全 文 ：核 农 学 报!"## #(& ’#%&’"()#*’+&,−.*#’/#&’0*.+%*+1 收稿日期!"#()#(),!接受日期!"#()#*)∗基金项目!国家自然科学基金项目"(#+(/# !黑龙江省自然科学基金项目" "#$$((#
作者简介!刁志伟!男!主要从事作物生理学研究% 2)3456$ hA5@5)$(<$/(>?:3
通讯作者!马凤鸣!男!主要从事作物栽培生理研究% 2)3456$ EA;735;7r34
文章编号!###)&**""#)#(&)#& 甜菜硝酸还原酶和亚硝酸还原酶偶联调节的研究 刁志伟!于!雪!王玉波!李彩凤!盖志佳"!张翼飞(!马凤鸣"东北农业大学!黑龙江 哈尔滨!*##(#& "黑龙江省农业科学院佳木斯分院!黑龙江 佳木斯!*%###&
(黑龙江八一农垦大学农学院!黑龙江 大庆!/((,#
摘!要!以甜菜二倍体品种双丰八号为试材"研究不同的氮素形态及其配比对甜菜硝酸还原酶和亚硝酸
还原酶活性以及甜菜块根总氮含量和蔗糖含量的影响"探讨氮素与 XF及 X5F之间的偶联关系结果表明"在甜菜整个生育期间"XF 块
根总氮含量呈双峰曲线变化"与 XFZ%X5FZ具有显著或极显著正相关’蔗糖含量呈单峰曲线变化"与总
氮含量曲线大致互补关键词!甜菜′硝酸还原酶′亚硝酸还原酶′偶联RTU#&/,VW>5BB;>$##)&**$>"#$%>#$>#$(& !!氮素是作物生长的必需元素之一% 氮素同化的研 究直接关系到氮肥利用及植株碳氮代谢的平衡% 目前 已知!由 XT0( 还原成 X^ d % 这一代谢过程至少需要硝 酸还原酶 " X5JI4JAIAC8?J4BA!XF# 和亚硝酸还原酶 "X5JI5JAIAC8?J4BA!X5F# 参与完成% X5F与 XF基因的 表达都受到 XT0( 的调节 ’$( % L48IA’"(研究发现!在白 化烟叶片中的 XF和 X5F转录同时积累!当低水平的 XF活性恢复后!X5F的活性水平也恢复正常!这种表 达过程中的 XF与 X5F的相互作用称为 XF和 X5F的 偶联调节% 目前!氮的无机同化代谢研究偏重于 XF! 前人对其进行了大量细致的研究&与之相比!偶联 XF 完成 XT0( 的无机同化!在 XT 0 ( 还原成 X^ d % 的过程中 起到承前启后的作用的 X5F研究尚少 ’(( % 此外!对甜 菜无机氮代谢关键酶活性调控的研究中!大多数以单 一氮素或硝态氮与铵态氮两种氮素为底物!研究其对 XF和 X5F的调控!而 X5F的直接底物 XT0" 如何调控 甜菜无机氮代谢的研究极少% 甜菜块根中总氮含量的多少直接影响甜菜块根重 量及含糖率 ’%( !通过测定块根总氮及蔗糖含量!可以 反映块根的发育情况和糖分积累情况% 植物对氮素的 利用主要是以 XF和 X5F还原 XT0( 为起始的!XF和 X5F活性的变化必然影响块根总氮含量% 但是不同氮 素形态与比例下 XF和 X5F活性与块根中总氮及蔗糖 含量的研究较少% 本试验以纯系二倍体双丰八号为研究对象!通过 施用不同比例的硝态氮"XT0( 0X#)亚硝态氮"XT 0 " 0 X#)铵态氮"X^ d% 0X#!对甜菜 XF)X5F)块根总氮与 蔗糖的动态变化进行考察!分析不同氮素形态及比例 对于 XF)X5F的调控!拟从底物水平的调控中明确两 者之间的偶联关系以及与块根总氮与蔗糖的关系!进 一步完善甜菜氮素无机代谢过程!并为探究节能高效 的施肥方式提供理论依据% !"材料与方法 !#!"供试材料 供试甜菜为二倍体品种双丰八号!由哈尔滨工业 大学糖业研究所提供% !#$"试验设计 试验在东北农业大学校内进行!为盆栽试验 "盆 栽营养面积 #M$*3")深 #M%3#% 试验采用随机区组设 计!重复 ( 次!设计方法如表 $ 所示!XT0( 0X选用 P4 "XT(# " 为氮源!XT 0 " 0X选用 X4XT" 为氮源!X^ d % 0 X选 用 " X^ % # " QT%% 磷 肥 施 用 重 过 磷 酸 钙 P4 &($ !$ 期 甜菜硝酸还原酶和亚硝酸还原酶偶联调节的研究 " "^HT%# " ,#[7*[3 0"!钾肥施用 e"QT% /# [7*[3 0"% 表 !"试验设计与肥料用量 6789:!"NS>:?@A:E<=:;@DE7E=C:?<@9@T7<@BE7ABOE<; 序号 XT> XT( 0X XT( 0X V"7*J8K 0$ # XT" 0X XT" 0X V"7*J8K 0$ # X^ d% 0X X^ d% 0X V"7*J8K 0$ # $ # $M& $M& " (M/ $M& $M& ( $M& # $M& % $M& (M/ $M& * $M& $M& # / $M& $M& (M/ + $M& $M& $M& & #M, $M& $M& , "M+ $M& $M& $# $M& #M, $M& M& "M+M&
