全 文 ：第 26 卷第 6期
2006 年 6月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 26, No. 6
Jun. , 2006
玉米品种遗传多态性与根系内生细菌种群的相互关系
高增贵1 , 陈 捷1, 2 , 刘 限1 , 薛春生1
( 11 沈阳农业大学植物保护学院农业部北方农作物病害免疫重点开放实验室, 沈阳 110161;
21 上海交通大学农业与生物学院, 上海 201101)
基金项目:国家十五科技攻关资助项目( 2004BA509B05)
收稿日期: 2005-04-19;修订日期: 2005-11-07
作者简介:高增贵( 1966~ ) ,男,内蒙古准格尔旗人,博士,研究员,主要从事植物微生态学和病害生物防治研究. E-mail: gaozenggui@ sina. com
Foundation item: The project was supported by Nat ional Tenth-f ive-year Project (No. 2004BA509B05)
Received date: 2005-04-19; Accepted date: 2005-11-07
Biography: GAO Zeng-Gui, Ph. D, Professor,mainly engaged in plant microecology and bio- control of plant disease. E-mail: gaozenggui@ sina. com
摘要:对辽宁省 14 个玉米主栽品种根系内主要细菌种群的分析结果表明, 芽孢杆菌属( Bucillus ssp. )为玉米内生细菌的主要种
群,其它种属包括肠杆菌属、沙雷氏杆菌属、假单孢菌属、黄单孢菌属和棍状杆菌属。内生细菌在不同玉米品种和不同生育期之
间存在程度不同的差异。从 90条随机引物中筛选出条带清晰、重复性好的 13 个引物, 对 14 个玉米主栽品种进行遗传多态性
的 RAPD分析, 共扩增出条带 139条, 其中多态性条带 101 条,多态性比率 721 7%。利用 SPSS 统计分析软件对 14 个玉米品种在
DNA水平和内生细菌种群水平上进行聚类分析,结果表明, 品种亲缘关系在这两个水平上表现基本一致, 即品种内生细菌的种
类及其数量在很大程度上受品种的遗传背景控制。
关键词:玉米; 内生细菌; 遗传背景; 随机扩增片段多态性
文章编号: 1000-0933(2006) 06-1920-06 中图分类号: Q143, Q938, S314, S513. 03 文献标识码: A
The correlation between maize genetic polymorphisms and endophytic bacteria
population in plant roots
GAO Zeng-Gui
1
, CHEN Jie
1, 2
, LIU Xian
1
, XUE Chun-Sheng
1 ( 11Plant Protection College , Shenyang Agricultural University, Key
Laboratory of North Crop Immunology Chinacs Ministry of Agriculture , Shenyang 110161, China ; 2. Agriculture and Biology College, Shanghai Jiaotong
Universi ty , Shanghai 201101, China) . Acta Ecologica Sinica , 2006, 26( 6) : 1920~ 1925.
Abstract: 14 major maize cultivars in Liaoning Province of China were analyzed for their endophytic bacteria population studies.
The results showed that Bucillus ssp was the major genera of endophytic bacteria strains isolated from the maize roots, and the
minor strains include Enterobacter spp. , Serratia spp. , Xanthomonas spp. , and Clavibacter spp. Also, there were degrees of
variations between endophytic bacteria isolated from different species of maize cultivars and growth periods. All 14 major maize
cult ivars were subjected to a random amplified polymorphic DNAs ( RAPDs) study, among 90 random primers tested, 13 primers
were able to generate distinct DNA fragments, in which, 7217% of 139 RAPD fragments were shown results of polymorphism.
Furthermore, from the studies of SPSS cluster analysis which conducted on maize cultivars and endophytic bacteria, our results
strongly suggest a close relationship between the species and numbers of endophytic bacteria and the genetic background of maize
cult ivars.
