全 文 ：!核 农 学 报!"#$%!"&"# $$$"& ($$,)
!"#$%&"()#*+&$,-$.*#/#$&0*.+%*+1
收稿日期!"#$)*#+*"%!接受日期!"#$%*#"*#,
基金项目!山东省科技发展计划项目""#$"RYb$$%"A#
作者简介!隋晓!女!副教授!主要从事天然产物研究与开发研究% 0*1234$@=3^327gP;@382>:71
通讯作者!韩玉谦!男!教授!主要从事超H亚临界流体萃取技术及应用)食品质量及安全)海洋生物资源的高效利用技术研究%
0*1234$628<=g328;7=:>XP=>:8
文章编号!$###*A%%$""#$%##*$$"&*#
亚临界 L$,)2脱除鸢乌贼卵中胆固醇的工艺研究
隋!晓$!冯晓梅"!岳荣岩"!韩玉谦"!薛长湖"
" $青岛大学生命科学学院!山东 青岛!"#+$& " 中国海洋大学食品科学与工程学院!山东 青岛!"##,#
摘!要!为了从鸢乌贼卵中获得不含胆固醇的优质动物磷脂!分别研究了原料预处理方法"单因素萃取对
胆固醇脱除率的影响!并在单因素试验的基础上!利用正交试验对亚临界 L$,)2萃取技术脱除鸳乌贼
卵中胆固醇的工艺进行了优化# 结果表明!在对原料进行胶体磨破碎"木瓜蛋白酶酶解和喷雾干燥的预
处理后!鸢乌贼卵粉中胆固醇的脱除率比未经过前处理直接冻干得到的鸢乌贼卵粉中胆固醇的脱除率
显著提高!亚临界L$,)2萃取脱除预处理后的鸢乌贼卵粉中胆固醇的最佳条件为%萃取压力 ZJ2!萃取
温度为 +#O!动态萃取时间 +#138# 在最佳条件下!预处理后的鸢乌贼卵粉中胆固醇的脱除率可达
&&G,$Q# 本文为亚临界 L$,)2脱除食品中胆固醇技术的产业化提供理论依据#
关键词!鸢乌贼卵$胆固醇$亚临界 L$,)2$正交试验$脱除
/EF$$#G$$A&H5>3@@8>$##*A%%$G"#$%G#>$$"&
!!鸢乌贼" 0/5+5"+#/5.1"#&&%.+%1.#是主要生长在太
平洋和印度洋中数量巨大的头足类生物!具有生命周
期短)生长速度快)繁殖力强的特点!是海洋中最具潜
力的生物资源之一!据估算其资源量约为 ,,, 万 ()##
万吨 $ B"( % 鸢乌贼是一种高蛋白低脂肪的优质水产
品!可深加工成鱿鱼干)鱿鱼丝等制品% 鸢乌贼加工后
的内脏中存在大量成熟的卵巢组织!这些鸢乌贼卵中
除了含有大量的蛋白质)钙)磷)铁)维生素和核黄素
外!还含有丰富的卵磷脂!是提取动物卵磷脂的优质原
料!但因含有大量的胆固醇!致使其利用受到限制% 目
前!食品中胆固醇的脱除方法主要有超临界流体萃取
法"ID0#)吸附法)溶剂抽提法)微胶囊包埋法以及酶
解法等 , BA( % 上述方法中大部分都存在着操作耗时
长)有溶剂残留)原料营养物质流失及脱除效果不理想
等缺点% 理论上!利用微生物产生的胆固醇氧化酶来
降低食品中的胆固醇是最简单的方法!但酶的来源)酶
反应体系的基础研究等因素限制着它的发展!其工业
化应用的道路还很漫长 &( %
超临界 KE" 萃取技术对环境友好!产品中无溶剂
残留!已在低胆固醇低脂肪蛋黄粉的生产上有良好的
应用 $# B$$( !但是由于超临界 KE" 萃取需要较高的压
力!其工业化设备投入巨大!生产经济性差!限制了其
在工业化生产中的进一步发展%
近几年新出现的亚临界流体萃取技术!可以在比
较低的压力下实现比较好的萃取效果!克服了超临界
KE" 萃取技术存在的一些缺点!因而得到了越来越多
的研究和重视 $" B$,( % 由于 $! $! $! " B四氟乙烷
"L$,)2#具有易于达到临界条件"U:k$#$G$O!J:k
)G#ZJ2#)低毒)惰性)不易燃以及不破坏臭氧层
"E/Jk##等特点!所以成为亚临界流体的首选 $)( !并
