and genotyping.
Key words soybean seed, DNA extraction, nondestructive genotyping
Cheng W, Xia ZJ, Feng XZ, Yang SX (2016). A rapid and nondestructive method for soybean DNA extraction and its
application. Chin Bull Bot 51, 68–73.
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* Author for correspondence. E-mail: yangsuxin@iga.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)