全 文 ：核 农 学 报!"#$%!"&"$## $$’A& )$&#.
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收稿日期!"#$(*$"*($!接受日期!"#$%*#"*"&
基金项目!浙江省重大科技专项""#$"I$"A#A# !浙江省花卉产业创新团队项目""##AW##(%#
作者简介! 佘琳芳!女!主要从事球根花卉生理生化及繁殖研究% /*0123$PPU9325f15L4$H(8;J0
通讯作者!夏宜平!男!教授!主要从事园林植物生理调控与景观应用% /*0123$MY=214l6789:78;5
文章编号!$###*&..$""#$%#$#*$’A&*#&
两种石蒜属植物花器官愈伤组织诱导
及其亚显微结构观察
佘琳芳!陈菁珏!常!乐!任梓铭!夏宜平
"浙江大学农业与生物技术学院园艺系! 杭州!($##.&#
摘!要!为了探讨不同外植体!不同激素配比对石蒜属植物愈伤诱导的影响!本文以换锦花和忽地笑的花
器官为外植体!在不同激素浓度配比的培养基上诱导愈伤组织!并观察了愈伤组织亚显微结构’ 试验结
果表明!两个种的 . 种外植体均能诱导出愈伤组织!其中忽地笑子房的愈伤组织诱导率最高!达
&&Q"R&换锦花 . 种外植体均在 $0L%B@$ +,K$0L%B@$ "!% @-培养基上诱导出愈伤组织!且在此培养
基上获得最高的愈伤组织诱导率 H%Q’R&培养过程中出现 ( 种形态的愈伤组织!根据色泽$质地$亚显
微结构分析!认为浅黄色颗粒状愈伤组织为胚性愈伤组织!这为进一步开展石蒜属植物的高效再生体系
和转基因育种等研究提供了技术支持和理论依据’
关键词!忽地笑&换锦花&花器官&愈伤组织&亚显微结构
-SC$$#Q$$&HAT682PP58$##*&..$Q"#$%Q$#8$’A&
!!换锦花" A5*"$.114$+%-+$.#和忽地笑" A?&#$+&#均
为石蒜属"A5*"$.1#多年生球根花卉% 换锦花为我国所
特有的一种石蒜属植物!原产我国华东和台湾地区!其
花型优美!花色淡雅!观赏性强 &$’ % 忽地笑主要产自
我国西南(华南和台湾!早在 "# 世纪 &# 年代初!台湾
就有切花生产!贵州地区也有一定规模的药用栽
培 &"’ % 石蒜属植物通常采用自然分球或者人工切割
分球的方法繁殖 &( @.’ !但分生速度慢(繁殖率低!组培
高效再生体系迄今仍未成熟!成为影响石蒜属植物资
源保存(育种(种球扩繁和产业化应用的瓶颈难题%
植物愈伤组织是研究遗传变异与育种的良好实验
材料!也是建立悬浮细胞系的前提 &H’ % 胚性愈伤组织
生长快速(均匀(数量大!可以提高植物繁殖系数!也是
建立高效再生体系和遗传转化体系的有效途径% 许多
学者对石蒜属植物的愈伤诱导进行了探索!证明鳞茎
块 &’’ (双鳞片 &&’ (种子胚 &A @$$’均可诱导出愈伤组织!但
取鳞茎为外植体!需以损耗母球为代价!对于种质资源
渐缺的石蒜而言!此方法风险较大% "##’ 年!台湾大
学学者报道利用石蒜的花器官诱导出愈伤组织 &$"’ !但
未进行胚性愈伤组织鉴定!且由于石蒜愈伤组织增殖
率低!培养过程中极易分化出不定根!分化成苗率低%
近年来利用石蒜属植物花器官诱导愈伤组织虽有少量
研究 &$"’ !但对于愈伤组织的分类(亚显微结构观察及
胚性鉴定仍未见报道%
本研究以两种石蒜属植物的花器官为外植体!探
讨影响愈伤组织诱导率的因素!并通过扫描电镜及透
射电镜!观察不同形态愈伤组织的表面构造及内部结
构!进行愈伤组织类型的初步判定!旨在为石蒜属植物
的胚性与非胚性愈伤组织提供快速区分(判断方法!并
为进一步建立石蒜属植物的高效再生体系和遗传转化
体系提供细胞学试验依据%
!"材料与方法
!#! 试验材料
石蒜属植物种植于浙江大学紫金港校区球宿根花
卉资源圃!于 "#$( 年 A 月花期取忽地笑和换锦花被膜
片包被的幼嫩花序为材料%
!#$"试验方法
