全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员缘袁圆怨渊猿冤院园源缘源 耀 园源远员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员源鄄园猿鄄员源摇 接受日期院圆园员源鄄园苑鄄园员
基金项目院国家自然科学基金渊猿员员苑员怨源源袁猿园苑苑员源愿猿冤
作者简介院程敏袁女袁主要从事分子细胞生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 怨园愿怨怨员员猿园岳 择择援 糟燥皂
通讯作者院蔡永萍袁女袁教授袁博导袁主要从事植物分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 泽憎噪曾员圆岳 葬澡葬怎援 藻凿怎援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员缘冤园猿鄄园源缘源鄄园愿
砀山酥梨果实 悦韵酝栽基因的克隆和表达分析
程摇 敏员 摇 尹摇 梅员 摇 邹鹤伟员 摇 金摇 青员 摇 闫冲冲员 摇 林摇 毅员
张金云圆 摇 徐义流圆 摇 蔡永萍员
渊员 安徽农业大学生命科学学院袁 安徽 合肥摇 圆猿园园猿远曰圆 安徽农业科学院园艺研究所袁安徽 合肥摇 圆猿园园猿员冤
摘摇 要院梨果实石细胞的发育和木质素的合成尧转运及沉积密切相关遥 咖啡酸氧甲基转移酶渊悦韵酝栽冤是
木质素合成途径中的 员 种关键酶袁主要参与紫丁香基木质素渊泽赠则蚤灶早赠造 造蚤早灶蚤灶袁 杂鄄木质素冤的生物合成遥 本
研究以砀山酥梨果实为材料袁利用 砸栽鄄孕悦砸 技术并结合 砸粤悦耘 方法袁得到砀山酥梨 悦韵酝栽 基因的全长
糟阅晕粤袁命名为 孕遭悦韵酝栽 渊郧藻灶月葬灶噪 登录号为 运悦怨园缘园愿远冤遥 该基因全长 员 猿苑员 遭责袁开放阅读框为员 园怨愿 遭责袁
编码 猿远缘 个氨基酸遥 进化树分析发现砀山酥梨 悦韵酝栽 蛋白具有很高同源性袁与苹果的相似性达到
怨源豫 遥 将该基因重组到表达载体 责耘栽鄄猿圆葬渊 垣 冤中进行原核表达袁电泳检测到 员 条大约 远园郾 园 噪阅 的外源
蛋白袁与预测的融合蛋白分子量相符遥 荧光定量表达分析得知袁梨果实 孕遭悦韵酝栽 基因表达量变化与木
质素的含量变化趋势基本一致袁并且和石细胞发育规律有很大的相关性遥 本研究为阐明梨石细胞发育
分子机理奠定基础袁为分子调控石细胞含量尧改善梨果实口感提供了科学依据遥
关键词院砀山酥梨曰孕遭悦韵酝栽曰生物信息学分析曰原核表达曰荧光定量表达
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员缘郾 园猿援 园源缘源
摇 摇 砀山酥梨渊孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤 糟增援 阅葬灶早泽澡葬灶 杂怎冤原
产安徽省砀山袁栽培历史悠久袁是我国主要的梨出口品
种遥 近几年袁由于气候变化尧病虫危害及栽培管理粗放
等原因袁致使梨果实中石细胞含量增加袁从而导致梨果
肉粗而硬袁食而多渣袁最终影响砀山酥梨果实的食用品
质和经济价值咱员 原 圆暂 遥 果实中石细胞是一种厚壁组织细
胞袁是次生壁在初生壁上沉积形成的袁与木质素的合
成尧转运及沉积均密切相关咱猿 原 源暂 遥
咖 啡 酸 氧 甲 基 转 移 酶 渊 糟葬枣枣藻蚤糟 葬糟蚤凿 燥鄄
皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻袁悦韵酝栽冤是木质素合成途径中的关键
酶袁可以催化咖啡酸尧缘鄄羟基松柏醛和 缘鄄羟基松柏醇甲
基化分别生成阿魏酸尧芥子醛和芥子醇袁主要参与 杂 原
木质素的合成咱缘 原 远暂 遥 梨果实发育过程中袁悦韵酝栽 基因
如何参与木质素的合成从而影响梨石细胞的形成袁目
前鲜见报道遥 因此袁克隆和鉴定砀山酥梨果实中
悦韵酝栽基因袁并探讨梨果实石细胞形成过程中 悦韵酝栽
的分子特性袁对利用分子生物学技术调控梨石细胞的
发育和木质素的合成意义重大袁并为改善砀山酥梨品
质提供一定的研究基础遥
月怎早燥泽等咱苑暂首次从杨树中克隆出 悦韵酝栽 基因袁通
过 杂燥怎贼澡藻则灶杂交证明了其为多基因家族遥 迄今为止袁
很多植物的 悦韵酝栽基因已被鉴定袁包括绿竹尧茶树尧苹
果尧紫花苜蓿和苎麻等咱愿 原 员圆暂 遥 匀藻葬贼澡 等咱员猿暂发现了燕麦
草中存在 猿 种不同的 悦韵酝栽 基因袁并且分析得知三者
渊蕴责韵酝栽员袁蕴责韵酝栽圆袁 蕴责韵酝栽猿冤的编码区相似度达 苑缘豫
以上遥 砸葬早葬蚤等咱员源暂通过对不同植物来源的 悦韵酝栽蛋白
的氨基酸比对分析发现袁悦韵酝栽 有 缘 个氨基酸保守元
件院员院蕴灾阅郧郧郧曾郧曰圆院郧陨晕云阅蕴孕匀灾曰猿院耘匀灾郧郧阅酝云曰源院
晕郧运灾陨曰缘院郧郧运耘砸栽遥 前人对抑制 悦韵酝栽 表达的转基
因研究较多遥 大多数 悦韵酝栽 受抑制的转基因植物袁其
木质素含量变化不大袁但有些植物在 悦韵酝栽 活性被抑
制到足够低时袁杂 原木质素减少袁郧 原木质素变化不明
显袁木质素总含量降低咱员缘暂 遥 砸葬泽贼燥早蚤 等咱员远暂降低银合欢
中 悦韵酝栽的表达袁结果发现醛类物质增加袁杂 原木质素
含量明显下降遥 允燥怎葬灶蚤灶 等咱员苑暂在 悦韵酝栽 活性几近消失
的共抑制的转基因杨树中发现袁木质素含量下降
源缘源
摇 猿 期 砀山酥梨果实 悦韵酝栽基因的克隆和表达分析
员苑豫 袁杂 原木质素几乎为零袁但却出现大量的 缘鄄羟基鄄郧
原木质素渊杂 原木质素的前体冤遥
前期工作已经明确不同发育时期以及不同部位砀
山酥梨果实中木质素含量和石细胞含量的变化规律袁
