全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１５，２９（１）：００４９ ～ ００５５
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃１２⁃１６　 接受日期：２０１４⁃０９⁃１７
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（ＲＩＦ２０１３⁃１０），北京市自然科学基金资助项目（６１４４０３０），国家林业局林业公益性物
业科研专项（２０１３０４７１０）
作者简介：梁丽松，女，副研究员，主要从事经济林培育研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉａｎｇｌｓｃａｆ＠ １２６． ｃｏｍ
通讯作者：王贵禧，男，研究员，榛属植物资源研究与利用研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗａｎｇｇｘ０１１４＠ １２６． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１５）０１⁃００４９⁃０７
平榛 ＭＡＰＫＫ基因克隆及在非生物胁迫下的表达分析
梁丽松　 赵天田　 马庆华　 王贵禧
（中国林业科学研究院林业研究所 ／国家林业局林木培育重点实验室 ／林木遗传育种国家重点实验室，北京　 １０００９１）
摘　 要：通过研究外界刺激信号对平榛中促分裂原活化蛋白酶途径的影响，探索该途径中 ＭＡＰＫＫ 类基
因对各种非生物胁迫的响应机制。 根据平榛花芽转录本高通量测序的结果，采用 ＲＡＣＥ⁃ＰＣＲ 方法克隆
到一个平榛 ＭＡＰＫＫ基因，全长 １ ０６５ｂｐ，推断其编码 ３５４ 个氨基酸，命名为 ＣｈＭＡＰＫＫ２。 序列分析表明，
该基因含有 ＭＡＰＫＫ类型基因典型的磷酸一致化序列 ＳＬＡＤＩＤＳ。 构建的系统发育树结果表明，它与葡
萄 ＶｖＭＡＰＫＫ２ 以及苹果 ＭｄＭＡＰＫＫ 的亲缘关系较近，相似性分别为 ８１􀆰 ６９％和 ７８􀆰 ５３％ 。 采用 ｑＲＴ⁃
ＰＣＲ，以 ＡＣＴＩＮ为内参对 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在自然条件下花芽部位的表达模式进行分析，结果表明：在自
然条件下从 １１ 月份到次年 ４ 月份 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 的表达量呈现先上升后下降的趋势；对平榛根蘖苗进行
４℃、干旱及盐胁迫处理，发现 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因均受上述 ３ 种非生物胁迫的诱导而上调表达；ＣｈＭＡＰＫＫ２
在不同器官中的表达具有组织表达特异性，雌花芽中表达量最高，其次是树皮，雄花序中表达量最低。
上述研究结果表明 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在平榛适应非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。
关键词：平榛；ＭＡＰＫＫ；基因克隆；非生物胁迫；表达模式
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１５􀆰 ０１． ００４９
　 　 植物在生长和发育的过程中经常受到各种不同的
非生物胁迫，为了适应这些胁迫，植物在进化的过程中
会形成一定的生理生化机制，用来适应或抵御不同的
胁迫环境［１］。 植物中存在许多参与非生物胁迫的信
号途径，在植物受到低温、干旱及盐胁迫后，会通过一
系列的信号传导，最终诱导相关基因的表达，进而引起
植物生理上的变化［２］。 其中丝裂原活化蛋白激酶
ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）级联信号途径
是最主要的途径之一［３］， ＭＡＰＫ 级联途径是由
ＭＡＰＫＫＫ （ ｍｉｔｏｇｅｎ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ
ｋｉｎａｓｅ ）⁃ＭＡＰＫＫ （ ｍｉｔｏｇｅｎ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ
ｋｉｎａｓｅ）⁃ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）组成，
通过逐级磷酸化的方式将多种胁迫信号逐级放大、传
递给靶蛋白［４］。 大量研究表明 ＭＡＰＫ 信号转导系统
参与了低温、干旱、高盐、活性氧等非生物胁迫的响应
过程［５ － ９］。 目前，已经从拟南芥［１０］、水稻［１１］、玉米［１２］、
烟草［１３］、苹果［２］等植物中分离得到了 ＭＡＰＫｓ 基因，其
中在拟南芥中已经发现有 ８０ 个 ＭＡＰＫＫＫ、 １０ 个
ＭＡＰＫＫ基因，水稻中有 ７５ 个 ＭＡＰＫＫＫ、８ 个 ＭＡＰＫＫ
基因，杨树中发现有 １１ 个 ＭＡＰＫＫ基因等。
平榛 （Ｃｏｒｙｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ． ） 为 桦 木 科
（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）榛属（Ｃｏｒｙｌｕｓ）植物，据不完全统计，我国
