全 文 ：书核 农 学 报 2015，29 ( 2 ) : 0209 ～ 0214
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期: 2014-03-24 接受日期: 2014-11-10
基金项目:国家自然科学基金项目( 31160259 ) ，转基因作物重大专项( 2009ZX08001-020B) ，海南大学科研基金项目( kyqd1045 )
作者简介:曲龙，男，主要从事作物品质遗传改良研究。E-mail: 1179199572@ qq． com
通讯作者:马启林，男，副教授，主要从事作物品质遗传改良研究。E-mail: hbhnqlm@ 163． com
文章编号: 1000-8551 ( 2015 ) 02-0209-06
水稻辐射诱变突变体的种子蛋白质成分分析
曲 龙1 卢夏茹1 李阳生2 韦双双1 袁潜华1 马启林1
( 1海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口 570228 ;
2武汉大学 /杂交水稻国家重点实验室，湖北 武汉 430072 )
摘 要:为了改良水稻品种的品质性状，利用60 Coγ-射线为诱变源，对粳稻品种 Koshihikari 种子进行了辐
照处理，通过改良的单粒种子法对种子蛋白质的含量和组成进行了 SDS-PAGE 和 Western Blotting 分析，
筛选到了 72 个种子蛋白突变体，结果表明经诱变后种子蛋白的含量和组成成分发生了很大变异。本研
究为揭示水稻贮藏蛋白积累机制及开发新型稻米种质提供了理论依据。
关键词:水稻; 辐射诱变; 种子蛋白; 突变体
DOI: 10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2015. 02． 0209
目前，水稻( Oryza sativa L． ) 超高产育种已进入新
阶段，超级稻大面积示范的产量已达到 900kg 以上。
随着城乡人民的生活水平不断提高，目前的稻米品质
已远不能满足城乡居民的要求，水稻生产的优质化、粳
型化成为发展趋势之一。培育优质水稻品种已成为水
稻育种工作的当务之急。
近年来，通过诱变技术在国内外不仅选育了不少
优质品种，而且在专用型、功能型稻米的选育上也取得
了较好的进展。如泰国的香稻 ＲD6 和 ＲDl5、越南的
VND95-20 等主要出口稻米品种，都是通过诱变技术培
育而来［1］。在我国通过诱变技术培育的新品种类型
众多，如适合加工用的辐 501［2］，含高抗性淀粉的早籼
稻浙辐 201［3］，低直链淀粉含量籼稻突变体［4 － 5］，蛋白
质含量或组成发生增减的 W0366、LGC 活、LGC 润
等［6 － 9］，富含 γ-氨基丁酸的巨胚稻［10 － 15］、以及富含植
酸、维生素 A 等功能成分的突变体等［16 － 17］。此外，糯
稻中的鄂荆糯 6 号、扬辐糯 4 号等也是通过辐射诱变
技术育成的［18 － 19］。随着酿造、糕点以及保健食品等
行业的迅速发展，市场对新类型稻米的需求量会逐年
上升，新类型稻米生产已成为粮食生产中不容忽视的
问题。
本文报道了利用60 Co γ-射线为诱变源处理粳稻品
种 Koshihikari 种子，通过单粒种子 SDS-PAGE 分析法
对 M2 单株的种子蛋白质的含量及组成成分进行了分
析，并经 M3 复选获得了一些种子蛋白质突变体，为揭
示水稻贮藏蛋白的积累机制和开发新类型稻米提供了
基础材料。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
Koshihikari 是日本推广面积最大的优良品种，
供试材料为 Koshihikari 经辐射诱变后获得的突变
体。
本试验利用60 Co γ-射线为诱变源，处理剂量为
250 Gy，被处理的 Koshihikari 种子质量为 600 g。处理
后的种子按常规方法育苗，于 25d 秧龄时，单本移栽大
田。待种子成熟后，每个突变体 M1 植株采收 1 个主
穗，对每个 M2 种子分别播种，25d 秧龄时单本移栽大
田。移栽后，从营养生长到生殖生长及成熟的全过程
中，每星期田间观察 1 次，筛选出与野生型相比表型发
生变化的 M2 株系，每个突变体视结实情况收 1 ～ 3 个
主穗。其后，继续种植 M3 以后种子，对突变体的性状
进行重复观察和鉴定。
1. 2 种子全蛋白质提取
参照 Takemoto 等［20］的方法通过建立改良的单粒
902
核 农 学 报 29 卷
种子法提取种子全蛋白。具体方法是 :取单粒种子，用
玻璃纸包好用小锤敲成粉末，称重后转入 1. 5 mL
Eppendorf 管( Eppendorf 公司产品，德国) 内，依据米粉
重量按 20mg·mL － 1提取液的比例加入全蛋白提取缓