即在砀山酥梨的整个发育过程中袁石细胞含量和木质
素含量呈显著正相关袁二者之间的变化趋势都是先增
加后减小曰另外分布在梨果实近果心部位的石细胞和
木质素较果中部位要多咱员愿 原 员怨暂 遥 但到目前为止袁砀山酥
梨木质素合成关键酶 孕月悦韵酝栽 基因及其表达模式的
研究未见报道遥 本试验以砀山酥梨果实为材料袁克隆
孕遭悦韵酝栽基因 糟阅晕粤序列袁然后进行生物信息学分析袁
研究其在梨果实不同发育时期以及不同部位的表达模
式袁并进行原核表达袁为研究砀山酥梨木质素合成途径
的基因调控及进一步通过调控石细胞含量尧改善梨果
实口感奠定基础遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 试验材料
试验于 圆园员圆 年 缘 月至 圆园员猿 年 员 月在安徽农业大
学生命科学学院进行遥 供试材料为砀山酥梨果实袁取
自安徽省砀山果园 缘园 年生砀山酥梨果树遥 于花后
圆猿凿开始定期取样袁即花后 圆猿尧猿怨尧源苑尧远猿 和 员圆缘凿渊成熟
期冤的砀山酥梨果实袁每次取大小均匀的果实 员园 个袁
冷藏条件运输袁在实验室 原 苑园益保存备用遥 大肠杆菌
菌株 耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢 和 月蕴圆员渊阅耘猿冤 购买于北京全式金
生物技术有限公司袁表达载体 责耘栽鄄猿圆葬渊 垣 冤购买于杭
州宝赛生物科技有限公司遥
员郾 圆摇 总 砸晕粤提取及反转录
采用北京天根生化有限公司 砸晕粤责则藻责 孕怎则藻 孕造葬灶贼
运蚤贼提取试剂盒提取梨果实的总 砸晕粤遥 糟阅晕粤 第一链
合成采用 栽粤运粤砸粤 公司的 孕则蚤皂杂糟则蚤责贼栽皂 枣蚤则泽贼 泽贼则葬灶凿
糟阅晕粤 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 噪蚤贼反转录合成遥 合成的 糟阅晕粤 保存在
原圆园益袁用于后续相关试验遥
员郾 猿摇 孕遭悦韵酝栽基因全长 糟阅晕粤克隆
根据 郧藻灶月葬灶噪 上编码 悦韵酝栽 蛋白保守区段序列
设计简并引物 孕遭悦韵酝栽鄄云 和 孕遭悦韵酝栽鄄砸渊表 员冤遥 反应
条件为院怨源益预变性 缘 皂蚤灶曰怨源益变性 猿园 泽袁缘苑益退火 猿园
泽袁苑圆益延伸 源缘 泽袁猿园 个循环曰最后 苑圆益延伸 苑 皂蚤灶遥
孕悦砸产物经 员郾 园豫琼脂糖凝胶电泳检测袁回收纯化目
的条带袁连接 责酝阅员愿鄄栽 载体袁转化感受态 耘援 糟燥造蚤
阅匀缘琢袁通过蓝白斑筛选菌落袁将 孕悦砸验证的阳性克隆
送上海生物工程技术服务有限公司测序遥
得到保守片段后袁再据此设计 猿爷砸粤悦耘 反应和 缘忆
砸粤悦耘反应所需的巢式引物院 猿忆砸粤悦耘 燥怎贼藻则 孕则蚤皂藻则袁猿忆
砸粤悦耘 蚤灶灶藻则 孕则蚤皂藻则袁缘忆砸粤悦耘 燥怎贼藻则 孕则蚤皂藻则袁缘忆砸粤悦耘 蚤灶灶藻则
孕则蚤皂藻则遥 本试验中所用到的全部引物如表 员 所示遥 猿忆鄄
砸粤悦耘和 缘忆鄄砸粤悦耘渊泽皂葬则贼 则葬糟藻 噪蚤贼袁糟造燥灶贼糟澡援 责燥造燥 葬造贼燥冤方
法步骤参照说明书遥 孕悦砸 反应产物放在 源 益保存备
用遥 栽粤克隆摇菌送到上海生工测序后拼接基因全长遥
表 员摇 本研究中使用的主要引物
栽葬遭造藻 员摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
引物名称
孕则蚤皂藻则 灶葬皂藻
序列渊缘忆鄄猿忆冤
杂藻择怎藻灶糟藻 渊缘忆鄄猿忆冤
孕遭悦韵酝栽鄄云 郧粤砸粤栽匀粤栽郧郧悦晕粤粤砸郧悦晕郧郧晕悦悦
孕遭悦韵酝栽鄄砸 粤悦砸粤粤悦粤栽砸栽悦晕悦悦晕悦悦晕粤悦砸栽郧
猿忆砸粤悦耘 燥怎贼藻则 责则蚤皂藻则 悦栽栽悦悦粤栽栽郧郧栽栽悦栽悦栽郧栽郧悦悦
猿忆砸粤悦耘 蚤灶灶藻则 责则蚤皂藻则 粤郧郧郧粤粤栽郧郧悦栽郧粤悦悦粤悦栽悦栽粤
缘忆砸粤悦耘 燥怎贼藻则 责则蚤皂藻则 粤郧粤郧栽郧郧栽悦粤郧悦悦粤栽栽悦悦悦栽栽郧
缘忆砸粤悦耘 蚤灶灶藻则 责则蚤皂藻则 粤粤郧栽郧栽郧悦郧郧粤郧郧郧粤郧栽粤粤郧栽郧
孕遭悦韵酝栽鄄匝云 郧郧粤粤栽郧郧悦栽郧粤悦悦粤悦栽悦栽粤悦
孕遭悦韵酝栽鄄匝砸 栽悦粤悦粤粤郧郧栽栽栽悦悦悦栽悦栽粤悦郧
栽怎遭怎造蚤灶鄄云 粤郧粤粤悦粤粤郧粤粤悦栽悦郧栽悦悦栽粤悦
栽怎遭怎造蚤灶鄄砸 郧粤粤悦栽郧悦栽悦郧悦栽悦粤悦栽悦栽悦悦
酝匝鄄云 栽粤郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧郧栽栽悦郧粤悦悦悦悦粤郧粤郧
酝匝鄄砸 郧悦粤粤郧悦栽栽郧悦粤郧粤郧郧郧粤郧悦粤栽郧悦悦粤
员郾 源摇 核苷酸序列和生物信息学分析
利用 晕悦月陨 网站对 孕遭悦韵酝栽 基因进行同源性分
析尧开放读码框分析曰利用 孕则蚤皂藻则 孕则藻皂蚤藻则 缘郾 园 软件推
测得到的氨基酸序列曰利用 阅晕粤皂葬灶 软件进行序列分
析和进化树绘制曰利用 杂酝粤砸栽 在线工具 渊 澡贼贼责院 辕 辕
憎憎憎援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 糟早蚤鄄遭蚤灶 辕 责则燥泽蚤贼藻冤分析得到氨基酸序列
的结构功能域曰利用 杂蚤早灶葬造孕 源郾 园 杂藻则增藻则 软件进行信号
肽分析曰利用 孕则藻凿蚤糟贼孕则燥贼藻蚤灶 在线分析工具 渊 澡贼贼责院 辕 辕
憎憎憎援 责则藻凿蚤糟贼责则燥贼藻蚤灶援 燥则早 辕 冤预测二级结构曰利用 孕阅月 数
据库 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 则糟泽遭援 燥则早 辕 责凿遭 辕 澡燥皂藻 辕 澡燥皂藻援 凿燥冤和