$Q"Q$!愈伤组织诱导!将采摘下的忽地笑和换锦花
&A’$
!$# 期 两种石蒜属植物花器官愈伤组织诱导及其亚显微结构观察
幼嫩花序置于 %^冰箱存放% 接种前一天取出!将整
个花序清洗后!置于加入少量洗洁精及吐温 "# 的水中
浸泡 $.025!之后清水冲洗 " )(U!置于超净工作台上%
’.R酒精浸泡 (#P!#Q$R升汞浸泡 A )$$025!无菌水
清洗 . 次% 切除总花梗!获得单朵小花% 将切成 ( )
.00小段的小花花梗(完整子房(花被(花丝(雌蕊分
别接种% 试验采用 Z? 培养基(琼脂 #Q&R(蔗糖 (#L)
B@$(Y]值 .QH ).Q& 作为基本培养基!分别添加不同
浓度 $ )" 0L)B@$ +,和 $ )" 0L)B@$ "!% @-!组成 &
个不同激素配比的培养基处理"表 $#% 置于温度"".
h"#^!暗环境下培养!按时观察并及时取出污染的
外植体!& 周后统计剩余外植体数量(诱导出愈伤组织
的外植体数量和愈伤组织的类型!并计算诱导率%
愈伤组织诱导率 _"产生愈伤组织的外植体数T
剩余外植体数# ‘$##R%
不同类型愈伤组织诱导率 _"产生该类型愈伤组
织的外植体数T剩余外植体总数# ‘$##R%
表 !"石蒜属植物花器官愈伤诱导培养基
%&’()!"@&(-/31;-8315 :);3-:0,+0(,+&(,+5&1/,0<-’,3%*
处理
FX91[095[P
苄氨酸腺嘌呤
+,T"0L)B@$ #
"!%*二氯苯氧乙酸
"!% @-T"0L)B@$ #
$ $8# #8.
" $8# $8#
( $8# $8.
% $8# "8#
. "8# #8.
H "8# $8#
’ "8# $8.
& "8# "8#
$Q"Q"!愈伤组织电镜观察!选取 ( 种不同形态的愈
伤组织!用 "Q.R戊二醛于 %^冰箱中固定过夜!用
#Q$Z!Y]值 ’Q# 磷酸缓冲液漂洗!酒精梯度脱水!乙
酸异戊酯过渡!IS" 临界点干燥!镀膜!在荷兰 VU232YP
公司的 iB(# 型环境扫描电镜" ?/Z#中观察% 选取 (
种不同形态的愈伤组织!用 "Q.R戊二醛于 %^冰箱中
固定过夜!用 #Q$Z!Y]值 ’Q# 磷酸缓冲液漂洗!酒精
梯度脱水!丙醇处理!包埋!切片!在日本 >/SB公司的
>/Z@$"(# 型透射电镜"F/Z#中观察%
$"结果与分析
$#!"愈伤组织诱导
从种间差异来看!换锦花与忽地笑差异明显!换锦
花的花被(花丝和雌蕊的平均愈伤组织诱导率分别为$
"$Q&R($’Q"R和 &Q#R!分别高于忽地笑相应外植体
的平均愈伤组织诱导率$AQ(R("QHR和 $QHR% 而换
锦花花梗和子房的平均愈伤组织诱导率 "HQ&R和
’Q%R均低于忽地笑相应外植体的平均愈伤组织诱导
率 %%Q%R和 %.Q&R%
从不同器官来看!两种石蒜属植物的花器官培养
& 周后!外植体均诱导出了愈伤组织!但不同的外植体
愈伤组织诱导率差异巨大% 忽地笑的子房和花梗平均
愈伤组织诱导率分别为 %.Q&R和 %%Q%R!而花丝和雌
蕊的平均愈伤组织诱导率仅为 "QHR和 $QHR%
从激素配比来看!换锦花愈伤诱导效果最好的为
+,$0L)B@$ K"!% @-$0L)B@$的 " 号培养基!. 种外
植体均诱导出愈伤组织!其中 " 种外植体的诱导率不
小于 (#Q#R!且最高诱导率也出现在此激素配比的培
育基上% 忽地笑愈伤诱导效果最好的为 +,"0L)B@$
K"!% @-"0L)B@$的 & 号培养基!% 种外植体诱导出
愈伤组织! 其中 " 种外植体的愈伤诱导率大于
(#Q#R%
$#$"愈伤组织的不同形态
两种石蒜属植物花器官愈伤诱导过程中!共出现
( 种形态的愈伤组织!根据颜色(质地和形态结构可以
分为$颗粒状愈伤组织"图 $ @,#!浅黄色!颗粒状明
显!质地致密*丝状愈伤组织"图 $ @+#!白色丝状!结
构疏松不稳定!久之死亡*水渍状愈伤组织"图 $ @I#!