在国际上开始应用于相关成分的萃取 $% B$&( !但目前
国内鲜见有关研究的报道% 本试验在国内首次采用亚
临界 L$,)2萃取技术!研究脱除鸢乌贼卵中胆固醇的
工艺条件并进行优化!旨在为亚临界 L$,)2萃取技术
在食品中胆固醇脱除的工业化应用提供依据%
!"材料与方法
!#!"材料与仪器
冷冻鸢乌贼卵$浙江舟山渔业公司提供% L$,)2
"英国 i` 0.公司!纯度大于 &&G&Q#&胆固醇标准品
"德国!/?>06?X8@T7?[X?公司#&甲醇"色谱纯!天津四友
&"$$
核!农!学!报 "& 卷
精细化学品有限公司#&木瓜蛋白酶 "酶活 &# 万 f*
9B$!广州市华琪生物科技有限公司#%
亚临界 L$,)2萃取装置"自制!萃取釜容积为 %#
1` #&旋转蒸发器 "L0B%".型!上海亚荣生化仪器
厂#&高效液相色谱仪配器外检测器 "YJ4## 型!美国
.934X8T公司#&高速冷冻离心机 ".8NXR` B"#RB(
型!上海安亭 科 学 仪 器厂 #& 超声震荡器 "cEB
,"##/UI 型!南京先欧仪器厂#&冷冻干燥机" V`RB$"
型!北京松源华兴科技发展有限公司#&喷雾干燥机
"I/B$%## 型!上海沃迪自动化装备有限公司#&胶体
磨"VUZ%# 型!上海宇强实业公司#%
!#$"试验方法
$G"G$!鸢乌贼卵预处理方法!块状冷冻鸢乌贼卵在
室温下流水解冻!分别采用以下 ) 种方式进行预处理$
$#不经处理!直接进行冻干"样品 I$ #&"#按照原料与
水 $l,"\H\#的比例混合!用胶体磨匀浆 "#138 后!冻
干"样品 I"#&,#按照原料与水 $l,"\H\#的比例混合!
用胶体磨匀浆 "# 138 后!用木瓜蛋白酶进行酶解后
"底物浓度 %G#Q!酶用量 ###f*9B$!酶解温度为
%#O!酶解时间 "G%6#!冻干"样品 I, #% )#原料处理
同 ,#!进行喷雾干燥"进风口 $%#O!出风口 %#O#"样
品 I)#% 将得到的 ) 种鸢乌贼卵粉样品分别装入铝箔
袋内密封! B"#O下冷冻保存备用%
$G"G"!胆固醇检测方法 +"#,!
$G"G"G$!样品处理!准确称取 #G"###9的样品!完全
转移到平底烧瓶中!加入 $#1` %#Q的氢氧化钾溶液
和 ,#1` 无水乙醇!在 $##O条件下皂化 $6!冷却后转
移至分液漏斗中!加入 )#1` $l$"aHa#的石油醚和乙
醚的混合液!震荡 "138!分液后提取有机相!然后分 "
次加入 ,# 1` 上述石油醚和乙醚的混合液提取!合并
, 次有机相用蒸馏水洗至中性!蒸干后!用色谱甲醇溶
解并定容至 $#1` !经过 #G)%"1有机滤膜过滤后待上
机分析%
$G"G"G"!YJ`K色谱条件!色谱柱$K$A反相色谱柱
" I-*K$A )G C"%#11#&流动相$甲醇&测定波长$
"#%81&流速$ $G#1` *138 B$& 柱温$ 常温& 进样量$
$#"` %
$G"G"G,!标准回归方程!以胆固醇标准溶液浓度为
纵坐标!以峰面积作为横坐标!进行线性回归!得出回
归方程为 系良好%
$G"G"G)!胆固醇含量计算
Zk"K# C.Cm#H".# C1# "$#
式中$Z3样品中胆固醇含量!19*9B$&K#3标准溶液
的浓度!19*1` B$&.73标准溶液的峰面积相应值&
.3样品的峰面积相应值&m3定容体积!1` &13样品
质量!9%
$G"G,!胆固醇脱除率的计算!胆固醇的脱除率根据
下列公式计算$
Lk"R# CZ# BR$ CZ$#H
" R# CZ##( C$##Q ""#
式中$L3胆固醇脱除率!Q&R#3萃取前鸢乌贼卵粉
的重量!9&Z#3萃取前鸢乌贼卵粉中胆固醇的含量!