Key words: maize; endophytic bacteria; genetic background; random amplified polymorphic DNA
植物本身就是一个复杂的微生态系统,其重要成员之一是植物内生细菌 [1, 2]。目前, 在各种农作物(包括
小麦、水稻、玉米、马铃薯、番茄、甜菜)及果树等经济作物体内已发现的内生细菌数量超过 129种(隶属于 54
个属) [ 3~ 7]。已有研究表明,内生细菌在宿主抵抗植物病虫害及抗非生物胁迫中起到重要作用。因此,研究内
生细菌种群与品种遗传背景的相互关系,对抗病性微生态育种及其二者协同进化机理研究具有重要意义。目
前关于内生细菌与宿主植物的关系等方面的研究报道很少[ 8~ 10] 。笔者初步研究表明,内生细菌在不同玉米品
种和不同生育期存在不同程度的差异 [11]。为探讨内生细菌的种类及其数量与品种遗传背景之间的相关性,
本文利用随机扩增多态性( RAPD)技术, 从 DNA 水平上研究了品种的遗传特性与内生细菌种群的相互关系,
为丰富植物微生态学理论及基因工程菌的研究和应用奠定基础[ 12, 13]。
1 材料和方法
111 供试玉米品种
辽宁省玉米主栽品种 14个(表1) ,包括连玉 11、连玉 13、连玉 15、沈单 10、沈单 11、沈试 30、沈单 18、沈农
87、农大 108、富友 1号、辽单 24、掖单 13、新铁 10、东单 57。
表 1 内生细菌分离的供试玉米品种
Table 1 Cultivars tested for isolation of corn endophytic bacteria
编号*
Code*
品种 Cult ivars 组合 Combination
1 连玉 11 Lianyu11 543@ 880
2 连玉 13 Lianyu13 104@ 673( 104与 543近缘)
3 连玉 15 Lianyu15 543@ 136
4 沈单 11 Shendan11 沈 135@ 340(沈 135-热带血缘)
5 沈单 10 Shendan10 沈 137@ Q1261(沈 137-热带血缘)
6 沈试 30 Shenshi30 沈 137@ 341( 341-5003血缘)
7 沈单 18 Shendan18 152@ 沈 137
8 沈农 87 Shennong87 2109@ 309( 309-丹 340血缘)
9 农大 108 Nongda108 178@ 黄C (178-599血缘)
10 富友 1号 Fuyou 1 2109@ 598( 2109-5003血缘)
11 辽单 24 Liaodan 24 辽 2345@ 丹 340
12 掖单 13 Yedan 13 478@ 丹 340
13 新铁 10 Xintie 10 C8605@ 丹 340
14 东单 57 Dongdan57 ( C8605@ 9046)二环系 @ 598
* 下同 the same below
112 内生细菌的分离鉴定
11211 分离用培养基 采用牛肉膏蛋白胨固体培养
基(蛋白胨 510 g,NaCl 510 g, 牛肉膏310 g,酵母膏 310
g,琼脂 1810 g, 加水至 1000 ml, pH 712) [ 14]。
11212 分离方法
( 1)试材培养与取样 首先用无菌水将供试品种
的种子进行表面清洗, 播种于未曾种过玉米的砂壤
土, 4叶期进行取样幼苗根系。将玉米种子直接播种
大田,自然生长, 抽丝期和灌浆初期取样成株根系。
每一根样取 2份,一份用于内生细菌分离,另一份用
于DNA提取。
( 2)分离 采用平板稀释分离法。先用水将取来
的根样冲洗干净, 然后在 011%十二烷基磺酸钠溶液
中浸泡30 min,再用水冲洗干净,而后随机取根 510 g,
纱布包裹。包裹好的材料浸入 011%的HgCl2 中消毒,苗期根消毒 10~ 12 min,成株期消毒 15~ 18 min,再用无
菌水冲洗 3~ 5次。取 012 ml最后 1次无菌水冲洗液涂布接种于分离培养基上,每个处理重复 3次, 培养 48
h,观察有无菌落产生。据此验证此消毒方法是否能全部杀死供试样品表面微生物。然后将供试材料转入无
菌研钵中研磨成匀浆。加入 510 ml无菌水搅匀。以此为母液,依次稀释为 10- 1、10- 2、10- 3、10- 4、10- 5 5个浓
度的菌悬液。分别取012ml加入牛肉膏蛋白胨固体分离培养基进行内生细菌的分离,每个处理重复 3次。培