杂宰陨杂杂鄄酝韵阅耘蕴在线工具渊澡贼贼责院 辕 辕 泽憎蚤泽泽 鄄皂燥凿藻造援 藻曾责葬泽赠援
燥则早 辕 冤进行同源建模遥
员郾 缘摇 原核表达载体的构建
以 责耘栽鄄猿圆葬渊 垣 冤作为表达载体袁根据 孕遭悦韵酝栽 基
因的 韵砸云袁设计带有酶切位点的引物 酝匝鄄云院 缘忆鄄
栽粤郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧郧栽栽悦郧粤悦悦悦悦粤郧粤郧鄄猿忆渊划线显示
月葬皂匀玉位点冤袁酝匝鄄砸院缘忆鄄郧悦粤粤郧悦栽栽郧悦粤郧粤郧郧郧粤郧悦
粤栽郧悦悦粤 鄄猿忆 渊划线显示 匀蚤灶凿芋位点冤袁进行 孕悦砸扩增
回收纯化后和 责耘栽鄄猿圆葬渊 垣 冤载体分别用 月葬皂匀玉和
匀蚤灶凿芋双酶切袁回收酶切产物袁再用 栽源阅晕粤 连接酶连
缘缘源
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
接袁获得重组质粒 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽袁热激转入表达菌
耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员渊阅耘猿冤感受态细胞袁氨苄抗性筛选袁通过
孕悦砸和双酶切进行鉴定遥
员郾 远摇 孕遭悦韵酝栽蛋白的诱导表达和 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析
将重组菌株在 蕴月 液体培养基渊缘园 滋早窑皂蕴 原员氨
苄冤中 猿苑益过夜培养袁按 员颐 员园园 的比例加入到 缘 皂蕴 蕴月
培养基渊缘园滋早窑皂蕴 原员氨苄冤中 圆园园 则窑皂蚤灶 原员 猿苑益培养
至 韵阅远园园值为 园郾 远 耀 园郾 愿 时袁加 陨孕栽郧 至终浓度分别为
园郾 圆尧园郾 源尧园郾 远 和 园郾 愿 皂皂燥造窑蕴 原员袁 猿苑益诱导 猿 澡后收集
菌体遥 菌体样品加入 员园 滋蕴 缘 伊 造燥葬凿蚤灶早 月怎枣枣藻则和 源园 滋蕴
凿凿匀圆韵袁沸水浴 缘 皂蚤灶袁冰上冷却后袁取 员园 滋蕴进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘渊缘豫浓缩胶袁员圆豫分离胶冤电泳后经考马斯亮蓝
染色并拍照分析蛋白表达的最适 陨孕栽郧 诱导浓度遥 按
上述方法袁用最适 陨孕栽郧 诱导浓度诱导重组菌株表达袁
猿苑益培养尧员郾 园尧员郾 缘尧圆郾 园 和 圆郾 缘 澡 后分别收集菌体袁进
行 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳袁分析蛋白表达情况袁确定蛋白表达
的最适培养时间遥 圆 次试验均以不加 陨孕栽郧 诱导的
责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽重组质粒和 责耘栽鄄猿圆葬 空载体作为对
照遥
注院粤院 孕遭悦韵酝栽特异性片段扩增曰月院 猿忆砸粤悦耘扩增曰 悦院 缘忆砸粤悦耘扩增曰 酝院 圆缘园遭责 造葬凿凿藻则遥
晕燥贼藻院粤院 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 孕遭悦韵酝栽 早藻灶藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟 枣则葬早皂藻灶贼援 月院 猿忆砸粤悦耘 责则燥凿怎糟贼泽援 悦院 缘忆砸粤悦耘 责则燥凿怎糟贼泽援 酝院 圆缘园遭责 造葬凿凿藻则援
图 员摇 砀山酥梨 孕遭悦韵酝栽基因克隆的 孕悦砸结果
云蚤早援 员摇 栽澡藻 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 则藻泽怎造贼泽 燥枣 孕月悦韵酝栽 早藻灶藻 枣则葬早皂藻灶贼泽
员郾 苑摇 孕遭悦韵酝栽基因的实时荧光定量表达分析
根据获得的 孕遭悦韵酝栽 基因全长序列设计荧光定
量 孕悦砸 特异性引物 孕遭悦韵酝栽鄄匝云 和 孕遭悦韵酝栽鄄匝砸渊表
员冤袁选取 栽怎遭怎造蚤灶 渊登录号为院粤月圆猿怨远愿园郾 员冤基因为内参
基因袁设计内参引物 栽怎遭怎造蚤灶鄄云 和 栽怎遭怎造蚤灶鄄砸渊表 员冤遥
使用 粤月陨苑缘园园 荧光定量 孕悦砸仪反应袁用稀释 圆 倍后的
糟阅晕粤模板进行片段扩增袁反应体系院杂再月砸 襃 孕则藻皂蚤曾
耘曾 栽葬择栽酝域渊圆营冤员园滋蕴袁模板稀释液 员 滋蕴袁上下游引物
各 园郾 缘 滋蕴袁加水补充至 圆园 滋蕴 体系遥 孕悦砸 反应程序
为院缘园益 圆 皂蚤灶袁怨缘益预变性 猿园 泽袁怨缘益变性 员缘 泽袁远园益
退火 圆园 泽渊扫描读取 悦贼值冤曰苑圆益延伸 圆园 泽袁源园 个循环遥
以梨 缘 个发育时期渊花后 圆猿尧猿怨尧源苑尧远猿尧员圆缘 天冤的近果
皮处的 糟阅晕粤以及花后 源苑 凿 和 远猿 凿 猿 个部位渊近果
皮尧果中部和近果核部位冤的 糟阅晕粤 为样本袁每个样本
做 猿 个重复袁按照 圆 原 驻驻悦栽法计算基因的相对表达量遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 孕遭悦韵酝栽基因全长 糟阅晕粤克隆
利用引物 孕遭悦韵酝栽鄄云和 孕遭悦韵酝栽鄄砸扩增得到 员 条
远园园 遭责左右的条带渊图 员 原 粤冤遥 采用 猿忆砸粤悦耘 的方法
经 圆 轮扩增得到 员 条约 愿园园 遭责 的条带渊图 员 原 月冤曰采
用缘忆砸粤悦耘的方法扩增 孕遭悦韵酝栽 的 缘忆端袁得到 员 条约
源园园 遭责的 阅晕粤片段渊图 员 原 悦冤遥 拼接获得 孕遭悦韵酝栽基
因的全长为 员 猿苑员 遭责袁包括 员 园怨愿 遭责的开放阅读框袁苑园