冲液［125 mmol· L － 1 Tris-HCl ( pH 值 6. 8 ) ，内含
4 mol·L － 1尿素，4 % SDS，5% β-巯基乙醇］，剧烈涡旋
振荡数秒后放置过夜，于 4 ℃，14 000 r·min － 1下离心
10 min，转移上清液至新的 1. 5 mL Eppendorf 管内，
－ 20 ℃保存备用。
1. 3 种子全蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-
PAGE) 分析
采用 5% 的浓缩胶，15% 的分离胶系统。将提取
的种子蛋白上清液按 1 ∶ 1比例加入 2 × SDS 上样缓冲
液，沸水浴加热 5min，取 15 μL 全蛋白质提取液上样
进行 SDS-PAGE 分析，凝胶用考马斯亮蓝 G-250 染色。
用 Bandscan V5. 0 对染色凝胶中种子蛋白各组分的相
对含量进行测定。
1. 4 谷蛋白亚基的 Western blotting 分析
将 SDS-PAGE 分离后的凝胶通过湿式转膜法转移
到硝酸纤维膜上，经 5% BSA 封闭、一抗 ( 水稻谷蛋白
亚基多克隆抗体，委托北京华大蛋白质研发中心有限
公司制备 ) 孵育、二抗结合、AP-NBT /BICP 显色后，得
到谷蛋白亚基的免疫印迹图。
2 结果与分析
2. 1 突变体种子蛋白质含量的变化
采用单粒种子法对 11 021 个辐射诱变后代的种
子蛋白进行 SDS-PAGE 分析，用 Bandscan V5. 0 对染
色凝胶中种子蛋白各组分的相对含量进行分析，发现
部分辐射诱变后代的种子蛋白含量和组成成分发生了
明显变化，从中筛选出 72 个种子蛋白突变体材料，这
些突变体相对于其野生型的种子蛋白质含量见表 1。
由表 1 可知，突变体的种子蛋白质含量发生了显著变
化，有的突变体的种子蛋白质含量显著升高，有的突变
体的种子蛋白质含量明显降低。其中，突变体 8 的种
子蛋白质含量最高，达到野生型的 254% ; 突变体 16
的种子蛋白质含量最低，仅为野生型的 34%。由表 2
可知这些突变体的种子蛋白质含量变化的范围及分布
情况。绝大多数突变体( 49 个) 相较于野生型而言，全
蛋白含量表现出明显增加的趋势，全蛋白增加的突变
体占 68. 1%，其中蛋白质含量增加 60%以内的突变体
为主，达 36 个。少数突变体( 20 个 ) 的全蛋白含量较
野生型要明显减少，全蛋白减少的突变体占 27. 8%，
另有 3 个突变体的全蛋白含量与野生型相当，占
4. 2%。
表 1 突变体种子蛋白质的相对含量
Table 1 Ｒalative protein content in mutants
材料编号
No．
蛋白质含量
Protein content /%
材料编号
No．
蛋白质含量
Protein content /%
0 100 37 109
1 139 38 110
2 138 39 167
3 160 40 175
4 198 41 86
5 157 42 116
6 117 43 147
7 196 44 207
8 254 45 164
9 181 46 152
10 115 47 121
11 187 48 158
12 68 49 127
13 122 50 156
14 63 51 143
15 107 52 134
16 34 53 48
17 56 54 146
18 52 55 49
19 101 56 163
20 104 57 77
21 118 58 153
22 73 59 135
23 106 60 71
24 125 61 55
25 146 62 141
26 119 63 67
27 154 64 164
28 173 65 129
29 122 66 112
30 90 67 145
31 59 68 109
32 93 69 79
33 67 70 98
34 117 71 166
35 65 72 83
36 113
注:编号 0 为 Koshihikari 野生型;编号 1-72 为 Koshihikari 突变体。
Note: No． 0，‘Koshihikari’ wildtype， No． 1-72，‘Koshihikari’
mutants．
012
2 期 水稻辐射诱变突变体的种子蛋白质成分分析
表 2 突变体种子蛋白质含量的变化
Table 2 Change of total protein content in mutants
蛋白质含量变化
Changes of protein content /%
突变体个数
Number of mutants
蛋白质含量增加 6 ～ 20 13
Increase of protein content 21 ～ 40 10
41 ～ 60 13
61 ～ 80 7
81 ～ 100 4
＞ 100 2
蛋白质含量不变
Constant of protein content