19*9B$&R$3萃取后鸢乌贼卵粉的重量!9&Z$3萃取
后鸢乌贼卵粉中胆固醇的含量!19*9B$%
$G"G)!亚临界 L$,)2萃取试验
$G"G)G$!单因素试验设计!根据文献"$(中操作流
程和方法进行亚临界 L$,)2的提取!将 %9预处理的鸢
乌贼卵粉放入萃取釜!以萃取压力)萃取温度)萃取时
间 , 个因素为变量!以静态萃取 "#138 后再进行动态
萃取进行单因素的试验!萃取完成后!对萃取完的鸢乌
贼卵粉称重!进行胆固醇含量检测!计算脱除率 L% 同
一条件进行 , 次平行试验!取平均值!使相对标准偏差
"LI/#小于 %Q%
$G"G)G"!正交试验设计!根据单因素试验结果!再对
各个因素进行正交试验优化% 以影响亚临界 L$,)2
脱除鸢乌贼卵胆固醇效果的最主要的 , 个关键因素$
萃取压力)萃取温度和动态萃取时间为正交试验法的
影响因素!设计了 &`",
,#正交试验"表 $#% 同一条件
进行 , 次平行试验!取平均值!使相对标准偏差"LI/#
小于 %Q%
表 !"正交试验因素和水平 XY "%
% #
L6),4!"/6I.-5:698,434,:-;-5.M-0-96,.4:.XY "%
%#
水平 X`aX4
因素 D2:T7?
.压力
J?X@@=?XHZJ2
-温度
UX1SX?2T=?XHO
K时间
U31XH138
$ ) %# %#
" # #
, A +# +#
$"结果与分析
$#!"原料预处理方式对胆固醇含量测定结果的影响
由表 " 可知!鸢乌贼卵不经处理直接冻干的样品
I$ 中测得的胆固醇含量最低!为 $,G#19*9
B$!说明鸢
乌贼卵未经破坏的生物组织结构和细胞结构包裹了部
#,$$
! 期 亚临界 L$,)2脱除鸢乌贼卵中胆固醇的工艺研究
分胆固醇!使其无法被提取出来% 而经过胶体磨对鸢
乌贼卵的生物组织结构和细胞结构进行机械破碎后!
样品 I" 中胆固醇的含量提高到了 $+G",19*9
B$!说明
机械破碎的方法可以使原本被包裹的那部分胆固醇释
放了出来% 在机械破碎的基础上!继续通过生物酶解
的方法得到的样品 I, 和 I) 中胆固醇的含量进一步提
高到了 "$G##19*9B$和 ""G+19*9B$!说明生物酶解的
方法可以使机械破碎后仍部分结合的胆固醇进一步游
离出来% 因此!在起始样品和胆固醇测定方法相同的
情况下!对起始样品进行不同的预处理后!造成了样品
中胆固醇含量测定结果的明显提高% 上述试验结果表
明!鸢乌贼卵经过机械破碎和生物酶解等预处理后!存
在其中的胆固醇基本上被完全释放了出来!使之更容
易被提取出来% 这非常有利于本研究后续试验中对胆
固醇的高效脱除!相应提高胆固醇的脱除率!因此后续
的试验中均以 I) 为试验材料%
表 $"不同预处理方法对样品胆固醇含量测定结果的影响
L6),4$"NM-,4:.45-,I-9.49.-;:6A+,4:)7
84;;4549.+54.546.A49. H"19*9B$ #
样品
I21S4X
I$ I" I, I)
胆固醇含量
K674X@TX?74:78TX8T
$,G# $+G", "$G## ""G+
$#$"单因素萃取试验结果
"G"G$!动态萃取时间对脱除率的影响!当溶剂萃取