遭责的 缘忆鄄哉栽砸 和 员缘苑 遭责的 猿忆 鄄哉栽砸袁源远 遭责 的 责燥造赠粤袁共
编码 猿远缘 个氨基酸袁在 郧藻灶月葬灶噪的登录号为 运悦怨园缘园愿远
渊图 圆冤遥
圆郾 圆摇 孕遭悦韵酝栽基因生物信息学分析
用在线网站 渊 澡贼贼责院 辕 辕 蚤泽燥藻造藻糟贼则蚤糟援 燥增澡援 燥则早 辕 冤 预测
孕遭悦韵酝栽蛋白的理论分子量约为 源园郾 园 噪阅袁理论等电点
为 缘郾 远员袁说明该蛋白呈酸性袁这也与其他 悦韵酝栽 蛋白
特征相似遥 利用 杂蚤早灶葬造孕 源郾 园 杂藻则增藻则 软件检测发现
孕遭悦韵酝栽蛋白 晕端无信号肽袁是非分泌性蛋白遥
利用 晕悦月陨 月蕴粤杂栽检索 孕遭悦韵酝栽与其他植物的氨
基酸同源性袁并用 阅晕粤皂葬灶 软件绘制系统进化树渊图
猿冤遥 多重比对发现蔷薇科植物砀山酥梨尧苹果尧中国
月季尧碧桃尧巴丹杏和草莓明显聚为 员 类袁其中砀山酥
梨氨基酸序列与苹果的同源性最高袁相似性达到
远缘源
摇 猿 期 砀山酥梨果实 悦韵酝栽基因的克隆和表达分析
注院 野 原 冶和 野鄢冶分别表示起始密码子和终止密码子袁方框表示保守元件遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 泽贼葬则贼 糟燥凿燥灶 蚤泽 怎灶凿藻则造蚤灶藻凿 葬灶凿 泽贼燥责 糟燥凿燥灶 蚤泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 遭赠 葬灶 葬泽贼藻则蚤泽噪援 栽澡藻 糟燥灶泽藻则增藻凿 凿燥皂葬蚤灶 葬则藻 皂葬则噪藻凿 憎蚤贼澡 遭燥曾援
图 圆摇 孕遭悦韵酝栽基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
云蚤早援 圆摇 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 葬灶凿 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 孕遭悦韵酝栽 早藻灶藻
怨源豫 袁与其他植物的序列相似性也都高于 苑园豫 袁说明
悦韵酝栽基因在不同物种中是较为保守的遥
利用 孕则藻凿蚤糟贼孕则燥贼藻蚤灶 在线分析工具预测 孕遭悦韵酝栽二
级结构袁发现 琢螺旋占 源远郾 愿豫袁茁折叠 怨郾 怨豫袁无规则卷
曲占 源猿郾 猿豫遥 杂酝粤砸栽 软件分析其功能结构域袁结果显
示在蛋白的 晕末端有调节蛋白质二聚作用的结构域袁同
苑缘源
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
时也发现了催化 杂粤酝渊杂鄄腺苷鄄甲硫氨酸冤的甲基转移酶
结构域渊图 源冤遥 利用 孕阅月 数据库和 杂宰陨杂杂鄄酝韵阅耘蕴 在
线工具构建砀山酥梨的同源模型渊图 缘冤遥
图 猿摇 孕遭悦韵酝栽与其他植物 悦韵酝栽氨
基酸序列的关系分析
云蚤早援 猿摇 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 燥枣 葬皂蚤皂燥 葬糟蚤凿
泽藻择怎藻灶糟藻泽 遭藻贼憎藻藻灶 孕遭悦韵酝栽 葬灶凿 燥贼澡藻则 悦韵酝栽 责则燥贼藻蚤灶泽
图 源摇 杂酝粤砸栽分析 孕遭悦韵酝栽结构域
云蚤早援 源摇 栽澡藻 凿燥皂葬蚤灶 燥枣 孕遭悦韵酝栽 凿藻凿怎糟藻凿 遭赠 杂酝粤砸栽 泽燥造枣贼憎葬则藻
圆郾 猿摇 原核表达载体的构建及鉴定
用带有酶切位点的引物 酝匝鄄砸 和 酝匝鄄云 扩增
孕遭悦韵酝栽基因的 糟阅晕粤 序列袁电泳检测到预期大小片
段并纯回收遥 然后用 月葬皂匀玉和 匀蚤灶凿芋 酶切目的基
因和原核表达载体袁利用 栽源阅晕粤连接酶连接获得重组
质粒 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽遥 对重组质粒进行 孕悦砸和双酶
切鉴定袁均可获得 员 条约 员 员园园 遭责 的条带渊图 远冤遥 测
序目的条带袁序列比对结果表明 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 原
核表达载体构建成功遥
圆郾 源摇 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析
为确定融合蛋白诱导表达所需的 陨孕栽郧 最适浓度
和时间袁先用 陨孕栽郧 浓度为 园郾 圆尧 园郾 源尧 园郾 远 和 园郾 愿
皂皂燥造窑蕴 原员袁猿苑益 诱导 猿 澡 后收集菌液袁进行 杂阅杂鄄
孕粤郧耘分析渊图 苑 原 粤冤遥 结果发现最适 陨孕栽郧诱导浓度
为 园郾 圆 皂皂燥造窑蕴 原员袁然后用此浓度诱导重组菌株袁猿苑益
分别培养 员郾 园尧员郾 缘尧圆郾 园尧和 圆郾 缘 澡 收集菌液袁进行 杂阅杂鄄
孕粤郧耘电泳渊图 苑 原 月冤袁分析发现蛋白表达的最适培养
时间是 员郾 缘 澡遥 圆 次试验均以不加 陨孕栽郧 诱导的 责耘栽鄄
猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽重组质粒和 责耘栽鄄猿圆葬 空载体作为对照遥
两种情况下都诱导出融合蛋白袁但对照组无融合蛋白
表达遥 在分子量约为 远园郾 园 噪阅的位置可见 员 条融合蛋
白条带袁这与前面砀山酥梨 孕遭悦韵酝栽 编码区蛋白的预
测分子量相符遥
圆郾 缘 摇 砀山酥梨果实不同发育阶段和不同部位
孕遭悦韵酝栽基因表达量分析
利用实时荧光定量 孕悦砸 技术袁将 栽怎遭怎造蚤灶 基因作
为内参袁对砀山酥梨 孕遭悦韵酝栽 基因在花后不同发育阶
段及不同部位表达量进行研究遥 结果发现袁在花后
圆猿凿到 远猿凿袁孕遭悦韵酝栽 基因表达量呈逐渐增加的趋势袁