现有榛林 １６７ 万 ｈｍ２，其中 ９５％是平榛［１４］。 平榛是我
国原产榛属植物中最有经济利用价值的一种，具有抗
寒、耐瘠薄、抗枯萎病等特点，平榛可抗冬季 － ４８℃的
极端低温，抗寒能力远强于在美国、土耳其及意大利等
国家广泛种植的欧洲榛。 目前在平榛上关于 ＭＡＰＫＫ
基因在不同非生物胁迫下所介导的植物信号转导过
程，尤其是低温逆境下的响应调控机制还未见报道。
本研究利用 ＲＡＣＥ⁃ＰＣＲ 技术从平榛中分离克隆了一
个 ＭＡＰＫＫ基因，并对该基因在自然条件下（２０１１ 年
１１ 月 － ２０１２ 年 ４ 月）、不同非生物胁迫及不同组织中
的表达特性进行了分析，以期探讨平榛 ＭＡＰＫＫ 基因
在非生物胁迫信号转导中的作用。 通过挖掘和发现平
榛中的抗逆境基因对于今后采用基因工程手段培育抗
寒榛子新品种具有重要的意义。
９４
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
１　 材料与方法
１􀆰 １　 试验材料及处理
试验的平榛材料取自于河北木兰围场国有林场，
为保证基因型的一致性，从生长健康无病害的同一平
榛母株上面分离根蘖苗，将挖回的根蘖苗定植于温室。
１􀆰 １􀆰 １　 在自然越冬条件下平榛花芽中 ＭＡＰＫＫ 基因
表达分析的材料处理　 于 ２０１０ 年 １１ 月 － ２０１１ 年 ４ 月
于野外每隔 １ 个月取 １ 次雌花芽，取材后立即投入液
氮冻干，随后保存于 － ８０℃冰箱。 研究自然条件下平
榛 ＭＡＰＫＫ基因的表达情况。
表 １　 平榛 ＭＡＰＫＫ基因克隆以及实时荧光定量表达分析引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅ ｏｆ ＭＡＰＫＫ ｉｎ Ｃｏｒｙｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
引物作用
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
３′ＲＡＣＥ ５′⁃ＧＡＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＴＡ⁃３′ ３′末端扩增
５′ＲＡＣＥ ５′⁃ＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴ⁃３′ ５′末端扩增
ＵＰＭ⁃Ｌｏｎｇ ５′⁃ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣ
ＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ⁃３′
获取基因 ５′和 ３′端
　
ＵＰＭ⁃Ｓｈｏｒｔ ５′⁃ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ⁃３′
ＭＡＰＫＫ⁃Ｆ ５′⁃ＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡ⁃３′ 实时荧光定量检测 ＭＡＰＫＫ的表达
ＭＡＰＫＫ⁃Ｒ ５′⁃ＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＴＴＧＴＧＣＴＧ⁃３
Ａｃｔｉｎ⁃Ｆ ５′⁃ＴＧＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣ⁃３′ 扩增内标，１０１ｂｐ
Ａｃｔｉｎ⁃Ｒ ５′⁃ＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＡ⁃３′
１􀆰 １􀆰 ２　 在非生物胁迫下平榛叶片中 ＭＡＰＫＫ 基因表
达分析的材料处理　 将基因型一致的平榛根蘖苗培育
１ 年，于第 ２ 年 ６ 月份选择长势一致、健康无病害的平
榛根蘖苗进行处理。 分别进行 ４℃低温胁迫处理、旱
处理（２０％的 ＰＥＧ６０００）和盐处理（４００ｍＭ 的 Ｎａｃｌ），
分别在处理 ０、２、４、８、２４ｈ 时采集叶位相同叶片（完全
展开的第 ４ ～ ５ 片叶），每个处理设 ３ 个重复，３ 个重复
混合取样。 其他条件为光照强度 １００μｍｏｌ·ｍ － ２·ｓ － １，
光照时间 １６ｈ，湿度 ８０％ ～９０％ 。
１􀆰 １􀆰 ３　 平榛不同组织器官中 ＭＡＰＫＫ 基因表达分析
的材料处理　 于 ２０１１ 年 １ 月份分别取平榛的雌花芽、
雄花序及韧皮部，用于检测 ＭＡＰＫＫ 基因在平榛不同
组织器官中的表达情况。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 平榛 ＭＡＰＫＫ 基因的克隆与序列分析 　 从平
榛花芽的 Ｓｏｌｅｘａ 转录组测序结果中获得了 １ 个
Ｕｎｉｇｅｎｅ１５ ９８０ 序列片段，通过 Ｂｌａｓｔ 比对分析，推测其
可能是 １ 个 ＭＡＰＫＫ 基因，根据序列设计引物进行
ＲＡＣＥ扩增，ＲＡＣＥ 扩增引物见表 １。 平榛总 ＲＮＡ 提
取采用 ＣＴＡＢ法［１５］，利用 ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ试剂盒反转
录得到第一链，采用 Ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ ＰＣＲ 程序扩增，扩增
产物进行凝胶回收，连接载体后转化感受态细胞，然后
进行蓝白斑筛选和菌落 ＰＣＲ检测正确后，送生物技术
公司进行测序。 利用 ＤＮＡＭＡＮ（６􀆰 ０ＤＥＭＯ）软件将获
