全 文 ：第 !" 卷第 #$ 期
!$$" 年 #$ 月
生 态 学 报
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5446：7 7 8882 93010:;3<2 3=
基金项目：国家自然科学基金资助项目（>$!"##$?）
收稿日期：!$$@A$BAC$；修订日期：!$$"A$CA!>
作者简介：张于光 （#?"@ D），男，湖南湘乡人，博士，主要从事土壤微生物分子生态学研究2 (AE<;1：FG:H5<=:I F<5002 30E2 3=
!通讯作者 &0JJ9K60=L;=: !"#$%&’("$ (’)*：’59 6J0P934 8$!"##$?）
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0("12&/34：ST%.+ UGA+G<=:，V52 W2，E<;=1F 9=:<:9L ;= K0;1 E;3J0Q;<1 E0193G1土地利用变化对土壤真菌群落结构的影响
张于光 #，张小全 #，曲良建 #，肖X 烨 !
（#2 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，国家林业局森林生态环境重点实验室，北京X #$$$?#；
!2 湖南农业大学生物安全科技学院，长沙X >#$#!B）
摘要：应用 V&YAYR*V和测序分析对川西亚高山米亚罗林区不同土地利用类型的土壤真菌 #B- JW.%基因进行了多样性和系统
发育研究，探讨了土地利用变化对土壤真菌群落结构的影响。在 !$< 龄云杉（!"#$% &"’"%()$(*"* +%, -%&./0,"%(%(）人工林和菜地
两种类型土壤中，共得到 !CB 个阳性克隆，限制性内切酶 1*2, 和 3*%, 进行 YR*V 分析后得到 Z@ 个不同的分类操作单元
（)’[K），其中 !$<龄云杉人工林样地获得 #C" 个阳性克隆和 C" 个 )’[K，而菜地样地获得 #$# 个阳性克隆和 #? 个 )’[K。在两
类样地中具有不同的优势种群，其中 !$<龄云杉人工林样地有 # 个明显优势种群，占总克隆数的 !$2 >\；菜地样地有 ! 个明显
优势种群，分别占总克隆数的 !Z2 "\和 !#2 B\。对 #> 个克隆进行了序列测定，序列的相似性在 B@\ D ??\之间，与 +9=]<=^
数据库中的序列进行比对，与已知序列的相似性在 ?!\ D#$$\之间。系统发育分析表明，所有的 #B-JW.%基因被分为 C 个主
要的簇，其中 !$<龄云杉人工林样地的克隆都聚集在第一和第三簇中，而菜地样地的克隆都聚集在第二簇中。结果说明，两类
土壤中具有较为丰富的真菌多样性，而土地利用变化引起了土壤真菌群落结构的明显变化。
关键词：土地利用变化；真菌；群落结构；#B- JW.%；V&YAYR*V
文章编号：#$$$A$?CC（!$$"）#$A>C!ZA$BX 中图分类号：_?CB，-#Z>2 C@X 文献标识码：%
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1,+.,2,(-." ,.2*4’.(’0 "!’ 24.+-* ()334.,"> -.0 1"/4("4/’&
!"# $%&’(：*-.0 41’ (!-.+’1；24.+,；()334.,"> -.0 1"/4("4/’；;土壤微生物作为土壤有机碳周转的驱动力，土壤真菌是其中主要的成员，在纤维素、半纤维素、木质素、果
胶、还原氮、溶解磷等的分解中起重要作用，直接影响到土壤有机质的数量和组成［5］。虽然真菌在陆地生态
系统中有很重要的作用，但是人们对自然界的真菌多样性了解得还很少。由于缺少对群落中所有真菌都适应
的培养条件，大量真菌无法被分离培养，迄今为止，被正式描述的种类只占 98 R ;68 ［;，5］。受到全球气候变
化、环境污染和人类活动等诸多因素的影响，自然环境中真菌的种类和数量、分布都发生了显著的变化，真菌
多样性的研究也越来越受到人们的重视。为了克服传统培养方法的局限性，分子生物学方法被用于真菌研
究，特别是以 OIP技术为基础的核酸杂交、序列分析、DEF 指纹分析，如 OIPNPBQO、OIPNPFOD、OIPNFBQO、
OIPNDSST等技术的发展为深入研究真菌多样性和群落结构提供了可能［7 R <］。这些技术使人们在对真菌的
物种多样性、分布多样性和功能多样性等方面都有了新的认识。C)K’J 和 U-J 利用修改的 B4.+,Q)+ 法研究了