并在 远猿凿 时达到最大值 员郾 猿员遥 在果实成熟期渊花后
员圆缘凿冤袁基因表达量下降至最低值渊图 愿冤遥
比较前人研究发现袁砀山酥梨果实石细胞和石细
胞团发育的高峰期是在花后 员缘 耀 远苑凿袁同时木质素含
量变化总体呈现先上升后下降的趋势袁并且在 源苑凿 和
远猿凿出现 圆 次高峰咱圆园暂 遥 荧光定量分析砀山酥梨果实 猿
个不同部位在花后 源苑凿 和 远猿凿 的 孕遭悦韵酝栽 表达量发
现袁花后 源苑凿梨果中部 孕遭悦韵酝栽 表达量高于 远猿凿 果中
部的表达量袁这也许是在 源苑 耀 远猿凿时间段内袁砀山酥梨
果实中石细胞合成高峰区由果中部向近果核处转移遥
梨果实 孕遭悦韵酝栽 基因表达量变化与木质素的含量变
化趋势基本一致袁并且和石细胞发育规律有很大的相
关性袁表明 孕遭悦韵酝栽 基因参与了木质素的聚合袁从而
影响石细胞的发育遥
愿缘源
摇 猿 期 砀山酥梨果实 悦韵酝栽基因的克隆和表达分析
注院粤院 酝院 缘园园园 蛋白 皂葬则噪藻则袁 员院 责耘栽鄄猿圆葬未诱导袁圆院 责耘栽鄄猿圆葬诱导袁猿院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽未诱导袁源鄄苑院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 陨孕栽郧浓度分别
为 园郾 圆尧园郾 源尧园郾 远尧和 园郾 愿 皂皂燥造窑蕴 原员诱导 猿澡曰月院 酝院 缘园园园 蛋白 皂葬则噪藻则袁 员院 责耘栽鄄猿圆葬 未诱导袁圆院 责耘栽鄄猿圆葬 诱导袁猿院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 未诱
摇 摇 摇 摇 导袁源鄄苑院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 陨孕栽郧 园郾 圆 皂皂燥造窑蕴 原员分别诱导 员郾 园尧员郾 缘尧圆郾 园 和 圆郾 缘 澡遥
晕燥贼藻院粤院 酝院 缘园园园 责则燥贼藻蚤灶 皂葬则噪藻则袁 员院 责耘栽鄄猿圆葬 憎蚤贼澡燥怎贼 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶袁 圆院 责耘栽鄄猿圆葬 憎蚤贼澡 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶袁 猿院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 憎蚤贼澡燥怎贼 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶袁 源鄄苑院
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猿圆葬 憎蚤贼澡 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶袁 猿院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 憎蚤贼澡燥怎贼 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶袁 源鄄苑院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 园郾 圆 皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧 枣燥则 员郾 园袁 员郾 缘袁 圆郾 园 葬灶凿
圆郾 缘 澡援
图 苑摇 孕遭悦韵酝栽 的原核表达
云蚤早援 苑摇 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 孕遭悦韵酝栽 责则燥贼藻蚤灶
图 缘摇 孕遭悦韵酝栽的三级结构模型
云蚤早援 缘摇 孕则藻凿蚤糟贼藻凿 贼藻则贼蚤葬则赠 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 孕遭悦韵酝栽 责则燥贼藻蚤灶援
猿摇 讨论
参与木质素合成途径的相关酶类很多袁而 悦韵酝栽
是其中一个重要的甲基转移酶袁前人研究表明袁抑制
悦韵酝栽基因的表达能改变转基因植株中木质素含量或
组成咱圆员 原 圆猿暂 遥 本研究表明砀山酥梨 孕遭悦韵酝栽 参与了木
质素的合成袁并且进一步影响梨石细胞的形成遥
本研究克隆得到砀山酥梨 孕遭悦韵酝栽 基因全长袁其
注院员院 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽双酶切结果曰圆院 孕悦砸结果曰酝院 圆缘园遭责 造葬凿凿藻则遥
晕燥贼藻院员院 阅蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽袁 圆院 孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽袁 酝院 圆缘园遭责 造葬凿凿藻则援
图 远摇 重组质粒 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽酶切和
孕悦砸验证结果
云蚤早援 远摇 砸藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 葬灶凿 孕悦砸
葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽
蛋白氨基酸与其他物种具有很高的同源性遥 结构域分
析显示该蛋白的 晕端具有 缘圆 遭责的蛋白二聚化作用域