± 5 3
蛋白质含量减少 6 ～ 20 4
Decrease of protein content 21 ～ 40 9
＞ 41 7
注 : 泳道 0 为‘Koshihikari’野生型 ; 泳道 1 － 23 为‘Koshihikari’野生型。下同。
Note: Lane 0: ‘Koshihikari’wildtype，Lane 1 － 23: ‘Koshihikari’mutants． The same as following．
图 1 部分突变体种子蛋白的 SDS-PAGE 图谱
Fig． 1 Profiling of seed storage protein in rice mutants by SDS-PAGE
2. 2 突变体种子蛋白质组成成分的变化
除种子全蛋白含量的变化外，辐射诱变后代的种
子蛋白质组成也发生了变化，图 1 显示了部分诱变后
代的种子蛋白组成成分的变化。如图 1 所示，种子蛋
白组成成分出现比较复杂多样的变异，主要体现在
57kD 前体、57kD 以上大分子组分、谷蛋白 α-亚基、谷
蛋白 β-亚基、球蛋白、醇溶蛋白等主要组成成分，这些
主要组成分在不同突变体的全蛋白中所占的比例发生
很大差异，其中，突变体 2、3、4、11 的 57kD 前体积累明
显增加，而突变体 13、14、16 － 19 则很少积累谷蛋白前
体及其它大分子蛋白; 突变体 2、12 的谷蛋白两个亚基
的积累明显减少 ; 突变体 1、5、12 的球蛋白积累明显减
少 ;对醇溶蛋白而言，16kD 和 10kD 醇溶蛋白的变化最
为明显，突变体 1、6、10、12 中 16kD 醇溶蛋白的含量极
少或可能缺失 ; 突变体 4、7、8、11、13、19 中 10kD 醇溶
蛋白的含量则明显增加( 图 1 ) 。
2. 3 突变体种子蛋白质成分的免疫印迹分析
谷蛋白和醇溶蛋白是水稻种子贮藏蛋白中最重要
的成分，为了进一步了解种子蛋白突变体中谷蛋白和
醇溶蛋白组成成分的变化，本试验通过免疫印迹的方
法，利用谷蛋白和醇溶蛋白多克隆抗体对部分种子突
变体的谷蛋白亚基成分和醇溶蛋白组成进行了鉴定
( 图 2 ) 。利用人工合成的 GluA2 中的一段多肽制备的
多克隆抗体 GluA2 对谷蛋白 α-亚基进行免疫印迹的
结果显示，突变体 12 未检测到 GluA2 的信号，表明缺
失 GluA2 ; 利用 16kD 醇溶谷蛋白的多克隆抗体 prol-
16k 对 16kD 醇溶蛋白进行免疫印迹的结果显示，前面
提到的 16kD 醇溶蛋白含量表现为极少或可能缺失的
突变体 1、6、10、12 中，突变体 1、6 有微弱信号，表现为
16kD 醇溶谷蛋白含量减少，而突变体 10、12 未检测到
信号，表明缺失 16kD 醇溶谷蛋白。
3 讨论
3. 1 突变体种子蛋白组成变化的特点与遗传特征
本文采用单粒种子法对 11 021 个辐射诱变后代
的种子蛋白进行 SDS-PAGE 分析，发现种子蛋白含量
及组成成分发生了变化的突变体有 72 个，经多代鉴定
表明，这些经辐射诱导的种子蛋白质组成的变化，在下
一代仍然可以表现出来，是可以稳定遗传的变异。水
112
核 农 学 报 29 卷
图 2 种子蛋白突变体中蛋白成分变化的免疫印迹分析
Fig． 2 Western blotting analysis of component
of seed protein in rice mutants
稻种子蛋白根据其溶解性可以分为 4 部分，即水溶性
清蛋白、盐溶性球蛋白、醇溶性醇溶蛋白和溶于稀酸或
稀碱的谷蛋白。稻米中谷蛋白占总蛋白含量的 80%
以上，因此，稻米营养品质的优劣实际上取决于谷蛋白
的含量和组成。前人研究显示，水稻谷蛋白基因的原
始翻译产物是一类分子量约为 57kD 的前原蛋白，被
转运到蛋白质体 II( PB-II) 中，在此经翻译后加工裂解
成分子量分别为 37 ～ 39kD ( 酸性亚基) 和 22 ～ 23kD
( 碱性亚基) 的 2 个亚基［21 － 22］。Zheng 等［23］把已经发
现的谷蛋白突变体大致划分为低谷蛋白、57kD 谷蛋白
前体升高( 57H ) 及高谷蛋白 3 种突变类型，这些类型
也都存在于本研究发现的突变体中。Takemoto 等［20］
发现，突变体 esp2 会大量积累 57kD 的前原蛋白，原因
是体内缺少蛋白质二硫键异构酶 ( protein disulfide
isomerase，PDI) 。本研究也筛选到 57kD 前原蛋白积
累明显增加的突变体，其增加的机理是否一致有待进
一步研究。除了 57kD 前原蛋白的积累明显增加以
外，57kD 以上大分子蛋白积累也明显增加，这是由于
谷蛋白分子之间发生聚合形成了谷蛋白聚合体所致，
而这种聚合体的形成预计与稻米品质密切相关［24］。
根据谷蛋白氨基酸序列的同源性，可将其分为 A
和 B 2 个亚家族，简称为 GluA 和 GluB［21］。GluB 被认