"M& M& #M,( M&M& "M+
图 !"不同处理水平下 :E.%/变化动态
*@DH!"-LE7A@KKI7ED:;BC:E.%/OE=:?=@CC:?:E<"#"年∗月 日播种!定苗后每盆 株!按大田栽培措施管理*C 取样 次!共计取样+次 天上午 &i## 0#i## 点浇 灌所需氮素营养液"氮素营养液的量依照总氮量的V
+ 进行配置#!对植株进行诱导!%& D 后取样% 在晴朗
天气的上午 ,i## 0#i## 进行取样!每处理随机取 ( 株!自内向外选取完全展开的功能叶数片!去叶脉剪碎 混匀称量测定酶活 ’*( % 块根烘干后测定块根全氮和 蔗糖含量% 运用 RHQ+M* 数据处理系统和 29?A6"##+ 对测定结果进行相关性分析% !#+"测定方法 XF酶活力测定参照于海彬等 ’/(的方法!分别测
定内源与外源基质条件下的甜菜叶片 XF活力
"A;XFZ和 A9XFZ#% XF活性用 XT0" !7V7Lq*35;
表示%
X5F酶活力 测 定综 合 P4I:65;A等 ’+( ) eI5BJ5;A 等 ’&( )2C84IC 等 ’,( )QD5W5’#(的方法!加以修改% X5F活
性用 XT0" 37*"7Lq*D#
0表示采用 LTQQ eWA6JA?"(## 全自动凯
氏定氮仪测定%
蔗糖含量测定参照李丹′(方法测定!略有改动"结果与分析
#!"甜菜叶片中 .%活性的动态变化 甜菜叶片硝酸还原酶活性 "XFZ#变化动态如图!图 " 所示!内源基质条件下硝酸还原酶活性
"A;XFZ# 和外源基质条件下的硝酸还原酶活性
"A9XFZ#变化动态相似!均呈双峰曲线变化!在 / 月
"" 日"苗期#达到最高峰!并于 & 月 "/ 日"块根膨大末
期#出现一个较低的峰值% 苗期是氮素的代谢旺盛
,(核!农!学!报 "& 卷 图"不同处理水平下 :S.%/变化动态
*@DH"−LE7A@KKI7ED:;BC:S.#".@" 日"块根增长末期#达到最低值!在 & 月 "/ 日
"块根增长末期#出现一个较苗初期低的峰值%
#+"甜菜块根总氮含量变化动态 甜菜块根总氮含量变化动态如图 % 所示!在整个 生育期中甜菜块根总氮含量呈双峰曲线变化!在 / 月 / 日"苗初期#达到最高峰!之后持续下降!在 + 月 "* 日"叶丛生长末期#达到最低值!之后上升!在 & 月 "/ 日"块根增长末期#达到第 " 个峰值后略有下降% 甜 菜在块根增长期之前!生长中心集中在地上部叶的生 长!块根虽有部分膨大!但是有机物质含量并未显著升 高!所以造成总氮含量持续下降&进入块根增长期后! 生长中心转移至地下部!使得总氮含量持续上升&, 月 份开始进入糖分积累期!块根中蔗糖含量逐渐提高!使 得总氮含量相对降低!但是也维持在一个较高的水平 上%#,"块根蔗糖含量变化动态
甜菜块根蔗糖含量变化动态如图 * 所示!在整个
生育期中甜菜块根蔗糖含量呈单峰曲线变化!在 / 月
/ 日"苗初期#最低!之后持续上升!除 & 月 "/ 日"块根
膨大末期#略有降低外!全生育期均保持上升趋势!直
到糖分积累期仍保持较高水平% 蔗糖的积累贯穿甜菜
生育期的全过程!在 & 月 "/ 日出现的波动可能是因为
块根的快速膨大!降低了单位质量的蔗糖含量!这与前
人研究结果基本一致 ’$$ 0$"( %
#%$
!$ 期 甜菜硝酸还原酶和亚硝酸还原酶偶联调节的研究
图 +"不同处理水平下 .@%/变化动态
*@DH+"-LE7A@KKI7ED:;BC.@%/OE=:?=@CC:?:E<图 ,"甜菜块根总氮含量的变化动态
*@DH,"-LE7A@KKI7ED:;BC
核!农!学!报 "& 卷
同一时期不同处理间的结果上来看!高的氮肥施
用量可以提高块根蔗糖含量!且对其影响的大小关系
依次为 X^ d% oXT
0
" oXT
0
( !根系对不同氮素形态的吸
收及利用所消耗能量的不同!进而影响根部蔗糖合成
酶的酶活性及相关物质代谢!造成了块根蔗糖含量的