得的 ５′和 ３′ ＲＡＣＥ序列进行拼接，得到全长 ｃＤＮＡ 序
列。 在 ＧｅｎＢａｎｋ上进行 Ｂｌａｓｔ比对，确定所克隆的基因
为 ＭＡＰＫＫ基因。 用在线软件 ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．
ｅｘｐａｓｙ． ｏｒｇ）预测所编码蛋白的分子量、理论等电点及
保守结构域等。 多重序列比对及系统进化树分析用
Ｍｅｇａ４ 软 件 进 行。 使 用 在 线 的 软 件 Ｗｏｌｆ Ｐｓｏｒｔ
（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ． ｏｒｇ ／ ）进行亚细胞定位的预测分析。
１􀆰 ２􀆰 ２　 平榛 ＭＡＰＫＫ 基因的实时荧光定量 ＰＣＲ 表达
分析　 将不同处理材料的总 ＲＮＡ 反转录合成 ｃＤＮＡ，
作为进行实时荧光定量 ＰＣＲ 的模板。 以 Ａｃｔｉｎ⁃Ｆ 和
Ａｃｔｉｎ⁃Ｒ为内参基因的引物序列［１６］。 根据实时荧光定
量 ＰＣＲ 的设计原则设计特异引物 ＭＡＰＫＫ⁃Ｆ 和
ＭＡＰＫＫ⁃Ｒ见表 １，用于目的基因的表达分析。
　 　 参照 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）说
明书，反应在 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ ＣＦＸ９６ 实时荧光定量 ＰＣＲ 仪上
进行。 参考说明书将反转录体系优化为：总 ＲＮＡ
１􀆰 ５μＬ（１ μｇ），ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（２ × ）９μＬ，ＰＣＲ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （ １０μＭ ） １μＬ， ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ
（１０μＭ）１μＬ，加 ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ７􀆰 ５μＬ 至 ２０μＬ。 扩
增程序为：９５℃预变性 ３ｍｉｎ；９５℃变性 ２０ｓ，５３℃退火
２０ｓ，７２℃延伸 ２０ｓ，共 ３９ 个循环；６５ ～ ９５℃ ３０ｓ 结束。
每个处理的每个时间点设 ４ 次重复。 试验结果利用
Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ软件进行数据分析。
０５
　 １ 期 平榛 ＭＡＰＫＫ基因克隆及在非生物胁迫下的表达分析
２　 结果与分析
２􀆰 １ 平榛 ＭＡＰＫＫ基因的克隆及序列分析
以平榛花芽的 ｃＤＮＡ 为模板，根据平榛花芽高通
量测序结果筛选得到 Ｕｎｉｇｅｎｅ１５ ９８０ 片段设计 ３′端特
异引物，通过 ＲＡＣＥ⁃ＰＣＲ 扩增、产物回收后，如图 １ 所
示，得到长度为 ７７１ｂｐ 的 ３′末端，５′ＲＡＣＥ 引物是根据
３′ＲＡＣＥ扩增得到的片段设计的，得到的片段长度为 １
０７１ｂｐ。 利用 ＲＴ⁃ＰＣＲ，获得 １ 条 １ ０６５ｂｐ 的序列（图
２），通过 ＮＣＢＩ 上的 Ｂｌａｓｔ 对比发现，获得的序列与
ＭＡＰＫＫ基因同源，其中与拟南芥中 ＭＡＰＫＫ 类基因同
源性最高的为 ＡｔＭＫＫ２，命名为 ＣｈＭＡＰＫＫ２。 利用
ＮＣＢＩ提供的 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 和在线软件 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 进行
分析发现，该序列包含 １ 个 １ ０６５ｂｐ 的开放阅读框，编
码 ３５４ 个氨基酸，分子量为 ３９􀆰 ３２ｋＤ，理论等电点（ｐＩ）
为 ５􀆰 ８２。 如图 ２ 斜体部分所示， ＣｈＭＡＰＫＫ２ 含有
ＭＡＰＫＫ类型基因典型的磷酸一致化序列 ＳＬＡＤＩＤＳ。
应用 Ｗｏｌｆ Ｐｓｏｒｔ软件对平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因进行亚细
胞定位分析，预测的数据如下：ｋ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｋＮＮ ｉｓ： １４
ｑｕｅｒｙＰｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔａｉｌｓ ｃｙｔｏ： １１􀆰 ０， ｎｕｃｌ： １􀆰 ０， ｍｉｔｏ： １􀆰 ０，
ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｃｙｔｏ得分为 １１􀆰 ０，预测定位于细胞质。
注：条带 ａ 是 ＣｈＭＡＰＫＫ２ ３′ ＲＡＣＥ 扩增产物， 条带 ｂ 是
ＣｈＭＡＰＫＫ２ ５′ ＲＡＣＥ扩增产物，Ｍ是 ＤＮＡ标准分子量 ＤＬ２０００。
Ｎｏｔｅ： Ｌａｎｅ ‘ａ’ ｉｓ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ３′ ＲＡＣＥ； ｌａｎｅ ‘ｂ’
ｉｓ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ５′ ＲＡＣＥ； ａｎｄ ｌａｎｅ ‘Ｍ’ ｓｈｏｗｓ ＤＮＡ
　 　 　 　 ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００．