9 个随海拔高度升高的植被带和 H 个被干扰林业区的真菌群落，评价真菌功能多样性与土壤有机质的关系，
进而提出植被带碳源复杂性、输入的有机物质、同一系统碳源空间和时间差异性是与土壤真菌功能多样性有
潜在相关性的三个重要因素［<］。V,-40等通过内转录间隔区（W?C）OIPNPBQO分析，发现农田环境样品中包括
子囊、担子、接合菌门和归属真菌界的卵菌门和根肿菌门真菌［@］。
全球变化及温室气体浓度在大气中的迅速上升，已经成为各国政府、科学家及公众关注的热点。土地利
用变化是引起温室气体浓度增加的主要原因之一，仅次于化石燃料燃烧。目前，国内外研究者就土地利用 $覆
盖变化影响土壤有机碳的输入、输出、贮量、组分和残留等方面进行了大量的研究［A］，但研究的结论差异性还
较大，而且研究中对效应的研究较多，对机理的研究较少。本研究旨在应用 OIPNPBQO和测序分析，通过对川
西亚高山地区 56 世纪 <6 年代云杉人工林和菜地的土壤真菌 ;讨土地利用变化对土壤真菌群落结构的影响，为揭示土地利用变化对土壤有机碳的影响机理提供科学依据。
)* 材料和方法
)& )* 研究地概况和样品采集
研究区位于四川省理县米亚罗林区（@;X57Y R @;X99YE，;65X@9Y R ;6@X76YT），属于青藏高原东缘褶皱带最
外缘部分。地形以石质山地为主，坡度多在 @9X以上，海拔高差悬殊，处于 5566 R 99663 之间。高山气候，年
均温 H R ;5Z，极端高温 @5Z，极端低温 [ ;HZ，$;6Z的积温为 ;566 R ;766Z，年蒸发量为 ;666 R ;A6633，
常年无霜期 5660，年降水量为 H66 R ;;6633，具有降水次数多，强度小的特点［;6］。56 世纪 96 年代以来，该地
区进行了大量的采伐和人工更新，形成了原始林、次生林、人工林和由原始林开垦而来的农地等多样的土地利
用类型。
本研究选择 56-龄云杉（!"#$% &"’"%()$(*"* =-/ +%&,-./"%(%）人工林（@;X7:Y7H\ E，;65X75Y6@\ T，@5@@ 3）和
由原始林采伐后开垦为菜地（@;X7:Y7<\ E，;65X7;Y9H\ T，@;H< 3）两种土壤为研究对象。在每种土壤类型选
择 9 R ;6 个样点，分别垂直取 ; R ;6 (3深度的土壤，每个点取样量大体一致，去除石砾、根系和土壤动物等，
H5@7 ] 生] 态] 学] 报] ] ] 5: 卷]
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均匀混合后取少量装入灭菌的封口聚乙烯袋，带回实验室 / 012保存备用。
!& "# 方法
!& "& !# 土壤 345的提取
参照 6,(!-78等［99］和张于光等［9:］的方法提取土壤微生物总 345。将溶解的 345 在 ;1 < 电压下 1& =>
琼脂糖电泳 9:!；然后用 345回收试剂盒（?,) ?-@,( A.(& B-.8-）回收。
!& "& "# 9=C 7345的 DB6扩增
利用 9=C 7345 引物对 EFG;H：I’GJJ55JJJ（5 $ J）KJK5KKK5KK5JGL’和 FM.+GI7：I’GJK5555
JKBBKJJKKBBBGL’进行真菌 9=C 7345的基因扩增，该引物是在已有序列的基础上设计的，可以扩增出约
II1N#的片断［9L］。DB6反应体系（:I !*）含有：9 O DB6 ?MHH’7，:11!P)* $ Q 的 84KD@，:& 1 PP)* $ Q 的 R+: S，9
!P)* $ Q的正反引物，; !+的 ?C5和 :& 1 T的 !"# 345聚合酶。DB6扩增具体条件为：U; 2预变性 L P,.；U;
2 9 P,.，I: 2 ;I @，0: 2 9 P,.，;1 个循环，最后 0:2延伸 91 P,.。
!& "& $# DB6扩增产物的克隆和 6FQD分析
利用 9& I>琼脂糖电泳 DB6扩增产物，试剂盒（?,) ?-@,( A.(& B-.8-）回收目标片断。根据厂商提供的说
明书，用 #JERGK E-@V 载体试剂盒（D7)P’+- B)7#&，T& C& 5）对回收的目标片断克隆。挑选白斑，用载体
#JERGK E-@V 特异性引物 K0GK55K5BJ5BKB5BK5K5JJJ5J5 和 CDWGB5K5BJ5KKK5JJKJ5B5BK5K5J 对