溶质时!溶质与溶剂之间的充分渗透与接触非常重要%
有研究表明!在超临界 KE" 萃取过程中!若先进行 $#
("# 138 的静态萃取!再进行动态萃取!使溶剂与溶质
充分接触!可明显提高溶质的提取率 ""( % 本研究根据
之前的静态萃取初步研究结果!待压力达到 ZJ2"温
度设为 ,#O#后先静态萃取 "#138!然后进行动态萃
取!从而考察萃取时间对胆固醇脱除率的影响% 由图
$ 可知!随着动态萃取时间的延长!胆固醇的脱除率也
随之增大!但 )# (#138 的增长幅度明显小于 "# (
)#138 的增长幅度!当时间超过 #138!脱除率增长幅
度不再明显!这说明在特定试验条件下!胆固醇的脱除
率达到峰值!几乎已被全部提取!再延长时间对脱除率
没有贡献!而且萃取时间过长会增加生产成本!降低生
产效率!因此选择合适的萃取模式和萃取时间是一个
重要因素!后续试验均在静态 "#138 h动态萃取的模
式下进行%
"G"G"!萃取温度对脱除率的影响!选择萃取压力为
图 !"动态萃取时间对脱除率的影响
/*01!"LM4.*A44;;4I.:-97*4,8-;IM-,4:.45-,
54A-36,)7 8796A*IA-84,
ZJ2!萃取时间为静态 "#138 h动态 )#138 条件下!考
察了胆固醇脱除率随萃取温度的变化% 由图 " 可知!
随着温度的增加脱除率先明显增加!当温度超过 #O
后!胆固醇的脱除率就不再显著增加了% 这是因为溶
质的溶解性能取决于亚临界流体的密度和溶质蒸汽压
的平衡% 温度的升高会使亚临界流体密度的降低!导
致溶解能力降低!但是会增加溶质的蒸汽压!导致溶解
性能的增加 ",( !因此!本文中温度对胆固醇脱除率的
影响是两方面的!其一!当温度增加时溶剂传质速率和
溶质的分子运动也随之增加!因而胆固醇的溶解性增
加&另一方面!随着温度的升高!亚临界 L$,)2的密度
会降低!从而使其溶解胆固醇的能力降低% 在温度较
低区域!温度升高导致胆固醇溶解度的增加起主导作
用!因此表现为胆固醇脱除率随温度升高而增大&当温
度高于 #O时!亚临界流体的密度降低成为影响溶质
溶解性的主要因素!L$,)2溶解胆固醇能力会降低!胆
固醇的脱除率不再升高% 此外!过高的萃取温度会造
成能源的浪费和成本的增加以及原料中卵磷脂等有效
成分的不稳定!因此萃取温度不宜过高%
图 $"动态萃取模式下温度对脱除率的影响
/*01$"LM4.4A+456.G544;;4I.:-97*4,8-;
IM-,4:.45-,54A-36,)7 8796A*IA-84,
$,$$
核!农!学!报 "& 卷
"G"G,!动态萃取压力对脱除率的影响!图 , 显示在
萃取时间为静态 "#138 h动态 )#138!温度为 %#O条
件下!萃取压力对胆固醇脱除率的影响% 结果表明!在
" (ZJ2时脱除率随着压力的增大迅速增大!之所以
出现这样的情况是因为在亚临界区域范围内! L$,)2
的溶剂化参数 ,!随着压力的上升而直线上升!说明
在亚临界区附近 L$,)2的密度随着压力的升高而升
高 ")( !因此 L$,)2的溶解能力增加!脱除率随之增加%
当萃取压力在 A ($#ZJ2时脱除率随着压力的增大而
增幅很小!这是因为当压力高于临界压力过多时!