图 １　 平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因的 ＰＣＲ扩增电泳图
Ｆｉｇ． １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣｈＭＡＰＫＫ２
ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ
２􀆰 ２　 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因所编码的氨基酸序列分析
利用 ＤＮＡＭＡＮ软件对 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因编码的氨
基酸序列以及 ＮＣＢＩ 上的 １１ 条氨基酸序列进行多重
比对。 结果表明，平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 氨基酸序列与葡萄
ＶｖＭＡＰＫＫ２（ＸＰ＿００２２８０８７７􀆰 １）氨基酸序列的相似性
最 高 为 ８１􀆰 ６９％ ； 其 次 与 苹 果 ＭｄＭＡＰＫＫ
（ＡＣＹ８２５１５􀆰 １）的相似性达到了 ７８􀆰 ５３％ ；与玉米中
ＭＡＰＫＫ类型的 ＺｍＭＫＫ６（ＡＣＧ４０５９１􀆰 １）的相似性相
对较低，只有 ５９􀆰 ３８％ 。 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 与拟南芥中的
ＡｔＭＫＫ２（ＸＰ＿００２８６７３８７􀆰 １）的相似性高于 ＡｔＭＡＰＫＫ１
（ＮＰ＿１９４３３７􀆰 １）。 构建包括平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 蛋白序
列在内的系统进化树（图 ３），从图中可以很清楚的看
到平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 与葡萄 ＶｖＭＡＰＫＫ２ 的关系较近，
聚 为 一 个 分 支。 另 外， 玉 米 的 ＺｍＭＫＫ６
（ＡＣＧ４０５９１􀆰 １）、水稻的 ＯｓＭＡＰＫＫ （ ＡＢＩ９３７７５􀆰 １ ）和
ＯｓＭＡＰＫＫ１ （ ＡＢＰ８８１０２􀆰 １ ） 聚到 １ 个组中，与平榛
ＣｈＭＡＰＫＫ２ 相距最远。
２􀆰 ３　 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 在自然越冬条件下的表达分析
以 ＣｈＡｃｔｉｎ 为内参，对平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在自
然越冬条件下花芽中的表达情况进行分析。 结果表
明：自然越冬条件下 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在 １１ 月份就已
经具有较高的表达量，在 １ 月份时 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因的
表达量达到一个较高的水平，２、３ 月份同 １ 月份相比
变化不大，维持在一个较稳定的水平，但高于 １１ 月份
的表达量，４ 月份的表达量下降明显。
２􀆰 ４　 ＣｈＭＡＰＫＫＫ２ 在 ４℃、旱及盐胁迫后的表达分析
为了排除外界因素的干扰，在生长季节对平榛根
蘖苗进行 ４℃低温、盐及 ＰＥＧ旱胁迫处理，用以研究平
榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在非生物胁迫下的表达情况。 由
图 ５ － Ａ可知，ＣｈＭＡＰＫＫ２ 在低温处理 ２ｈ 后开始上调
表达，随后在处理 ４、８ｈ 后的表达量与处理 ２ｈ 相比变
化不大，在处理 ２４ｈ后表达量略有上升，达到最高的表
达量；由图 ５ － Ｂ 可知，ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在旱处理 ２ｈ
后，表达量迅速上调，达到最大表达丰度，随后
ＣｈＭＡＰＫＫ２ 的表达量在处理 ４ｈ后有一个短暂的下降，
在处理 ８、２４ｈ 后表达量又迅速升高；由图 ５ － Ｃ 可知，
ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在盐处理 ２４ｈ 后达到最高的表达量。
上述结果表明，ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因均受 ４℃低温、盐及
ＰＥＧ旱胁迫的诱导而上调表达。
２􀆰 ５　 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在平榛不同组织中的表达分析
如图 ６ 所示，以平榛 ＣｈＡｃｔｉｎ 基因为内参基因，采
用实时荧光定量 ＰＣＲ 的方法对平榛不同组织中
ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因的表达情况进行了检测，结果表明：
ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在花芽中的表达量最高、其次是树皮
中，雄花序中表达量最低。 虽然在检测的 ３ 个平榛组
织中都有基因的表达，但是表达量存在着差异，具有一
定的组织表达特异性。
３　 讨论
植物中存在的 ＭＡＰＫ 级联信号传导途径是植物
１５
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