克隆产物进行 DB6扩增，经电泳筛选有期望大小片断（约有 011N#大小的单一产物）的克隆。
将 K0和 CDW引物扩增所获得的产物用限制性内切酶$%&A和 ’%"A在 L02酶切 L X ;!，酶切后用 :& 1>的琼
脂糖凝胶电泳检测酶切结果。最后用凝胶成像分析系统 J’.’J’.,M@对结果进行数据统计和分析。
!& "& %# 基因测序和系统发育分析
为了进一步弄清 9=C 7345基因系统发育的多样性，选择部分 6FQD 谱带出现 : 次以上的克隆及部分单
一克隆进行基因测序，测序由北京百泰克（?,)"’Y’）生物技术有限公司完成。利用 345R54（版本 ;& 1）软件
对测序结果进行同源性比较，利用 ?Q5CK 软件，将测定得到的基因序列与 J’.?-.Y 数据库进行序列比对分
析，获取相近典型菌株的 9=C 7345基因序列。然后利用 B*M@"-* Z（版本 9& =）和 R’+-（版本 L& 1）中的邻接法
（4’,+!N)7G[),.,.+）建立 9=C 7345基因的系统发育树。
!& "& &# 核苷酸序列登录号
将测序得到的序列提交 J’.?-.Y数据库，数据库登录号为 3\=L;=1;G3\=L;=1=，3\=L;=9I，3\=L;=LWG
3\=L;=;L。
"# 结果与分析
"& !# 9=C 7345的克隆和 6FQD分析
将回收的 9=C 7345扩增片断进行连接转化克隆。从 : 个样品中共获得 :L= 个 9=C 7345克隆（表 9），所
得到的克隆用 $%&A和 ’%"A限制性内切酶进行 6FQD分析，通过 J’.’J’.,M@ 软件分析酶切结果，共获得 IW 个
不同的 9=C 7345可操作分类单元（]KT@）。RG=1 样地分别具有 9L0 个克隆数和 L0 个 ]KT@，而 RGB 样地的
克隆数和 ]KT@数均最少，分别为 919 个克隆和 9U 个 ]KT@。
表 !# 不同样地土壤真菌 ’()*和群落多样性指数
(+,-. !# (/. ’()* +01 123.4*256 201.7.* 89 *82- 9:0;2 <-8020; <8==:0256 20 1299.4.05 *25.*
样品编号
4)& @-P#*’
获得克隆数
B*).’@
]KT@数
]KT@
]KT@与克隆数之比值
6-",) )H ]KT@ ") ")"-* (*).’@
多样性指数-
3,^’7@,"V ,.8’_’@
RG=1 9L0 L0 1& :0 9& L0
RGB 919 9U 1& 9U 9& 1L
‘ ‘ -：根据 C!-..).GZ’-^’7指数计算‘ C!-..).GZ’-^’7 ,.8’_
在两个样地中，共发现 L 个明显优势种群（图 9），其中 RG=1 样地有 9 个明显优势种群，占总克隆数的
:1a ;>；RGB样地有 : 个明显优势种群，分别占总克隆数的 :I& 0>和 :9& =>。同时，在两个样地中还具有不
0:L;‘ 91期 ‘ ‘ ‘ 张于光‘ 等：土地利用变化对土壤真菌群落结构的影响 ‘
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接彩图 /
0123 4 生4 态4 学4 报4 4 4 15 卷4
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同的次要优势种群，分别占总克隆数的 /& 01 23& 41。在 5637 和 568两个样地中具有 0 个或 0 个以上克隆
的 9:;<分别占据了总克隆数的 /4& =1和 33& >1，而只有 ? 个克隆或单个克隆产生的 9:;< 分别占了总
9:;<的 @>& A1和 A/& A1。因此，在这两个样地中很大部分的 9:;<是由少量的克隆数产生的。
在两个样地中共发现 = 个 9:;<是两个样地所共有的，其中 5637 样地的优势种群 56376>7 克隆与 568
样地的次要优势种群 56867? 具有相同的 BCDE谱带型，而 5637 样地的次要优势种群 56376/0 克隆与 568样
地的次要优势种群 56867A 克隆具有相同的 BCDE 谱带型。另外，5637 样地中的 56376?7 克隆和 56376=/ 克
隆与 568样地中的 5686>> 克隆和 56860A 克隆都具有相同的 BCDE 谱带型。而其它的共有 9:;< 均是由单
克隆产生的。
!& !" >3F GHIJ基因的测序结果和系统发育分析