和 圆源猿 遭责的催化 杂粤酝 的氧甲基转移酶结构域袁这些
结构域是咖啡酸氧甲基转移酶共有的特性袁尤其是后
者可以催化羟基化单体木质素前体多步甲基化反应袁
在木质素合成途径中作用巨大咱圆源暂 遥 分析发现砀山酥
怨缘源
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
梨 孕遭悦韵酝栽蛋白具有以下 缘 个氨基酸保守序列渊晕 到
悦 端 冤院 玉院 灾阅灾郧郧郧栽郧曰 域院 阅陨晕云阅蕴孕匀灾曰 芋院
耘匀灾郧郧阅酝云曰郁院晕郧运灾陨曰遇院郧郧运耘砸栽遥 这 缘 个保守元
件包含 猿远 个氨基酸残基袁靠近 悦端的 猿 个保守元件富
含甘氨酸残基遥 这些区域在大多数植物的 悦韵酝栽
糟阅晕粤克隆中具有很高的保守性咱远袁圆缘暂 袁并且保守区玉
和遇被认为是 杂粤酝和金属的结合部位咱员源暂 遥
图 愿摇 荧光定量 孕悦砸检测 孕遭悦韵酝栽基因在果
实不同发育时期及不同部位的表达
云蚤早援 愿摇 栽澡藻 则藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造 燥枣 孕遭悦韵酝栽 蚤灶
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葬泽 凿藻贼藻则皂蚤灶藻凿 遭赠 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 孕悦砸
此外袁本研究将 孕遭悦韵酝栽 基因和表达载体 责耘栽鄄
猿圆葬渊 垣 冤重组袁转入大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤中诱导融合
蛋白表达袁通过 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳分析表明袁孕遭悦韵酝栽 基
因可以与 匀蚤泽标签蛋白形成融合蛋白袁并能在原核表
达体系中得到正确表达袁这为多克隆抗体的制备及研
究 孕遭悦韵酝栽基因的功能奠定基础遥
荧光定量表达分析显示袁砀山酥梨不同生长时期
孕遭悦韵酝栽基因表达量有差异袁花后 圆猿 耀 远猿凿 逐渐上升袁
在 远猿凿时达到最高峰袁这可能是由于 员缘 耀 远猿凿 木质素
大量合成袁进而致使石细胞聚合遥 员圆缘凿 砀山酥梨果实
中石细胞合成基本结束袁木质素含量稳定袁孕遭悦韵酝栽 表
达量恢复较低水平遥 果中部 孕遭悦韵酝栽表达量在 源苑凿时
高于 远猿凿袁这可能是由于石细胞合成高峰区由果中部
向果核处转移导致袁并且致使 远猿凿 近果核处的表达量
高于 源苑凿遥 砀山酥梨 孕遭悦韵酝栽基因的表达规律说明了
孕遭悦韵酝栽参与了木质素的合成和石细胞的发育遥 今后
可以通过分子手段调控 孕遭悦韵酝栽 基因的表达来改善
梨果实中石细胞及石细胞团的含量袁从而改善梨果实
品质遥
源摇 结论
本研究首次成功克隆砀山酥梨果实 孕遭悦韵酝栽 基
因袁并通过多种生物软件分析了 孕遭悦韵酝栽 蛋白分子
量尧同源性尧二级结构尧保守元件以及三维结构等相关
信息遥 荧光定量表达结果表明 孕遭悦韵酝栽 基因表达模
式和前人研究的石细胞及木质素发育规律有重大关
系袁因此推测 孕遭悦韵酝栽基因在梨果实石细胞形成机制
中发挥一定的作用遥 孕遭悦韵酝栽基因的原核表达结果为
其蛋白功能鉴定奠定了基础袁也为通过分子手段改善
梨果实口感提供了新的技术途径遥 为探索构建真核表
达载体进行遗传转化袁培育石细胞含量低尧口感优良的
梨品种打下基础遥
参考文献院
咱 员 暂摇 阿拉木萨袁 李宝江援 梨果实石细胞团的发育尧分布及其对果实品
质的影响咱允暂 援 北方果树袁员怨怨怨袁 渊源冤院 源 原 远
咱 圆 暂摇 刘小阳袁李玲袁宗梅袁蔡永萍援 梨果实石细胞含量分布及其对梨
品质的影响咱允暂 援 安徽农业大学学报袁 圆园园源袁 猿员渊员冤院 员园源 原 员园远
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猿苑怨
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远缘源缘
咱 远 暂摇 李波袁 倪志勇袁 王娟袁 吕萌袁 范玲援 木质素生物合成关键酶咖啡
酸 原 韵 原甲基转移酶基因渊悦韵酝栽冤的研究进展咱 允暂 援 分子植物育
种袁 圆园员园袁 愿渊员冤院员员苑 原 员圆源
咱 苑 暂摇 月怎早燥泽 砸 悦袁 悦澡蚤葬灶早 灾 蕴袁 悦葬皂责遭藻造造 宰 匀援 糟阅晕粤 糟造燥灶蚤灶早袁 泽藻择怎藻灶糟藻
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酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨怨员袁 员苑渊远冤院员圆园猿 原 员圆员缘
咱 愿 暂摇 李雪平袁 高志民袁 彭镇华袁 岳永德袁 高健袁 蔡春菊袁 牟少华援 绿
竹咖啡酸 原 韵 原 甲基转移酶基因渊 悦韵酝栽冤的克隆及相关分析
咱允暂 援 林业科学研究袁 圆园园苑袁 圆园渊缘冤院苑圆圆 原 苑圆缘
咱 怨 暂摇 李小霞袁 余有本援 茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及原核
表达咱允暂 援 西北农业学报袁 圆园员员袁 圆园渊远冤院 员猿怨 原 员源猿
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孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨怨员袁 怨苑渊员冤院 员 原 员源