注：起始密码子和终止密码子用下划线表示；磷酸化一致序列用斜体表示。
Ｎｏｔｅ： Ｔｈｅ ｓｔａｒｔ ａｎｄ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｉｎ ｉｔａｌｉｃ．
图 ２　 平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因的全长 ｃＤＮＡ与编码的氨基酸序列
Ｆｉｇ． ２　 Ｔｈｅ ｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｇｅｎｅ
感受外界低温、干旱及盐等非生物胁迫的最主要的途
径之一［２ － ３］。 本研究通过 ＲＡＣＥ技术从平榛中克隆得
到 １ 个 ＭＡＰＫＫ基因 ＣｈＭＡＰＫＫ２，ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因与其
他木本植物中克隆得到的 ＭＡＰＫＫ 基因编码的蛋白质
比较，具有很高的相似性，表明 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因属于
ＭＡＰＫＫ基因，含有的 ＭＡＰＫＫ 类型基因典型的磷酸一
致化序列 ＳＬＡＤＩＤＳ。 通过对 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在自然
越冬条件下与非生物胁迫下的表达情况进行分析发
现，ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因受低温、干旱及盐等 ３ 种非生物胁
迫的诱导而上调表达，但是表达的趋势和达到最高表
达丰度的时间有差异。 另外，对 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因平榛
不同组织中的表达情况进行分析，发现 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基
因在花芽中的表达量最高，具有组织表达特异性。
从平榛花芽的 Ｓｏｌｅｘａ转录组测序结果中还获得了
另外一个 Ｕｎｉｇｅｎｅ２１７７０ 的序列片段，克隆得到基因全
长后 发 现 与 ＭＡＰＫＫＫ 基 因 同 源， 暂 命 名 为
ＣｈＭＡＰＫＫＫ。 将 ＣｈＭＡＰＫＫＫ 和 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 这 ２ 个基
因编码的氨基酸序列分别与拟南芥中的 ８０ 个
２５
　 １ 期 平榛 ＭＡＰＫＫ基因克隆及在非生物胁迫下的表达分析
图 ３　 平榛 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 与其它物种ＭＡＰＫＫ
蛋白序列系统进化树分析
Ｆｉｇ． ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒｅｅ ｏｆ ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｉｎ
Ｃｏｒｙｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ． ａｎｄ ｏｔｈｅｒ
ＭＡＰＫＫ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
注：ＣｈＡｃｔｉｎ作为内参基因，花芽采集时间：２０１０ － １１ － １， ２０１０ －
　 　１２ － １， ２０１１ － １ － １， ２０１１ － ２ － １， ２０１１ － ３ － １， ２０１１ － ４ － １。
Ｎｏｔｅ： ＣｈＡｃｔｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｄａｔｅ
ｏｆ ｂｕｄｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ：２０１０ － １１ － １， ２０１０ － １２ － １， ２０１１ － １ － １，
　 　 　 　 ２０１１ － ２ － １， ２０１１ － ３ － １， ２０１１ － ４ － １．
图 ４　 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在自然越冬条件下的表达情况分析
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｇｅｎｅ
ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｗｉｎｔｅｒ
ＭＡＰＫＫＫ、１０ 个 ＭＡＰＫＫ 基因编码的氨基酸序列进行
比对后发现，ＣｈＭＡＰＫＫＫ 和 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 分别与拟南
芥中的 ＡｔＭＥＫＫ１ 和 ＡｔＭＫＫ２ 的氨基酸序列相似性最
高。 根据 Ａｓａｉ 等［１７］的报道拟南芥 ＡｔＭＥＫＫ１ 可受高
盐、干旱、低温及创伤诱导。 Ｔｅｉｇｅ 等［１８］研究拟南芥的
原生质体时发现，拟南芥 ＡｔＭＫＫ２ 可以被高盐、低温和
ＡｔＭＥＫＫ１ 基因诱导激活，并且 ＡｔＭＫＫ２ 过表达的转基
因植株提高了对低温和盐胁迫的抗性。 利用酵母双杂
交系统，Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ 等［１９］证明 ＡｔＭＥＫＫ１ 参与拟南芥植