深黄色!质地较软!水渍化严重%
花器官接种培养 & 周后!外植体均诱导出了愈伤
组织!但不同外植体的变化(愈伤组织出现的时间(位
置及诱导出愈伤组织的形态类型不尽相同% 培养 " 周
后花被片膨大(扭曲!培养 H 周后在花被基部及切口处
出现愈伤组织!且 &#R以上为浅黄色颗粒状!也出现
部分丝状和水渍状愈伤组织*培养 " 周后花梗和子房
伸长膨大!培养 ( 周后在两端切口处开始出现愈伤组
织!&.R以上的愈伤组织为丝状!极少数花梗上出现了
颗粒状或水渍状愈伤组织*培养过程中花丝稍卷曲!培
养 % 周后基部开始出现水渍状和颗粒状愈伤组织!其
中 .#R以上为水渍状*培养 " 周后雌蕊强烈卷曲!培
养 ’ 周后少量雌蕊基部出现愈伤组织!且全部为水渍
状"表 (#%
$#F"不同形态愈伤组织表面结构观察
( 种形态愈伤组织表面结构观察发现!颗粒状愈
伤组织表面平整!由多细胞团组成!组成细胞团的细胞
较小(形状规则(排列紧密!细胞团之间有一定空隙
"图 " @,#*丝状愈伤组织表面细胞巨大(形状不规
AA’$
核!农!学!报 "& 卷
!!!! 表 $"两种石蒜属植物花器官愈伤组织诱导率
%&’()$"@&(-/31;-823,1+&2)0,+0(,+&(,+5&1/,0<@*+3#$6#3%&1;<@")3#"
处理
FX91[095[P
换锦花 A?14$+%-+$. 忽地笑 A?&#$+&
花被
V9X215[U
花丝
D231095[P
花梗
V95:75;39P
子房
S\1X29P
雌蕊
V2P[23P
花被
V9X215[U
花丝
D231095[P
花梗
V95:75;39P
子房
S\1X29P
雌蕊
V2P[23P
# $ # $ # $ # $ # $ # $ # $ # $ # $ # $
$ .% "A8(R %& (.8(R HH %.8#R %" #! $# $$8$R .% #! HH $(8HR A$ .A8HR (H H(8HR !A #!
" .% (#8#R %& ’8’R HA H%8’R (H $%8(R $# $H8’R .% (8HR (H # ’" "H8’R (H # $# $"8.R
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H A# $H8’R .. # ’" H(8.R (" "#8#R $. # ’" # (H # ’" .#8#R (H %"8AR $# #
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& ’" $$8%R &% %(8&R %& # %. # ’ # ’" A8$R ’" ’8.R H# H#8’R %. ’$8%R & #
!!注$ C!CC分别代表外植体接种数!愈伤组织诱导率%
EJ[9$ C! CC25 [U9[1<39P[15: fJX[U9570<9XJf25J;731[9: 9=Y315[P! 15: ;137P25:7;[2J5 X1[98
表 F"三种形态愈伤组织的诱导率
%&’()F"J1;-823,1+&2),029+))2N.)/@&(-/
分类
I31PP2f2;1[2J5
外植体
/=Y315[P
颗粒状愈伤组织
GX15731X;137P
丝状愈伤组织
D231095[J7P;137PTR
水渍状愈伤组织
d1[9XM;137PTR
换锦花 花被 V9X215[U "#8$ $8. (8.