为在营养价值上要优于 GluA，因为 GluB 中作为第一
限制性氨基酸的赖氨酸的含量较高［25］。因而可通过
降低 GluA 的含量或增加 GluB 的含量提高稻米的营
养品质。事实上，LGC1 ( GluB 基因的表达因受 ＲNA
干涉而显著降低的突变体) 中蛋白质的赖氨酸含量减
少了 17%［26］，说明谷蛋白的亚基组成对水稻的营养
价值十分重要。本研究也筛选到包括 GluA 缺失在内
的多种类型种子蛋白变异的突变体，将进一步研究其
在稻米品质形成的理论及品质改良实践中的价
值。
3. 2 水稻种子蛋白质辐射诱变育种的特点
利用 γ-射 线 辐 照 诱 变 的 方 法 对 粳 稻 品 种
Koshihikari 进行处理，获得了大量不同性状的突变体，
构建成突变体库。这些突变体的突变性状涉及到几乎
所有重要性状，如叶、穗、花、籽粒等器官形状、生育期、
株型结构、开花时间、育性、结实率、抗性、产量潜力与
营养品质等，为研究这些变异性状所涉及的基因的功
能与调控机制提供了丰富的研究材料。
有报道认为，辐射诱变与其它诱变技术 ( 如空间
诱变) 创造的后代一样，在某些性状 ( 垩白、胶稠度 ) 的
诱导上表现正向变异，而在另一些性状 ( 如直链淀粉
含量) 上则以负向变异为主［27］。本试验发现辐射诱导
的种子蛋白突变体绝大多数 ( 68. 1% ) 表现为蛋白质
含量增加，这是否说明辐照有利于创造高蛋白含量品
种，有待于更多的试验来进行验证。
稻米蛋白质品质一般受主效基因加微效基因控
制。对主效基因为主控制的品质性状，可采用诱发点
突变或易位突变的方法加以改良，对微效基因为主控
制的品质性状可采用多次重复诱变，定向选择的方法
积累有关品质性状的增效基因。如可以对 GluA2 缺失
突变体再进行诱变处理，筛选谷蛋白其它 GluA 基因也
缺失的突变体，为进一步研究种子蛋白积累调控机理，
进行蛋白质成分改良奠定基础。
4 结论
辐照处理水稻种子可以诱导种子蛋白发生可遗传
的变 异。利用60 Coγ-射线 为 诱变源，对 粳 稻品种
Koshihikari 种子进行辐照处理的后代中，筛选到了 72
个种子蛋白突变体，这些突变体的蛋白质含量及组成
成分发生了显著变化，主要体现在 57kD 前体、57kD 以
上大分子组分、谷蛋白 α-亚基、醇溶蛋白等主要组成
成分在不同突变体的全蛋白中所占的比例发生明显的
差异，部分突变体出现谷蛋白或醇溶蛋白亚基缺失的
现象。这些突变体材料可为揭示水稻贮藏蛋白积累机
制和改良稻米营养品质提供理论基础。
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Composition Analysis of Seed Protein in Ｒice Mutants
Induced by 60Co γ-Ｒay
QU Long1 LU Xiaru1 LI Yangsheng2 WEI Shuangshuang1 YUAN Qianhua1 MA Qilin1
( 1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Ｒesources，Ministry of Education，
Haikou，Hainan 570228 ; 2 State Key Laboratory of Hybrid Ｒice /Wuhan University，Wuhan，Hubei 430072 )
Abstract: In order to improve the quality traits of rice varieties，a variety‘Koshihikari’，was radiated by60 Co γ-ray to
induce mutagenesis． Seventy two mutants of seed storage protein were found through analyzing the content and
composition of seed storage protein by SDS-PAGE and western blotting． These mutants reveal rich variations on content
and composition of seed protein，and can be used as basis materials to reveal the mechanism of rice storage protein
accumulation，and to development new types of rice varieties．
Keywords: Oryza sativa L．，radiation mutagenesis，seed storage protein，mutants
412