全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员缘袁圆怨渊员园冤院员愿怨猿 耀 员怨园园允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员源鄄园愿鄄园苑摇 接受日期院圆园员缘鄄园远鄄员远
基金项目院国家科技计划课题渊圆园员员粤粤员园园圆园怨 原 圆冤
作者简介院代小梅袁女袁助理研究员袁主要从事观赏植物分子育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 葬蚤造藻藻灶曾蚤葬燥皂藻蚤 岳 员圆远援 糟燥皂
通讯作者院孙振元袁男袁研究员袁主要从事观赏植物分子育种袁园林植物生理生态研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 泽怎灶扎赠岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员缘冤员园鄄员愿怨猿鄄园愿
多年生黑麦草愈伤组织诱导及柠檬酸对
其褐化的抑制效应
代小梅摇 孙振元摇 韩摇 蕾摇 巨关升
渊中国林业科学研究院林业研究所袁北京摇 员园园园怨员冤
摘摇 要院为了优化多年生黑麦草愈伤组织诱导培养条件袁以多年生黑麦草成熟种子为材料袁研究浸泡尧研
磨和接种方式等因素对愈伤组织诱导率和出愈时间的影响袁以及不同浓度的柠檬酸对其愈伤组织褐化
的抑制效果遥 结果显示袁浸泡 源愿澡处理有利于种子愈伤组织诱导袁随着浸泡时间延长袁愈伤组织诱导率
逐渐下降袁且出愈时间推迟遥 在浸泡 源愿澡处理下袁研磨处理的种子愈伤组织诱导率显著高于未研磨处理
的种子袁随机接种的种子愈伤组织诱导率显著高于机械接种的种子曰经研磨处理的种子以随机接种方式
接种于愈伤组织诱导培养基上袁培养 猿凿后即出现愈伤组织袁员源 耀 圆员凿后愈伤组织发生达到高峰期袁圆员 耀
猿园凿后胚性愈伤组织大量形成袁愈伤组织诱导率高达 怨园豫 遥 此外袁研究表明袁在愈伤组织的继代培养中袁
对愈伤组织褐化抑制效果较好的柠檬酸浓度是 圆皂早窑蕴 原员袁培养 圆 周的褐化率为 员缘豫 袁而随柠檬酸浓度升
高袁褐化率逐渐增加袁而未添加柠檬酸的愈伤褐化率为 缘园豫 遥 经试验观察发现圆皂早窑蕴 原员柠檬酸对愈伤组
织的增殖和分化再生无明显影响袁胚性愈伤组织分化率为 苑园豫 袁生根率 员园园豫 遥 本研究建立的多年生黑
麦草的高效再生体系袁不仅有利于其基因工程改造袁也为其愈伤组织再生体系研究奠定了科学基础遥
关键词院多年生黑麦草曰愈伤组织诱导曰柠檬酸曰褐化
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员缘郾 员园援 员愿怨猿
摇 摇 多年生黑麦草渊蕴燥造蚤怎皂 责藻则藻灶灶藻 蕴援 冤是我国南北方
广泛应用且适应性很强的冷季型禾本科牧草和草坪草
种袁主要分布于温带地区遥 其叶片光滑柔软尧色泽美
丽尧绿色期长袁成坪速度快袁抗病虫和分蘖能力强遥 近
年来有关利用基因工程培育和改良多年生黑麦草品种
的研究已有大量报道咱员 原 苑暂 遥 多年生黑麦草愈伤组织通
常作为农杆菌介导法和基因枪法转化的受体袁因此袁改
良多年生黑麦草愈伤组织培养条件和建立其高频再生
体系具有重要意义咱愿 原 怨暂 遥
低温浸泡处理种子能够促进种子发芽遥 在多年生
黑麦草组织培养过程中袁有关种子浸泡时间长短尧研磨
处理及接种方式对愈伤组织诱导率影响的报道甚少遥