L$,)2流体的状态开始远离亚临界区域!影响了亚临
界流体的萃取能力!而且当压力增大时!L$,)2的粘度
也随之增大!不利于其对胆固醇的萃取% 所以!在高压
下!胆固醇的脱除率不再明显增加% 而操作压力高!设
备的造价也较高!不利于产业化!因此萃取压力条件的
选择要综合考虑%
表 <"方差分析
L6),4<"296,7:*:-;365*69I4
因素
D2:T7?@
偏差平方和
II
自由度
3(
E值
Ea24=X
E临界值
EK?3T3:24m24=X
:值
:a24=X
.压力 J?X@@=?X %$G"A# " #G"A+ $&G### p#G#%
-温度 UX1SX?2T=?X A$&G"&A " )G%+A $&G### p#G#%
K时间 U31X "$%G") " $G"#, $&G### p#G#%
误差 0??7? $+AG&+#
!!M7TX$ D#G#%""!"# k$&G###
图 %"动态萃取模式下压力对脱除率的影响
/*01%"LM4+54::G544;;4I.:-97*4,8-;
IM-,4:.45-,54A-36,)7 8796A*IA-84,
$#%"正交试验结果
正交试验指标以胆固醇的脱除率为评价指标!脱
除率越高!表明试验条件越佳!结果见表 ,%
!!由表 , 可知!萃取压力".#对胆固醇脱除率的影
响 为N" xN, xN$ !萃取温度"-#对脱除率的影响为
表 %"XY "%
% #正交试验结果
L6),4%"T4:G,.:-;XY "%
% # -5.M-0-96,4W+45*A49.:
序号
M=1]X?
.
萃取压力
J?X@@=?XH
ZJ2
-
萃取温度
UX1SX?2T=?XH
O
K
萃取时间
U31XH138
/
空白
-428N
脱除率
b3X4P 7[
:674X@TX?74
?X17a24HQ
$ $ $ $ $ %G%A
" $ " " " +,G$A
, $ , , , &$G,,
) " $ " , )G)"
% " " , $ &&G"
" , $ " A$G&"
+ , $ , " +#G,%
A , " $ , A$G%&
& , , " $ &,G##
N$ +>&# >+A+ +>,,
N" A$>A+ A)>++ +>A+
N, A$>)+ AA>+%# A>&A#
? %>$+# "$>&+ $#>$+
N, xN" xN$!萃取时间"K#对脱除率的影响为 N, xN"
xN$!由此得出的较优工艺条件为 ."-,K,!即萃取压
力 ZJ2)萃取温度为 +#O)萃取时间 +#138% 极差 ?
的结果表明!各因素对胆固醇脱除率的影响顺序为 -
xKx.!即亚临界 L$,)2脱除鸢乌贼卵粉中胆固醇的
各因素影响程度大小依次为萃取温度)萃取时间及萃
取压力% 由表 ) 可知!各因素对胆固醇脱除率的影响
顺序也是 -xKx.!同极差分析结果相同! .)-)K,
因素对胆固醇的脱除率均无显著性影响% 结合直观分
析和方差分析结果!考虑主要影响因素以及综合考虑
能耗)萃取速率)成本等因素!最终确定亚临界 L$,)2
脱除鸢乌贼卵粉中胆固醇的工艺条件为萃取压力
ZJ2)萃取温度为 +#O)萃取时间 +#138%
",$$
! 期 亚临界 L$,)2脱除鸢乌贼卵中胆固醇的工艺研究
$#<"验证试验结果
按照正交试验结果得出的较优工艺"."-,K, #分
别进行了 , 次验证试验!得到的胆固醇平均脱除率为
&&G,$Q!高于正交试验中的任何一组数据!验证了试
验结论的准确性% 本试验最终确定的工艺条件为
."-"K,!即萃取压力 ZJ2)萃取温度为 +# O)萃取时
间 +# 138%
%"讨论
已有的研究表明!在天然产物的提取工艺中!采用
物理或化学手段将生物组织结构破坏!使生物组织中
的有效成分释放速度及释放量大幅度提高!从而可以
获得较高的提取率!常用的方法有机械粉碎法)超声破
碎法)反复冻融法)酶溶法)化学渗透法等!不同的方法
适用于不同的生物组织和提取工艺% 例如季晓敏
等 "(对雨生红球藻粉进行超微粉碎后!采用超临界
KE" 提取虾青素!相同萃取条件下!未粉碎时雨生红球
藻的得率为 AQ!粉碎后得率为 $%Q% 王莉等 "+(研究
了产油酵母油脂提取工艺!结果显示!蜗牛酶法的细胞
破碎效果最好!油脂产率高达 )G"Q% 柳滢春 "A(采用
冻融一超声联合技术提取菊花中的黄色素!优选工艺
条件下菊花黄色素提取率为 AG%%Q!显著高于传统工