从所有的克隆中挑选出 >A 个克隆进行了测序分析。通过 HIJ5JI软件对所有序列进行了同源性比较，
序列相似性为 3=1 2441。通过 K’.L-.M中的 LDJF:软件，将所有的序列与 K’.L-.M 数据库中的序列进行
比对，除了 56376== 和 56376/0 克隆能在在数据库中找到完全相同的序列外，其它 >7 个克隆序列均没有发现
完全相同的序列，因此这些序列均是以前没有描述过的 >3FGHIJ基因序列，可能代表了以前没有描述过的真
菌种类。
在 K’.L-.M中选取了部分与测定序列相似性较高的 >3FGHIJ 基因序列，通过 8*N<"-* O 软件和 5’+- 软
件将这些序列构建系统进化树（图 ?），进行系统发育分析。从系统发育树可以看出，大部分的序列具有高度
的多样性，所有的 >3FGHIJ 基因被分为 0 个主要的簇，分属于多个不同的组群，其中绝大部分都聚集在第一
和第二簇中。
从图 ? 和表 ? 可以看出，5637 样地的克隆都分布在第一和第三簇中，而 568样地的克隆都分布在第二簇
中。所有的克隆序列都与已知的序列具有高度的相似性。其中 56376== 克隆与 !"#$%&’())& &$*#+’&’& 的 >3F
GHIJ序列具有 >771的相似性，而 56376/0 克隆与 ,-*"./0."#+ /#1."2$#+的 >3F GHIJ序列具有 >771的相似
性，说明这两个克隆与这些已知真菌是完全相同的。同时，其它克隆与已知真菌序列的相似性都在 4?1以
上，说明了这些克隆序列与已知序列可能是属于相同的属，甚至是相同的种。
表 !" 不同样品扩增的 #$% &’()序列特性
*+,-. !" /0+&+12.&3 45 #$% &’() 3.67.81. 98 :955.&.82 349- 3+;<-.3
克隆序列名
8*).’ I)&
K’.L-.M 登录号
K’.L-.M I)&
序列比较 F’PN’.(’ ()Q#-G,<).
核苷酸数- 相似性R
最相似的已知序列 （K’.L-.M 登录号）
563767= HS30A30= @@=R# 441 3)&4&"2./+2+ &5#&’2%& +’"&2$ 336 78>7/4> （JT0@/?/?）
56376>7 HS30A30/ @A>R# 4=1 9#++#)& (:&);2%&$+ （JT?40>@=）
56376?7 HS30A303 @A4R# 431 <$%#)’#"(1 +.2) =#$*#+ %).$( >#+0 A? = （JT>=0A?7）
56376@0 HS30A304 @A>R# 4=1 30"-+.@/0&)2$& *".++#)& 2+.)&’( A7!BC8DE 43> （JT/@?4=4）
56376=A HS30A3A7 @>3R# 4?1 F+2).%-;( %-&$(+%($+ 2+.)&’( A7!BC8DE 3>4 （JT/7@4A4）
56376== HS30A3A> @@=R# >771 !"#$%&’())& &$*#+’&’& （JC0A=@=7）
56376=/ HS30A3A? @A3R# 431 3."’2$&"2#+ 42.)&%(#+ 2+.)&’( A7!BC8DE 3>A （JT/7@4@7）
56376/0 HS30A3A0 @@/R# >771 ,-*"./0."#+ /#1."2$#+ 2+.)&’( A7!BC8DE >/?0 （HSAAA3=>）
56867> HS30A37A @A/R# 431 E2++./0."& 1(%#@;($+ （JC>@/>00）
5686>? HS30A37@ @A3R# 431 6."’2("())& 0-&)2$& （JT>@/A40）
56860> HS30A37= @A?R# 4/1 6."’2("())& /&"42+/."& （JT>?4@A4）
56860? HS30A37/ @A3R# 431 E2++./0."& 1(%#@;($+ （JC>@/>00）
56860@ HS30A373 @0/R# 4=1 <$%#)’#"(1 "02G.+/0("( G-*.@-%(’( （JU@7=7?7）
5686@3 HS30A3>@ @A@R# 4/1 6."’2("())& 0-&)2$& （JT>@/A40）
V V -：用于序列比较的核苷酸数 :!’ .N(*’)",W’< )X <’PN’.(’ ()Q#-G,<).；R：与系统发育关系最近的已知序列的相似度；:!’ .’-G*Y <,Q,*-G,"Y %,"!