A?14$+%-+$. 花丝 D231095[P $$8’ # $"8(
花梗 V95:75;39P $8A %A8$ .8H
子房 S\1X29P # A8A #
雌蕊 V2P[23P # # $#8"
忽地笑 花被 V9X215[U A8. # #
A?&#$+& 花丝 D231095[P $8" # "8%
花梗 V95:75;39P # %.8% #8%
子房 S\1X29P # H"8( (8(
雌蕊 V2P[23P # # $8&
则!多为泡状长条形!弯曲成不同形状!排列疏松"图 "
@+#*水渍状愈伤组织!表面呈褶皱状!附着物较多!
细胞多破损!部分呈蜂窝状"图 " @I#%
$#K"不同形态愈伤组织细胞内部结构观察
( 种形态愈伤组织细胞内部结构观察发现!颗粒
状愈伤组织细胞结构完整!细胞核(核仁清晰可见!细
胞质内细胞器含量丰富!有线粒体(淀粉粒(核糖体(质
体及大量散布的小液泡"图 ( @,#*丝状愈伤组织细
胞形状不规则!细胞结构不完整!仅有细胞壁及其周围
散布的少量核糖体!无细胞核(液泡等重要细胞器"图
( @+#*水渍状愈伤组织细胞内细胞核(中央大液泡解
体!但是细胞器含量仍然比较丰富!也可以观察到部分
细胞具有完整结构"图 ( @I#%
F"讨论
F#!"两种石蒜属植物花器官愈伤组织诱导
两种石蒜属植物花器官组织培养 & 周后!外植体
均诱导出了愈伤组织!但不同种(不同器官(不同激素
配比!外植体的愈伤组织诱导率不同!诱导出的愈伤组
织类型也不同% 从种间差异来看!换锦花与忽地笑差
异明显!换锦花的花被(花丝和雌蕊的平均愈伤组织诱
导率高于忽地笑!而花梗和子房的平均愈伤组织诱导
率低于忽地笑% 其中换锦花的花被在 ’ 种培养基上均
##&$
!$# 期 两种石蒜属植物花器官愈伤组织诱导及其亚显微结构观察
注$,$颗粒状愈伤组织*+$丝状愈伤组织*I$水渍状愈伤组织%
$$换锦花*"$忽地笑%
EJ[9$ ,$ GX15731X;137P* +$ D231095[J7P;137P* I$ d1[9XM;137P8
$$A?14$+%-+$."$ A?&#$+&8
图 !"石蒜属植物花器官诱导出的 F 种形态愈伤组织
4356!"%9+))2N.)/,08&(-/0+,:<-’,3%*0(,+&(,+5&1/
诱导出了愈伤组织!且在 % 种培养基上的诱导率为
"AQ(R )((Q(R!均高于忽地笑花被的最高愈伤诱导
率 "&QHR*而忽地笑的子房在 H 种培养基上的愈伤组
织诱导率均大于换锦花子房的最高诱导率 ".Q#R!这
可能与种间的基因型差异有关 &$" @$%’ !陈泓伟 &$"’曾以
红花石蒜和杂交后代的花被作外植体诱导愈伤组织!
愈伤诱导率分别为 "HQ(R和 AQ.R%
从不同器官来看!忽地笑子房的平均愈伤组织诱
导率为 %.Q&R!雌蕊的平均愈伤组织诱导率为 $QHR!