养3~ 7 d后计数。每皿挑选 3~ 5株,按常规方法对分离出的菌落进行纯化,以供鉴定和保藏。
( 3)鉴定 内生细菌的鉴定参考权威手册[ 14, 15] ,其中芽孢杆菌属鉴定到种 [16]的方法。
113 供试品种的RAPD
11311 基因组 DNA的提取 首先将上述制备的根样进行冷冻干燥,干燥后进行 DNA的提取。
提取缓冲液( Extraction Buffer) : 100 mmolPL Tris-HCl( pH810) , 100mmolPL NaCl, 100 mmolPL EDTA, 10% SDS。
提取程序见文献 [ 17]。
11312 RAPD反应体系和扩增程序 引物筛选和 RAPD分析采用相同的 PCR反应体系和扩增程序。供试引
物为上海生物工程公司生产的 S1-S5、S11-S25、S41-S45、S61-S65、S81-S85、S91-95、S101-S105、S121-S125、S181-
S185、S190-S200、S1300-S1320、S1441-S1450、S1456-S1460等 10 个碱基随机引物 90条引物。反应体系:反应体
积为 20 Ll,各反应成分的终浓度分别为215mmolPL MgCl2 , 0125mmolPL dNTP, 016 LmolPL, 1uTaq酶(上海生物工
程公司) , 25 ngDNA。反应程序: 94 e 1 min 35 e 115 min 72 e 2 min, 5循环; 94 e 015 min 35 e 1 min 72 e 115
min, 40循环; 72 e 10 min, 1循环; 程序结束后进入 4 e 状态。扩增反应在 PCR Express Thermal Cycler HBPX220
(英国Thermo Hybaid Limited生产)上进行。电泳分离:反应结束后,反应管中加入 2 Ll含40%蔗糖的溴酚蓝溶
液混匀,根据电泳槽梳子的大小取 10~ 15 Ll扩增样品,轻轻注入凝胶样品槽中。电泳凝胶为 115%的琼脂糖,
19216期 高增贵 等:玉米品种遗传多态性与根系内生细菌种群的相互关系
电泳缓冲液为 50 @TAE(用时稀释 50倍) ,电压为 5 VPcm。电泳结束后,将凝胶板放入溴乙淀( EB)溶液中染
色,染色时间 40 min~ 2 h不等。随后用 Kodak 紫外分析仪检测扩增效果, 并记录。Marker: DNAPEcoR Ñ+
Hind Ó,浓度为 0105 mgPml,加样 4 Ll。
114 数据分析
将由 14个品种分离鉴定出的内生细菌数量以属、种形式汇总成数据表; RAPD结果将每条带均看作一个
遗传位点, 根据扩增条带的有无分别记为 1和 0,将 13条引物 14个品种的图谱转化成由 1、0组成的数据表,
分别输入 SPSS统计软件,按公式 d = E ( X i - Yi ) 2计算品种间的欧氏距离平方,形成欧氏距离矩阵,再采用
分层聚类法进行聚类分析,并给出供试品种亲缘关系聚类分析图。
2 结果与分析
211 不同品种在内生细菌种群水平上的聚类分析
14个品种从苗期和抽丝期内生细菌的分离鉴定结果见表 2和表 3,从表中可以看出, 玉米内生细菌种类
比较复杂,共鉴定出 6个属,包括芽孢杆菌属 Bacillus、肠杆菌属 Enterobacter、沙雷氏杆菌属 Serratia、假单胞菌
属 Pseudomonas、黄单胞菌属 Xanthomonas 和棍状杆菌属Clavibacter。其中芽孢杆菌分布最广,已鉴定出8个种,
包括枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis、巨大芽孢杆菌 B1 megaterium、蜡状芽孢杆菌 B1 cereus、地衣芽孢杆菌 B1
licheniformis、炭疽芽孢杆菌 B1 anthracis、蕈状芽孢杆菌 B1 mycoides、短小芽孢杆菌 B1 pumilus、环状芽杆菌 B1
circulans; Serratia 和Enterobacter 分布较少;而 Clavibacter 分布最少。不同品种间内生细菌的种类和数量均存在
差异,经相关分析表明,苗期与成株期细菌总量不相关。
将表 2和表 3中 14个品种的苗期和成株期内生细菌属、种数量进行聚类分析,结果见图 1。供试品种在
连锁距离 14的范围内全部聚在一起,分成6组,沈单10、沈单11、沈试30和沈单18为第 1组;沈农87、新铁10