"!’ M.)%. <’PN’.(’ ,. K’.R-.M
4?0AV >7期 V V V 张于光V 等：土地利用变化对土壤真菌群落结构的影响 V
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
图 /0 根据遗传距离建立的 123 4567基因系统发育树
8,+& /0 9!:*)+’.’",( -.; <)*’(=*-4 ’>)*=",).-4: -.-*:?’? )@ 123 4567 %’4’ ().;=("’; A: +’.’",( ;,?"-.(’
树用邻接法构建，各枝上的数字是 1BBB 次 A))"?"4-# 重抽样分析的支持百分比 C!’ "4’’ %-? ().?"4=("’; A: 6’,+!A)4DE),.,.+ #4)(’;=4’ ,. "!’
?)@"%-4’ )@ F’+- （G& B）；C!’ *’.+"! -.; A))"?"4-# ().@,;’.(’ >-*=’? )@ ’-(! A4-.(! -4’ ,.;,(-"’; -A)>’ )4 A’*)% "!’ A4-.(!，4’?#’(",>’*:
!" 讨论
土壤中只有极少一部分微生物是可以被培养的，绝大多数因为无法培养而不为人所知。基于土壤微生物
群落总 567的分子方法避免了传统分离培养方法的缺点，因此，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以
及动态监测研究［1H］。另外，随着 567的测序以及数据库的建立和发展，也促进了以 567为基础的分子生物
学方法用于研究环境样品中微生物种群的多样性和特异性，以及环境和种群进化的关系［1I］。123 4567 序列
因其保守性强，并含有可变区，受环境因素影响较小，常常被用于比较不同真菌菌株间的系统发育，因此，123
4567基因的研究和分析使真核生物之间的进化关系和特定环境下微生物种群的鉴定成为可能，对微生物生
态和微生物种群结构的研究提供了便利［1I］。
本研究应用 9JKDK8L9和测序分析对川西亚高山米亚罗林区 /B- 龄云杉人工林和菜地土壤的真菌 123
4567基因的多样性和系统发育进行了比较。结果表明，两类不同的土地利用类型具有明显不同的真菌 123
4567克隆数、MCN?数和多样性指数，在 /B- 龄云杉人工林具有相对较高的 MCN? 和多样性指数，并且，两个
样地间具有不同地优势种群。因此，表明 /B-龄云杉人工林具有更为丰富的真菌多样性，土地利用变化明显
地影响了土壤真菌的群落结果。已有的研究也大都表明土地利用 $覆盖变化对土壤真菌多样性具有明显的影
响，O’等同时应用 CPPQ、33J9和测序研究了澳大利亚天然林和与之相邻地松树人工林土壤真菌多样性，结
果表明两者的真菌群落结构具有明显差异［1R］。K-.S-4; 等应用核糖体 K67基因间隔区自动分析（7KT37）研
究不同地理起源、植被覆盖、具有理化差异地土壤真菌群落，发现不同地点土壤真菌图谱条带的数量、亮度及
群落优势结构截然不同［1U］，拉姆托热带地区土壤真菌 7KT37 图谱主要条带在 IIBA#，而其它地区在 HBB V
2BBA#之间。W=(!-.等通过 TC3区 CDK8L9图谱分析了盐沼泽地子囊菌群落腐生真菌腐生早期和晚期群落组
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成，指出其具有重要地空间同种性［/0］。
目前对土地利用变化影响土壤有机碳分解的机制还不完全清楚，土地利用变化可能通过影响土壤微生物
的群落结构和功能多样性来影响土壤有机碳的分解［/1，23］。真菌参与土壤有机质的分解和腐殖质合成，直接
影响土壤有机质的含量，而土壤有机质的增减也能改变土壤真菌的数量和组成［2/］。从系统发育树上可以看
出，不同样地具有不同的优势种群，所有序列在系统发育树上都明显的分属于不同的簇，表明两种土地利用类
型中具有明显不同的真菌种群结构。因此，土地利用变化对土壤有机碳的影响机制与土壤真菌群落结构的变
化可能存在一定的相关性，具体的关联度还有待深入研究。
应该说明的是，表 / 中的数值并不是样地中真菌数量的极限值，因为工作量、时间和经费等的局限性，从
每个土壤样品中获得的 456 并没有全部被用于克隆，且获得的克隆也没有全部用于 789: 分析，因此，土壤
中的微生物种类的数量应该比表中数值更高。
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