物中传递低温胁迫信号的 ＭＡＰＫ 级联途径，该途径为
注：ＣｈＡｃｔｉｎ作为 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ的内参基因，分别在处理
０、２、４、８、２４ｈ后采集叶片。
Ｎｏｔｅ： ＣｈＡｃｔｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ．
Ｔｈｅ ｌｅａｆ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ａｒｅ ０， ２， ４， ８， ２４ｈ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．
图 ５　 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在低温、旱及盐胁迫后的表达情况
Ｆｉｇ． ５　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＣｈＭＡＰＫＫ２
ｇｅｎｅ ｂｙ ４℃， ＰＥＧ ａｎｄ ｓａｌｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＡｔＭＥＫＫ１ （ＭＡＰＫＫＫ 同源物）—ＭＥＫ１ （ＭＡＰＫＫ 同源
物）—ＡｔＭＰＫ４（ＭＡＰＫ同源物），传递途径与酵母类似。
对平榛 ＣｈＭＡＰＫＫＫ 基因在不同非生物胁迫诱导下的
表达情况进行分析后发现，ＣｈＭＡＰＫＫＫ 也受低温、干
旱及盐等的诱导而上调表达（数据待发表）。 因此，我
们推测分别与拟南芥 ＡｔＭＥＫＫ１ 和 ＡｔＭＫＫ２ 基因相似
性较高的平榛 ＣｈＭＡＰＫＫＫ 及 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因可能具
有类似的功能及信号转导作用。
目前研究认为 ＭＡＰＫ 级联信号传导途径［２０］在信
号途径中可能会修饰及调控转录因子以激发其表达。
Ａｓａｉ等［１７］及 Ｋｉｍ 等［２１］发现某些 ＷＲＫＹ 转录因子的
功能受丝裂原激活蛋白激酶（即ＭＡＰＫ）的调节。 本研
３５
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
图 ６　 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在平榛不同组织中的表达情况
Ｆｉｇ． ６　 ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ
ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ． ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ
ｍａｌｅ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ， ｂａｒｋ ａｎｄ ｆｌｏｒａｌ ｂｕｄ
究对平榛的转录组测序结果分析后发现 ＷＲＫＹ 转录
因子的 Ｕｎｉｇｅｎｅ序列最多，已发表的研究报道也认为
ＷＲＫＹ转录因子同许多生物胁迫及非生物胁迫有
关［２２ － ２５］。 本研究对平榛中的 ３０ 个 ＷＲＫＹ 转录因子
在 ４℃低温、盐及旱等胁迫下的表达情况进行分析后
发现，其中有 ２０ 个基因均受上述 ３ 种胁迫的诱导而上
调表达，但是上调表达的程度以及最高表达量出现的
时间存在着差异。 研究报道认为植物体内的 ＭＡＰ 激
酶级联系统可将外界各种诱导因素的信号传递到细胞
内并激活 ＷＲＫＹ 转录因子的活性，而 ＷＲＫＹ 转录因
子可以进一步调控相关功能基因的表达以提高植物的
抗逆性。 在平榛中，ＣｈＭＡＰＫＫＫ 及 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 这 ２ 个
基因可能具有调控 ＷＲＫＹ转录因子的作用，通过调控
ＷＲＫＹ转录因子进而间接提高了平榛对低温以及其
它胁迫的抗性。 植物对非生物胁迫的响应是一个复杂
的调控过程，ＭＡＰＫ 级联信号传导途径主要是通过磷
酸化 －去磷酸化传递信号，但里面也涉及到许多其他
的信号传导及调控途径，如彭立新等［２］在研究西府海
棠中 ＭａＭＡＰＫ 基因的表达特性时认为 ＭａＭＡＰＫ 基因
除了通过磷酸化 －去磷酸化传递信号外，还可能通过
某条信号途径传递活性氧信号，调节抗氧化酶类活性，
从而影响植物的耐旱性。 因此，对于 ＭＡＰ激酶级联系
统中的 ＣｈＭＡＰＫＫＫ 及 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 这 ２ 个基因到底与
平榛中的哪些转录因子尤其是哪些 ＷＲＫＹ 转录因子
相互作用，还需要进行进一步的研究。
４　 结论
本研究采用 ＲＡＣＥ⁃ＰＣＲ 的方法从平榛中克隆得
到了 １ 个 ＭＡＰＫＫ 类基因 ＣｈＭＡＰＫＫ２。 ＣｈＭＡＰＫＫ２ 含
有 ＭＡＰＫＫ 类 型 基 因 典 型 的 磷 酸 一 致 化 序 列
ＳＬＡＤＩＤＳ，能够在 ＭＡＰＫ 级联信号传导途径中起到传
导作用。 不同非生物胁迫下的表达情况表明
ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因均受低温、干旱及盐等 ３ 种非生物胁
迫的诱导而上调表达。 另外，ＣｈＭＡＰＫＫ２ 基因在花芽
中的表达量高于树皮和雄花序中的表达量，具有组织