不同的外植体愈伤组织诱导率相差巨大!这与前人研
究结果相似!刘合霞等 &A’曾以红花石蒜的种胚(组培
苗鳞茎和叶片为外植体诱导愈伤组织!平均诱导率分
别为 ’(Q$.R("(Q#.R和 %QH.R%
从激 素 配 比 来 看! 换 锦 花 . 种 外 植 体 均 在
$0L)B@$ +,K$0L)B@$ "!% @-培养基上诱导出愈伤
组织!且花梗在此培养基上获得最高愈伤组织诱导率
$#&$
核!农!学!报 "& 卷
注$,$颗粒状愈伤组织*+$丝状愈伤组织*I$水渍状愈伤组织%
$$换锦花*"$忽地笑%
,$(,"(+$(+"""## ‘# *I$(I""%## ‘#
EJ[9$ ,$ GX15731X;137P* +$ D231095[J7P;137P* I$ d1[9XM;137P8
$$ A?14$+%-+$."$ A?&#$+&?
,$!,"!8$!8"""## ‘# *<$!<""%## ‘#
图 $"不同类型愈伤组织表面结构观察
4356$"7-+0&8)/2+-82-+)/,029+))2N.)/,08&(-/’N 7MD
H%Q’R!这与红花石蒜鳞茎诱导愈伤组织的最佳激素
配比相同 &’’ *忽地笑的 % 种外植体在 "0L)B@$ +,K
"0L)B@$ "!% @-培养基上诱导出愈伤组织%
从外植体诱导出的愈伤组织类型来看!花被诱导
出的愈伤组织大部分是浅黄色颗粒状!花梗和子房诱
导出的愈伤组织大部分为丝状!花丝诱导出的愈伤组
织 .#R以上为水渍状*雌蕊诱导出的愈伤组织全部为
水渍状% 赵志敏等 &&’曾以黄花石蒜的叶(花丝(花药
和花葶等不同部位为外植体进行离体诱导!但均未见
有任何启动分裂的迹象!而在本实验中忽地笑的花丝
和花梗均获得了愈伤组织%
F#$"愈伤组织亚显微结构观察
对 ( 种形态愈伤组织进行扫描(透射电镜观察分
析得出$颗粒状愈伤组织表面平整!由多细胞团组成!
细胞较小(形状规则(排列紧密!细胞完整!细胞核(核
仁清晰可见!细胞质内细胞器含量丰富!且分布多个小
"#&$
!$# 期 两种石蒜属植物花器官愈伤组织诱导及其亚显微结构观察
注$,$颗粒状愈伤组织* +$丝状愈伤组织* I$水渍状愈伤组织%
$$换锦花* "$忽地笑%
;$细胞质* 0$线粒体* 5$细胞核* 57$核仁* Y$质体* \$液泡* e$细胞壁* 1$淀粉粒%
,$(,"(I$(I"".### ‘# *+$(+""$.## ‘# %
EJ[9$ ,$ GX15731X;137P* +$ D231095[J7P;137P* I$ d1[9XM;137P8
$$ A?14$+%-+$.* "$ A?&#$+&?
*$*5/"4’&16* 6$6./"*;"%=$.&* %$%#*’+.* %#$ %#*’+"’#1* 4$4’&1/.=* >$>&*#"’+* P$*+’P&’* &$&65’"4’&1/?
,$!,"!<$!<"".### ‘# * 8$!8""$.## ‘#?
图 F"F 种不同类型愈伤组织内部结构观察
4356F"J12)+1&(/2+-82-+),029+))2N.)/,08&(-/’N %MD
液泡!说明细胞内有着旺盛的新陈代谢!此类愈伤组织
具有较强的分生能力!这些特征与前人对观赏凤梨(菠
萝(甘薯和杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的研究结果一
致 &$. @$&’ *丝状愈伤组织细胞巨大!形状不规则!多为泡
状长条形!排列疏松!细胞结构不完整!无细胞核!仅有
细胞壁及其周围散布的少量核糖体!说明此类细胞基
本不具备生长能力!会逐步解体死亡!这与甘薯(亚麻
的非胚性愈伤组织形态结构相似 &$H! $A’ *水渍状愈伤组
织表面成褶皱状!附着物较多!细胞内细胞核(中央大
液泡解体!但是细胞器含量仍然比较丰富!也可以观察
到部分细胞具有完整结构!说明此类细胞具有一定的
分生能力!推测此类愈伤组织是由于培养条件不合适!
导致大部分细胞处于缓慢解体状态!在合适的条件下!