咱员圆暂摇 黄春琼袁 郭安平袁章霄云袁 刘国道援 苎麻 悦韵酝栽基因的克隆及序
列分析咱允暂 援 热带农业科学袁 圆园园愿袁 圆源渊缘冤院 猿愿远 原 猿怨员
咱员猿暂摇 匀藻葬贼澡 砸袁 匀怎曾造藻赠 匀袁 杂贼燥灶藻 月袁 杂责葬灶早藻灶遭藻则早 郧援 糟阅晕粤 糟造燥灶蚤灶早 葬灶凿
凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼澡则藻藻 糟葬枣枣藻蚤糟 葬糟蚤凿 韵鄄皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻
澡燥皂燥造燥早怎藻泽 枣则燥皂 责藻则藻灶灶蚤葬造 则赠藻早则葬泽泽 渊蕴燥造蚤怎皂 责藻则藻灶灶藻冤 咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造
燥枣 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨怨愿袁 员缘猿渊缘 辕 远冤院 远源怨 原 远缘苑
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原 韵鄄皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 葬造枣葬造枣葬援 蚤皂责葬糟贼泽 燥灶 造蚤早灶蚤灶
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员猿远猿 原 员猿苑源
咱员愿暂摇 李国庆袁 砀山酥梨石细胞发育过程中木质素沉积及结构特性的
研究咱阅暂援 合肥院 安徽农业大学袁 圆园员园院员怨 原 圆园
咱员怨暂摇 聂敬全袁 砀山酥梨果实石细胞解剖学研究及木质素合成途径的
初步分析咱阅暂援 合肥院 安徽农业大学袁 圆园园怨院猿猿 原 猿缘
咱圆园暂摇 聂敬全袁 蔡永萍袁 张士鸿袁 林毅袁 徐义流袁 张金云援砀山酥梨果
实发育过程石细胞与薄壁细胞关系的解剖学研究咱 允暂 援 园艺学
报袁 圆园园怨袁 猿远渊愿冤院员圆园怨 原 员圆员源
咱圆员暂摇 宰藻蚤 允 匀袁 杂燥灶早 再 砸援 粤凿增葬灶糟藻泽 蚤灶 泽贼怎凿赠 燥枣 造蚤早灶蚤灶 遭蚤燥泽赠灶贼澡泽蚤泽 葬灶凿
皂葬灶蚤责怎造葬贼蚤燥灶 咱允暂 援 粤糟贼葬 月燥贼葬灶蚤糟葬 杂蚤灶蚤糟葬袁 圆园园员袁 源猿渊愿冤院 苑苑员 原 苑苑怨
咱圆圆暂摇 在澡燥灶早 砸 匝袁 酝燥则则蚤泽燥皂 匀袁 晕藻早则藻造 允袁 再藻 在 匀援 阅怎葬造 皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶
责葬贼澡憎葬赠泽 蚤灶 造蚤早灶蚤灶 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 咱 允暂 援 栽澡藻 孕造葬灶贼 悦藻造造袁 员怨怨愿袁 员园
渊员圆冤院 圆园猿猿 原 圆园源缘
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咱圆源暂摇 陨遭则葬澡蚤皂 砸 运袁 月则怎灶藻葬怎 粤袁 月葬灶贼蚤早灶蚤藻泽 月援 孕造葬灶早 韵鄄
皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽院 皂燥造藻糟怎造葬则 葬灶葬造赠泽蚤泽袁 糟燥皂皂燥灶 泽蚤早灶葬贼怎则藻 葬灶凿
糟造葬泽泽蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 咱允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨怨愿袁 猿远渊员冤院员 原 员园
咱圆缘暂摇 宰藻蚤 允 匀袁 在澡葬燥 匀 再袁 蕴怎 杂 云援 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 糟阅晕粤 藻灶糟燥凿蚤灶早 悦韵酝栽
枣则燥皂 悦澡蚤灶藻泽藻 憎澡蚤贼藻 责燥责造葬则 渊 孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬 悦葬则则 冤袁 泽藻择怎藻灶糟藻
葬灶葬造赠泽蚤泽 葬灶凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 咱 允暂 援 粤糟贼葬 月燥贼葬灶蚤糟葬 杂蚤灶蚤糟葬袁 圆园园员袁
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悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 悦韵酝栽 郧藻灶藻 蚤灶
孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤 糟增援 阅葬灶早泽澡葬灶 杂怎 云则怎蚤贼
悦匀耘晕郧 酝蚤灶员 摇 再陨晕 酝藻蚤员 摇 在韵哉 匀藻憎藻蚤员 摇 允陨晕 匝蚤灶早员 摇 再粤晕 悦澡燥灶早糟澡燥灶早员 摇 蕴陨晕 再蚤员
在匀粤晕郧 允蚤灶赠怎灶圆 摇 载哉 再蚤造蚤怎圆 摇 悦粤陨 再燥灶早责蚤灶早员
渊员杂糟澡燥燥造 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻袁 粤灶澡怎蚤 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀藻枣藻蚤袁 粤灶澡怎蚤摇 圆猿园园猿远曰