为第 2组;富友1号、东单 57为第3组,连玉 11、连玉 13、连玉15和农大108为第 4组,辽单24和掖单13自成
一组,为第 5组和第 6组。同时从聚类分析结果发现,同组内不同品种具有相同或相似的血缘背景, 如第 1组
的4个品种均含有热带血缘;第 2组的 2个品种其母本均含 5003血缘,父本含丹340血缘;第 3组的 2个品种
含有 5003血缘。
表 2 玉米苗期不同品种根系内生细菌主要种群的数量分布( @ 104 cfu#g- 1)
Table 2 Distribution of endophytic bacteria in maize roots during seedling stage
属、种
Genus, species
品种编号 Numbered cultivars
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bacillus subtilis 0104 0121 0111 0126 0120 0108 0148 0106 0105 0105 0120 0131 0126 0115
B1 megaterium 0112 0109 0105 0106 0112 0102 0132 0104 0103 0101 0112 0115 0113 )
B1 cereus 0101 0101 0102 ) ) 0101 ) ) ) 0103 ) ) ) 0106
B1 licheniformis ) ) ) 0101 0104 0103 0104 ) 0101 ) 0102 0101 ) )
B1 anthracis ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) )
B1 mycoides ) ) ) ) ) ) ) 0103 ) ) ) ) ) )
Others Bacillus 0101 0101 0103 0102 0101 0103 0104 0101 0101 0103 0101 0101 0101 0103
Enterobacter spp1 0107 0112 0110 0107 0110 0103 0108 ) 0105 0101 0110 0106 0102 0102
Serratia spp1 ) 0102 0105 ) ) ) ) 0110 0104 0103 ) ) 0107 0112
Pseudomonas spp1 ) ) ) 0102 0106 ) 0103 ) 0102 ) ) ) ) )
X anthomonas spp1 0102 ) 0101 ) ) ) 0101 ) ) ) ) ) ) )
合计 Total 0127 0146 0136 0144 0153 0120 1100 0124 0121 0116 0145 0154 0149 0138
差异显著性( a= 0105)
Significance of difference
bcde bcd bcde bcde b de a cde cde e bcd b bc bcde
212 不同品种间DNA水平上的聚类分析
从90个随机引物中共筛选出条带清晰、重复性好的 13个引物。引物编号、碱基序列和扩增结果见表 4。
引物 S14扩增的谱带最少,有 3条,引物S41和 S101扩增的谱带最多,有17条, 其它引物扩增的谱带数介于二
1922 生 态 学 报 26卷
者之间。13条引物共扩增出 139个 RAPD标记, 多态性标记有 101个, 占扩增片段总数的 7217%。不同引物
扩增的玉米品种遗传图谱差异较大,父母本亲缘关系(尤其是母本的亲缘关系)相近的品种间在 DNA 水平上
相似性高, 共同谱带多。即扩增图谱相近。如引物 S12对亲缘关系非常近的品种沈农 87、新铁 10、辽单 24和
掖单 13的扩增谱带几乎一样,扩增的 7条谱带中只有一条略有差异(图2)。
表 3 玉米抽丝期不同品种根系内生细菌主要种群的数量分布( @ 105 cfu#g- 1)
Table 3 Distribution of endophytic bacteria in maize roots during silking period
属、种
Genus, species
品种编号 Numbered cult ivars