表达特异性。
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Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＰＫＫＫ
Ｆｒｏｍ Ｃｏｒｙｌｕｓ Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ
ＬＩＡＮＧ Ｌｉｓｏｎｇ　 ＺＨＡＯ Ｔｉａｎｔｉａｎ　 ＭＡ Ｑｉｎｇｈｕａ　 ＷＡＮＧ Ｇｕｉｘｉ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｅｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ／ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｅｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，
Ｓｔａｔｅ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ／ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ　 １０００９１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｔｉｍｕｌｉ ｏｎ ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ， ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＭＡＰＫＫ ｇｅｎｅ
ｉｎ Ｃｏｒｙｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｈａｚｅｌｎｕｔ ｂｕｄｓ， ａ １ ０６５ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＡＣＥ⁃
ＰＣＲ． Ｉｔ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ３５４ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ａｓ ＣｈＭＡＰＫＫ２。 Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｈａｄ
ＳＬＡＤＩＤＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｔｙｐｉｃａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＭＡＰＫＫ ｆａｍｉｌｙ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｔｒｅｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｗａｓ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ＶｖＭＡＰＫＫ２ ｆｒｏｍ ｇｒａｐｅ ａｎｄ ＭｄＭＡＰＫＫ ｆｒｏｍ ａｐｐｌｅ， ｗｉｔｈ ８１􀆰 ６９％ ａｎｄ ７８􀆰 ５３％ ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈａｚｅｌｎｕｔ ｂｕｄｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ＡＣＴＩＮ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ ｕｎｄｅｒ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｆｉｒｓｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｄｕｒｉｎｇ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ｔｏ ｎｅｘｔ Ａｐｒｉｌ． Ｅｎｈａｎｃｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅｎ ｓｕｃｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ
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Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＣｈＭＡＰＫＫ２ ｇｅｎｅ ｐｌａｙｅｄ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃ． ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ａｂｉｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｙｌｕｓ Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ Ｆｉｓｃｈ． ， ＭＡＰＫＫ ｇｅｎｅ， ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ
５５