艺同条件下的提取率"%GA"Q#!萃取时间可以大大缩
短% 本试验先后采用了胶体磨和木瓜蛋白酶酶解对鸢
乌贼卵组织进行破碎和释放处理!使胆固醇的测定含
量从未经破碎处理的 $,G# 19*9B$提高到处理后的
"">+19*9B$!这说明存在鸢乌贼卵组织的胆固醇释
放量大幅度提高!非常有利于提高后续实验中胆固醇
的脱除率%
目前!食品胆固醇脱除方法中最有应用前景的是
$B环糊精包埋法和超临界 KE" 萃取法!$B环糊精包
埋法的优势在于胆固醇的脱除率高!如曹劲松等 "%(研
究的 $B环糊精包埋法脱除蛋黄中的胆固醇脱除率达
到 &)GQ% 苗君莅等 "&(研究的 $B环糊精脱除牛奶
中的胆固醇脱除率达到 &+Q!其主要缺点是会有 $B
环糊精残留在脱除胆固醇后的食品中!使其应用受到
一定限制 ,#( % 超临界 KE" 脱除胆固醇方法的优点在
于无残留!对脱除胆固醇后的食品原料无影响!缺点在
于萃取压力高!而相关文献报道的萃取压力均大于
,#ZJ2$# B$$!,$ B,,( !由此造成设备投资大!运行成本高%
虽然!目前国内外尚无从鸢乌贼卵中脱除胆固醇的报
道!但与上述 " 种方法相比!本试验方法具有提取率
高)成本低)无残留)产品品质好的技术优势!即克服了
$B环糊精包埋法有异物残留的缺点!也克服超临界
KE" 萃取法成本高的不足!可以用于食品中胆固醇的
脱除!具有良好的开发应用前景!有待于将此技术尽快
产业化%
<"结论
鸢乌贼卵经过机械破碎和生物酶解等预处理后!
鸢乌贼卵粉中胆固醇的含量由不经处理直接冻干样品
的 $,G# 19*9B$提高到 ""G+ 19*9B$!说明鸢乌贼卵
粉经过适当的预处理!可以使存在其中的胆固醇被更
完全的释放和游离出来!使之更容易被完全提取出来!
对提高胆固醇的脱除率有积极作用% 亚临界 L$,)2
萃取技术脱除预处理后的鸢乌贼卵粉中胆固醇的最佳
工艺条件为$萃取压力 ZJ2!萃取温度为 +#O!萃取
时间 +#138! 在该条件下! 胆固醇的脱除率可达
&&G,$Q%
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油中胆固醇的工艺研究V(>中国油脂! "#$,!,A"$$# $+ B$#
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优化中性氧化铝吸附剂降低牛油中胆固醇工艺V(>食品科学!
"#$"!,,"")# $$+# B$+,
& (!刘栾琼! 张"! 田凤伟>微生物降胆固醇作用研究进展V(>食
品与机械! "##,! "$# $ BA
$#(!张佳程! 卢明春! 宋建国! 张福琪! 包永明! 王世龙! 骆承痒>
IK*KE" 的萃取装填系数和时间对蛋黄粉中胆固醇脱除效果的
影响V(>食品工业科技! "##)! "%"+# $ %$ B%,
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D77P J?7:X@@38928P J?X@X?a2T378! "##,! "+")# $ ,%, B,%
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科技! "#$"! ,,"")# $ ,#) B,$#
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热带作物学报!"#$)!,%""# $)# B)$"
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业! "#$#! $,+")# $ "% B"
,,$$
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:2?7TX8X@[?71 S241 7341X@7:2?S =@389@=]*:?3T3:24L$,)2V(>
D77P K6X13@T?$(!Z=@T2S2.M! Z28282e.! Z76P .d3d3Kb>0[X:T@7[S2?21XTX?@
78 <3X4P [7?@=]*:?3T3:24L$,)2X^T?2:T378 7[S241734V(>V7=?8247[
D77P 08938XX?389! "##&! &%")# $ # B$
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