圆匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则葬造 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻袁 粤灶澡怎蚤 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 匀藻枣藻蚤袁 粤灶澡怎蚤摇 圆猿园园猿员冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽澡藻 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 责藻葬则 泽贼燥灶藻 糟藻造造 蚤泽 糟造燥泽藻造赠 则藻造葬贼藻凿 贼燥 贼澡藻 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽袁 贼则葬灶泽枣藻则 葬灶凿 凿藻责燥泽蚤贼蚤燥灶 燥枣 造蚤早灶蚤灶援 悦葬枣枣藻蚤糟
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造蚤早灶蚤灶援 陨灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠袁 葬 悦韵酝栽 早藻灶藻 灶葬皂藻凿 孕遭悦韵酝栽 渊郧藻灶月葬灶噪 粤糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 运悦怨园缘园愿远冤 枣则燥皂 孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤
糟增援 阅葬灶早泽澡葬灶 杂怎 枣则怎蚤贼 怎泽蚤灶早 砸栽鄄孕悦砸 葬灶凿 砸粤悦耘 皂藻贼澡燥凿泽 憎葬泽 糟造燥灶藻凿援 栽澡藻 孕遭悦韵酝栽 糟阅晕粤 糟燥皂责则蚤泽藻泽 员猿苑员 遭责袁 憎蚤贼澡 葬灶
韵砸云 燥枣 员园怨愿 遭责袁 憎澡蚤糟澡 藻灶糟燥凿藻泽 葬 责怎贼葬贼蚤增藻 责则燥贼藻蚤灶 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 猿远缘 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 则藻泽蚤凿怎藻泽援 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿
贼澡葬贼 孕遭悦韵酝栽 泽澡葬则藻凿 澡蚤早澡 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 憎蚤贼澡 燥贼澡藻则 责造葬灶贼 悦韵酝栽泽袁 葬灶凿 泽澡燥憎藻凿 怨源豫 澡燥皂燥造燥早赠 憎蚤贼澡 葬责责造藻泽援 云怎则贼澡藻则皂燥则藻袁 葬
责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责耘栽鄄猿圆葬鄄孕遭悦韵酝栽 憎葬泽 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 葬灶凿 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 蚤灶贼燥 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员 渊 阅耘猿冤援 栽澡藻灶 葬
枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 憎蚤贼澡 皂燥造藻糟怎造葬则 皂葬泽泽 远园郾 园 噪阅 憎葬泽 责则燥凿怎糟藻凿援 云造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻
糟澡葬灶早藻 燥枣 孕遭悦韵酝栽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造 憎葬泽 泽蚤皂蚤造葬则 贼燥 贼澡葬贼 燥枣 造蚤早灶蚤灶 糟燥灶贼藻灶贼袁 葬灶凿 葬造泽燥 澡葬凿 早则藻葬贼 则藻造藻增葬灶糟藻 憎蚤贼澡 泽贼燥灶藻 糟藻造造
凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 则怎造藻泽援 栽澡藻 责则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠 蚤泽 贼燥 藻造怎糟蚤凿葬贼藻 贼澡藻 皂燥造藻糟怎造葬则 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 泽贼燥灶藻 糟藻造造 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 蚤灶 责藻葬则袁 憎澡蚤糟澡
憎蚤造造 责则燥增蚤凿藻 葬 遭葬泽蚤泽 枣燥则 枣怎则贼澡藻则 则藻泽藻葬则糟澡藻泽 燥灶 贼澡藻 则藻早怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 泽贼燥灶藻 糟藻造造 糟燥灶贼藻灶贼 葬灶凿 贼澡藻 蚤皂责则燥增藻皂藻灶贼 燥枣 责藻葬则 贼葬泽贼藻援
运藻赠憎燥则凿泽院孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤 糟增援 阅葬灶早泽澡葬灶 杂怎袁 孕遭悦韵酝栽袁 遭蚤燥蚤灶枣燥则皂葬贼蚤糟泽 葬灶葬造赠泽蚤泽袁 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶袁 则藻葬造鄄贼蚤皂藻
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