具备转化成胚性愈伤组织的能力% 齐力旺等 &"#’认为
虽然非胚性愈伤组织在生理生化和发育上与胚性愈伤
有明显差异!但在一定条件下相互之间可以转变% 何
业华等 &"$’也认为!非胚性愈伤组织能向胚性愈伤组织
细胞转化或进入器官再生途径%
(#&$
核!农!学!报 "& 卷
由此认为!颗粒状愈伤组织应为两种石蒜属植物
的胚性愈伤组织!丝状(水渍状愈伤组织均为非胚性愈
伤组织!但水渍状愈伤组织可以在合适的条件下转化
成胚性愈伤组织%
K"结论
本研究利用两种石蒜属植物换锦花与忽地笑的花
器官诱导愈伤组织!不同的外植体诱导出了不同形态
的愈伤组织!其中花被诱导出的主要是颗粒状愈伤组
织!花梗(子房诱导出的主要是丝状愈伤组织!花丝和
雌蕊诱导出的愈伤组织以水渍状为主*其中忽地笑子
房的愈伤组织诱导率最高% 对不同形态愈伤组织进行
亚显微结构观察!认为颗粒状愈伤组织应为胚性愈伤
组织!而丝状(水渍状愈伤组织为非胚性愈伤组织!但
水渍状愈伤组织在合适的条件下可以转化为胚性愈伤
组织!且两种石蒜属植物的花被是诱导胚性愈伤组织
的最佳外植体% 本研究为石蒜属植物高效再生体系和
遗传转化体系的建立提供了技术支持和理论依据% 在
后续研究中!将继续观察不同形态愈伤组织的分化成
苗率!并开展非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化等
相关试验%
参考文献!
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浙江农林大学! "#$$
&$$’!戴萍!张春霞!张智!邓波!周坚8中国石蒜的组织培养和快速繁
殖&>’8北方园艺! "#$"!"""# $ A. @A&
&$"’!陈泓伟8石蒜双核型杂种幼花序培养再生作用及小植株建立
&-’8台北$台湾大学!"##’
&$(’!魏晓东!李霞!周丽慧!姚姝8糯性和半糯性水稻品种成熟胚组
织培养力的比较&>’8核农学报!"#$"! "H"$# $H @$#
&$%’!袁雪!钟雄辉!李晓昕!辛海波!连青龙!义鸣放8铁炮百合的胚
性愈伤组织诱导和植株再生&>’8核农学报!"#$"!"H"(# $%.% @
%H#
&$.’!何业华!方少秋!马均!卢敏!彭兵8菠萝愈伤组织中体细胞胚起
源过程的组织细胞学观察&>’8园艺学报! "#$#! (’".# $ H&A @
HAH
&$H’!崔红!王伟!陈亮!沈明山!陈睦传8甘薯不同类型愈伤组织的比
较&>’8厦门大学学报$自然科学版! "###!(A"$# $ $$H @$"$
&$’’!张国芳!陆广欣!陈丽闽!毛碧增8观赏凤梨胚性愈伤组织的诱
导(高频再生及超微结构研究 &>’8核农学报! "#$$!". " H # $
$$.’ @$$H(
&$&’!陈金慧!施季森!甘习华!诸葛强!黄敏仁8杂交鹅掌楸体细胞胚
胎发生的扫描电镜观察&>’8南京林业大学学报$自然科学版!
"##.!"A"$# $ ’. @’&
&$A’!王克臣!冷超!黄文功!李明8黑亚 $% 号不同类型愈伤组织结构
的透射电镜观察 &>’8安徽农业科学! "##A!(’ "(" # $ $.’&’ @
$.’&&
&"#’!齐力旺!李玲!韩一凡!韩素英8落叶松不同类型胚性和非胚性
愈伤组织的生理生化差异&>’8林业科学! "##$!(’"(# $ "# @"A
&"$’!何业华!罗吉!胡中沂!王瑞霞!高爱平!方少秋!赵春香!杨向晖!
叶自行!王泽槐8菠萝非胚性愈伤组织的类型及其器官发生
&>’8果树学报! "##&!"."$# $ H. @H&
%#&$
!"#$%&’"()#*’+&$,-$.*#’/#$&’0*.+%*+1
"#$%!"&"$## $$’A& )$&#.
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