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bacillus subtilis 214 4118 5101 5180 4150 4195 2181 3128 5141 4102 4180 216 3175 4182
B1 megaterium 1141 3112 0120 3120 2153 2193 1120 0195 6101 4134 4120 1125 4180 1125
B1 cereus 3120 0104 2110 1101 0181 1112 2198 2180 1186 0104 1190 3111 1101 3191
B1 licheniformis 0103 3198 ) ) 0106 0121 ) ) 0198 2140 0104 ) 0117 2110
B1 anthracis 0118 ) ) ) 0106 0101 ) 3190 ) ) ) 1165 ) )
B1 mycoides ) ) ) ) 0110 ) ) ) 0112 ) 0116 ) ) )
B1 pumilus ) ) 0102 0103 0106 017 0103 ) ) ) ) ) 0104 0117
B1 circulans 0105 0105 0101 ) ) ) 0108 0106 ) 0104 ) 0105 ) )
Others Bacillus 0104 0102 0102 0102 0101 0103 0103 0102 0101 0103 0101 0102 0102 0102
Enterobacter spp1 3110 1106 2101 3184 3185 4106 2196 3105 0108 1185 1104 2120 2180 3180
Serratia spp1 1122 0101 0101 2120 1198 2115 0195 1114 012 0102 0117 1101 2121 )
Pseudomonas spp1 0109 0101 ) 0102 0104 0105 1120 0101 1121 0101 1135 0193 0103 )
X anthomonas spp1 ) ) ) 1116 1150 1104 0101 0101 014 ) ) 0102 0101 )
Clavibacter spp1 0101 0111 0101 0103 0102 0102 ) ) ) 0109 ) ) 0103 0105
Unknown bacteria 0110 01038 0104 0109 0105 0103 0108 0106 0114 0105 0106 0104 0104 0112
合计 Total 13113 19187 1511 18175 27157 12124 37191 12181 1218 9175 1910 29118 21185 16124
差异显著性( a= 0105)
Significance of difference
b ab b ab ab b a b b b ab ab ab b
图 1 不同玉米品种在内生细菌种群水平上的聚类树状图
Fig. 1 Cluster analysis of maize cult ivars based on endophyt ic bacteria populat ion
通过分层聚类结果可以看出(图3) ,供试的 14个品种在连锁距离 55的范围内全部聚在一起,分成 5组。
沈单 11、沈单 10、沈单 18和沈试 30为第 1组;沈农 87、新铁 10为第 2组; 富友 1号和东单 57为第 3组; 连玉
13、连玉 15和农大 108为第 4组;辽单 24和掖单 13为第 5组;连玉 11较特殊, 与其它品种的亲缘关系较远,
自成第6组。
19236期 高增贵 等:玉米品种遗传多态性与根系内生细菌种群的相互关系
图 2 引物 S101(上)和 S12(下)在 14个玉米品种中的扩增图谱
Fig. 2 Vertical RAPD patterns obtained in 14 corn cultivarsw ith the primers
S101 and S12
M:Marker; 1~ 14: See Table 1 for the numbered cultivars
表 4 RAPD扩增引物筛选结果
Table 4 Screening amplification primer of RAPD
引物
Primers