差异!这与 Z3:@5B等 ’$((研究结果基本吻合%
图 0"甜菜块根蔗糖含量的变化动态
*@DH0"-LE7A@KKI7ED:;BC;OK?B;:KBE<:E
R4JA"3:;JD>C4=#
A;XFZ A9XFZ X5FZ
XT0( XT
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" X^
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% XT
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&M" #M,&/&"" 0#M,&(#"" 0#M,+&,"" #M,"#," 0#M,&(""" 0#M,/+*"" #M,((+ #M,((*" 0#M,**+" &M"/ #M,,&"" 0#M,/(""" 0#M,,%%"" #M,,,/"" 0#M,*+"" #M,*%#" 0#M,/",""
,M* #M,,+/"" 0#M,(%+" 0#M,&&+"" #M,&#+"" 0#M,&,"" 0#M,,#%"" #M,/&"" #M,/&+"" 0#M,/*&"" !!注"和""表示 *b 和 b水平差异显著" 4;C "" CA;:JAB57;5E5?4;JC5EAIA;?A4J#M#* 4;C #M#6AaA6B!IAB\A?J5aA6=>YDAB43A4BE:6:h5;7>#0"甜菜 .%/和 .@%/与各处理的相关性分析
将各处理氮素含量相加得到所施总氮水平!对总
氮水平与甜菜叶片中的两种酶活性进行相关分析发
现!各生育时期内 " 种酶活力与总氮水平间的相关性
均较低!可以认为该处理方式下!XF和 X5F酶活力的
差异并不是由于所施用的总氮水平造成的!而是来自
于不同的 XT0( )XT
0
" 和 X^
d
% 水平%
对 XT0( )XT
0
" 和 X^
d
% 不同处理水平与甜菜叶片
中的两种酶活性进行相关性分析!结果如表 " 所示%
在甜菜各生育时期内 XFZ"A;XFZ和 A9XFZ#与 XT0(
处理间表现正相关!除个别时期外!酶活性与 XT0( 水
平保持着显著或极显著相关关系&而 XFZ与 XT0" 和
X^ d% 处理间表现负相关!除个别时期外!酶活性与
XT0" 和 X^
d
% 水平保持着显著或极显著相关关系%
"%! 期 甜菜硝酸还原酶和亚硝酸还原酶偶联调节的研究
!! 表 +"酶活性与甜菜块根总氮含量的相关关系
6789:+"5B??:97<@BE7E79L;@;8:
2;@=3A
日期
R4JA
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A;XF #M,%,*"" #M",*% #M,/*"" #M((& #M+&(#"" #M,*/*"" 0#M#(+&
A9XF #M,&&""" #M(/, #M,%/""" #M("* #M+*%+"" #M,"%"" 0#M"&,
X5F #M*,, #M&+/("" #M((%( #M*#% #M(##, #M%++ #M#+(" X5FZ与 XT0( 和 XT 0 " 处理间表现正相关!酶活性与 XT0( 和 XT 0 " 水平保持着显著或极显著相关关系!而 X5FZ与 X^ d% 处理间均表现为显著或极显著负相关% 甜菜叶片硝酸还原酶和亚硝酸还原酶均为诱导 酶!根据酶反应机理!底物对酶有促进作用!生成物对 酶有抑制作用!但 XT0( 对 X5F的促进作用以及 X^ d % 对 XF的抑制作用均不能通过底物直接影响!可以认 为是通过偶联在一起的另一个酶的酶活力变化进行调 控的!反映出 XF和 X5F存在共促进)共抑制现象!验 证了 XF和 X5F存在内在的偶联关系%#1"甜菜块根总氮含量与 .%/".@%/相关性分析
甜菜块根总氮含量与 XFZ)X5FZ相关性分析见
表 ( 所示% 块根总氮含量和 XFZ在苗初期)叶丛生长
初期)块根膨大期表现为显著或极显著正相关!仅在苗
末期与 X5FZ表现为极显著正相关% 甜菜无机氮代谢
中!XF是限速酶!其活性的高低直接影响氮代谢速
度!进而影响块根总氮含量的高低&而 X5F的含量在
甜菜体内一直处于较高的水平!其酶活力不能决定氮
代谢速度!故对块根总氮含量的影响较小% + 月 "* 日
是甜菜氮素供应重点由地上部向地下部转移的时期!"
个酶与块根总氮含量均为不显著的正相关% , 月 ∗日!XF和X5F活力降低!与块根总氮含量不再具有明确的相关性%(的研究结果相符% 一方面低
的 XFZ使 XT0( 的还原速率受到严格的调控!而较高
的 X5F活性!可以迅速同化 XF的产物 XT0" !避免
XT0" 积累对植物产生毒害&另一方面又能供应适量的
亚硝酸盐!在 X5F催化下保证氨的供应!交由 GQV
GTGZY协同进行氨的有机同化!合成谷氨酰胺)谷氨
酸% 这表明甜菜 XT0( 源的无机同化代谢中 XF是限
速酶!X5F是控制酶!通过 XF与 X5F活性的变化!保
证了无机氮同化代谢的可控调节以及植物的健康生
长%
XFZ与 X5FZ均在苗期出现最高峰!苗期是形态
建成的重要时期!各种酶)细胞骨架等蛋白物质大量合
成!较高的 XFZ与 X5FZ可以提供足够的氨供应给氮
的有机代谢!合成氨基酸和形成蛋白质% 但是 XFZ的
最高峰较 X5FZ落后一个时期!且与杜永成等 ’∗()王玉波等′/(研究不相符!分析其原因一)本试验中所施 加的氮肥均为分次进行!较一次性施加的试验过程!苗 期氮素含量相对较低&二)幼苗时期光合作用比较弱! 不能提供足够的电子!这也可能抑制了 XFZ% 随着植 株的光合作用的提高!在苗后期!叶片功能逐渐完善! 可以提供大量的电子!使得 XFZ升高% 对比 & 月 "/ 日"块根增长末期#!XFZ与 X5FZ均出现一个相对较 高的峰值!比较该峰值与最高值的比例关系发现! X5FZ的峰值相对较高!符合上述推断% A9XFZ反映叶片对 XT0( 的最大酶活潜力!在 X5FZ的测定过程中!人为的提供了足够的还原剂和反 应底物!亦即叶片对 XT0" 的最大酶活潜力!因此将 A9XF与 X5F全生育期活性的动态变化进行比较!以阐 述 XF与 X5F的偶联关系% 从酶活性总体变化趋势上 来看! " 个酶表现基本一致!两者活性呈同增同减的 规律从甜菜幼苗末期"以氮代谢为中心#到块根增长
初期"& 月 " 日#"以碳代谢为中心#!XF与 X5F的活 性都呈逐渐下降!到甜菜块根增长初期"& 月" 日#!