核苷酸碱基序列 5c-3c
Nucleotide sequence 5c- 3c
RAPD标记数
Scored bands
多态性标记数
Polymorphic bands
S1 GTTTCGCTCC 14 12
S2 TGATCCCTGG 6 2
S12 CCTTGACGCA 10 8
S13 TTCCCCCGCT 7 6
S14 TCCGCTCTGG 5 4
S17 AGGGAACGAG 6 5
S20 GGACCCTTAC 10 8
S41 ACCGCGAAGG 17 9
S64 CCGCATCTAC 16 10
S99 GTCAGGGCAA 8 6
S101 GGTCGGAGAA 17 10
S1446 AAGTGCACGG 15 13
S1449 TCGCTTCTCC 8 8
合计 Total 139 101
213 品种遗传背景与内生细菌种群的相互关系
在DNA水平和内生细菌种群水平上分别对供试
品种进行聚类比较, 结果见表 5, 从中可以看出,品种
在DNA水平的分组和在内生细菌种群水平上的分组
相关性明显。玉米内生细菌种群划分的 A、B、C 3组
与RAPD划分的 a、b、c 3组完全相同, 二者反映出的
品种遗传背景是完全一致性; RAPD划分的 d组与内
生细菌种群水平上划分的品种基本相同。只有个别
品种离散度较高, 如连玉 11和掖单 13。综合以上研
究结果,表明品种的遗传背景与其内生细菌种群存在
明显的相关性, 即品种的遗传特性在相当程度上决定
着内生细菌的种类及其数量。
3 讨论
对14个玉米品种内生细菌的分离鉴定结果表
明,不论是苗期还是抽丝期,不同品种间内生细菌的
种类和数量均存在差异。该结果与不同生育期或地
域花生品种间内生细菌种类存在显著差异的研究报
道一致[ 4]。
应用 RAPD技术检测了品种的 DNA多态性,结果
表明不同玉米品种具有丰富的 DNA多态性。品种间
遗传位点最高一致率为 8419% , 最低一致率为
6419%。即使是母本相同的品种,其遗传位点也存在
明显的差异, 如连玉 11和连玉 15, 它们的母本均为
543,但是两者的欧氏距离平方却很大, 为 39; 还有沈
单10和沈试 30,它们的母本均为具有热带血缘的沈
137,两者欧氏距离平方也很高, 达到了 36。这说明玉
米各品种的遗传背景是相当复杂的 [ 18]。
品种的遗传背景对内生细菌种群有明显的选择性。品种内生细菌的种类及其数量在很大程度上受品种
的遗传背景控制,尤其内生细菌的种类与品种的遗传背景存在明显的相关性, 如沈农 87和新铁 10于抽丝期
内生细菌种类完全相同, 均含有 Bacillus subtilis、B1 megaterium、B1 cereas、B1 licheniformis、B1 mycoides、
Enterobacter、Serratia、Pseudomonas。但研究中也发现,遗传背景相近的个别品种间内生细菌的数量存在差异,
可能是由于受外界环境间接影响的结果。
表 5 品种 RAPD分组与内生细菌种群分组比较
Table 5 Comparison of blood relationship groups of cultivars determined by RAPD and endophytic bacteria population
内生细菌种群聚类分组 Grouping on
the cluster of endophytic bacteria
品种
Cult ivars
品种随机扩增聚类分组 Cult ivars
grouping with RAPD
品种
Cultivars
A 沈单 10,沈单 11,沈试 30,沈单 18 a 沈单 10,沈单 11,沈试 30,沈单 18
B 沈农 87,新铁 10 b 沈农 87,新铁 10
C 富友 1号,东单 57 c 富友 1号,东单 57
D 连玉 11,连玉 13,连玉 15,农大 108 d 连玉 13,连玉 15,农大 108
E 辽单 24 e 辽单 24,掖单 13
F 掖单 13 f 连玉 11
1924 生 态 学 报 26卷
图 3 玉米品种在DNA水平上的聚类分析树状图
Fig. 3 Tree diagram of cluster analysis for 14 corn cult ivars on DNA level
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