XF和 X5F活性均达全生育期最低&块根增长末期"&
月 "/ 日#开始!当低水平的 XF活性逐渐升高后!X5F
的活性水平也由最低点逐渐升高% XF与 X5F" 个酶
在全生育期变化动态上表现为同增同减!且既有供促
进!又有共抑制的相互作用!都表明他们两者之间的偶
联关系!即两者偶联协同完成无机氮代谢的调节作用%
在全生育期的变化动态来看!甜菜块根中总氮含
量和蔗糖含量维持在一个大致互补的关系!与遇琦
等 ’%( !韩艳芬 ’+(研究相符
核!农!学!报 "& 卷
可以人为的控制块根总氮和蔗糖含量!以期保证甜菜
产质量% 因氮肥的施用水平及时间影响甜菜的产质
量 ’&( !本试验中!综合考虑 XF与 X5F活性及块根总 氮)蔗糖含量变化规律!在苗期至块根增长初期!氮素 的施用可以促进地上部分的生长!提高甜菜光合效率 及相关酶活力!保证甜菜的正常生长!为糖分积累打下 基础!该阶段应以硝态氮肥施用为主&进入块根增长期 后!XF和 X5F活性应保持低水平!同时因施用一定量 的氮肥可以提高块根含糖量!应当适当施用铵态氮肥! 具体的施用量应进一步试验确定% 通过调整施氮量) 施氮比例以及施氮时间!可以对碳氮代谢进行人为的 调控!以提高甜菜的产质量!这在生产中具有重要意 义% ,"结论 甜菜叶片 XFZ)X5FZ和块根中总氮含量均呈双 峰趋势!块根中蔗糖含量呈单峰趋势!在本试验条件 下! XF和 X5F在酶活力角度表现出明显的同增同减) 既有共促进又有共抑制的偶联现象&块根总氮含量与 XFZ关系密切&氮肥的施用可以提高块根蔗糖含量! 其中铵态氮更有利于蔗糖含量的积累% 参考文献! ’ (!14?[ 2!R8;;Aq! Q?D;A5CAIK Z>UB:64J5:; :EJDAB\5;4?D ;5JI4JA
IAC8?J4BA7A;A\I:3:JAIhD5?D ?:;EAIB;5JI4JA5;C8?5K565J=:; 78B
7A;AA9\IABB5:; 5; II4;B7A;5?J:K4??:’p(>H64;JS:6A?864I15:6:7=!
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’ " (!L48IApR>P:)IA7864JAC A9\IABB5:; :E;5JI4JA4;C ;5JI5JAIAC8?J4BA
’p(>H64;J! ,,!"# #+ 0’ ( (!石晓艳!曾彦达!李世龙!王玉波!马凤鸣!刁志伟>甜菜亚硝酸还 原酶" X5F# 基因的克隆与表达分析 ’p(>作物学报!"#!(+ "&#%,&(!/"(#"0"/′∗(!马凤鸣!高继国>硝酸还原酶活力作为甜菜氮素营养诊断及预测产糖量指标的研究′p(>中国农业科学!,,/!","*# / 0""
’ / (!于海彬!蔡葆!孙国琴>甜菜硝酸还原酶活性研究’p(>中国甜菜!
,,(!"(# & 0"( ’ + (!P4I:65;AG! 1:hBDAI! S5?D4A6p>23AB! F>P4334?[! RAIA?[ H> 8^A[6ABK=>H8I5E5?4J5:; 4;C \I:\AIJ5AB:E;5JI5JAIAC8?J4BAEI:3I::JB :E\A4"7.1#81&/.?#8?a>SAJA:I# ’p(>H64;J4!,&&!+* " ( #
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’#(!QD5W5>URZ! H8I5E5?4J5:; J:^ :3:7A;A5J=:EQ\5;4?D X5JI5JAFAC8?J4BA K=LAIIAC:95;)QA\D4I:BAZE5;5J=PDI:34J:7I4\D=YDAp:8I;46:E 15:?DA35BJI=!,++!&""(#(,* 0,& ’(!李丹>甜菜蔗糖代谢相关酶活性与糖积累关系的研究′R(>哈尔滨东北农业大学!"##,
’"(!李彩凤!马凤呜!赵越>氮素形态对甜菜氮糖代谢关键酶活性及 相关产物的影响’p(>作物学报!"##(!","# $$"& 0$("
’$((!Z3:@5BHZ>HD:B\D:A;:6\=I8a4JA?4IK:9=J4BA4?J5a5J=5; \64;JB
7I:h; h5JD A5JDAIXT0( :IX^
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’$%(!李文华>氮素水平和形态对甜菜" K+/& ?#’-&$.1N>#形态建成和
氮素同化的影响’R(>哈尔滨$东北农业大学>"##"
’$*(!杜永成!王玉波!范文婷!盖志佳!于敦爽!谷维!张俐俐!马凤鸣>
不同氮素水平对甜菜硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性的影响
’p(>植物营养与肥料学报!"#$"! $&"(# $ +$+ 0+"(
’$/(!王玉波!李彩凤!马凤鸣!杜永成!刁志伟!谷维>氮磷钾对甜菜硝
酸还原酶与亚硝酸还原酶的影响 ’p(>核农学报!"#$"!"/ "*# $
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’$+(!韩艳芬>甜菜块根中营养成分与根重和含糖率关系的初步研究
’R(>呼和浩特$内蒙古农业大学!"##+
’$&(!王光霞!张少英!邵世勤>氮素形态对甜菜代谢酶活性和生长发
育的影响’p(>中国甜菜糖业!"##%!"$# $ (* 0(+
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