此外袁外植体褐变是植物组织培养过程中影响组织培
养成功的关键因素咱员园暂 袁而在多年生黑麦草组织培养过
程中普遍存在愈伤组织褐化现象遥 褐化现象在植物组
织培养中普遍存在袁主要与植物材料的基因型和生理
状态尧取材时期尧培养基以及培养条件等有关咱员员暂 遥 植
物材料受伤后体内释放的酚类物质在酚氧化酶的作用
下被氧化成褐色醌类物质导致植物发生褐化现象遥 褐
化所产生的醌类物质对外植体材料产生毒害作用袁影
响外植体生长和分化袁严重时导致死亡遥 为了控制褐
化袁关于植物材料预处理尧调整培养基尧控制培养尧添加
防褐剂等多方面的研究已有大量报道袁其中在培养基
中添加防褐剂的研究和应用最多袁常用的主要防褐剂
有吸附醌类物质的吸附剂和防止酚类物质氧化的抗氧
化剂咱员圆 原 员怨暂 袁本研究选用柠檬酸作为防止酚类物质氧化
的抗氧化剂遥
本试验以多年生黑麦草成熟种子为外植体袁研究
浸泡尧研磨和接种方式等因素对愈伤组织诱导率和出
愈时间的影响袁试验以继代培养中愈伤组织的褐化控
制为目的袁通过在愈伤组织诱导培养基中添加不同浓
度的柠檬酸袁最终选择一种能够有效控制愈伤组织褐
猿怨愿员
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
化的柠檬酸浓度袁从而有效地解决多年生黑麦草愈伤
组织继代培养中的褐化问题袁以期为优化多年生黑麦
草组织培养体系奠定基础遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 试验材料
试验于 圆园员猿 年在中国林业科学研究院国家重点
开放实验室进行袁供试材料为多年生黑麦草高帽品种
成熟种子袁购自北京绿冠草业股份有限公司遥
员郾 圆摇 主要试剂及培养基配方
主要试剂如下院土温 圆园渊栽憎藻藻灶 原 圆园冤尧蔗糖尧琼脂
粉尧次氯酸钠溶液渊活性氯 跃 缘豫 冤均为北京化工厂生
产曰圆袁 源 原 二氯苯氧基乙酸 渊 圆袁 源 原 凿蚤糟澡造燥则燥责澡藻灶燥曾赠
葬糟藻贼蚤糟 葬糟蚤凿袁 圆袁 源 原 阅冤尧 远 原 苄氨基腺嘌呤 渊 远 原
月藻灶扎赠造葬皂蚤灶燥 责怎则蚤灶藻袁 远 原 月粤冤尧萘乙酸 渊员 原 晕葬责澡贼澡葬造藻灶藻
葬糟藻贼蚤糟 葬糟蚤凿袁 晕粤粤冤 等植物激素均购自北京化学试剂公
司渊孕则燥皂藻早葬冤遥
多年生黑麦草愈伤组织诱导及再生培养基配
方咱怨暂如下院
渊员冤愈伤组织诱导培养基院酝杂咱圆园暂培养基添加 远
皂早窑蕴 原员圆袁源 原 阅尧园郾 园圆缘 皂早窑蕴 原员远 原 月粤尧蔗糖 猿园 早窑蕴 原员尧
琼脂粉 远 早窑蕴 原员袁责匀值为 缘郾 愿曰
渊圆冤愈伤组织分化培养基院酝杂 培养基添加 圆郾 园
皂早窑蕴 原员远 原 月粤尧蔗糖 猿园 早窑蕴 原员尧琼脂粉 远 早窑蕴 原员袁责匀 值
为 缘郾 愿曰
渊猿冤生根培养基院员 辕 圆酝杂 培养基添加 园郾 缘 皂早窑蕴 原员
晕粤粤尧蔗糖 圆园 早窑蕴 原员尧琼脂粉 远 早窑蕴 原员袁责匀值为 缘郾 愿遥
员郾 猿摇 种子表面灭菌
称取适量成熟种子于 缘园皂蕴 离心管中袁加入次氯
酸钠溶液和 员 耀 圆 滴土温 圆园袁在磁力搅拌器上灭菌 员澡袁
以无菌水冲洗 猿 耀 缘 次咱圆员暂 遥
员郾 源摇 诱导愈伤组织前无菌材料的处理方法
员郾 源郾 员摇 浸泡处理摇 经过表面灭菌处理的多年生黑麦
草成熟种子加入 圆园皂蕴无菌水袁将种子置于 源益黑暗下
分别浸泡处理 源愿尧苑圆尧怨远澡袁每处理重复 猿 次遥 在 杂宰鄄
悦允鄄圆阅阅超净工作台渊上海合恒仪器设备有限公司冤内
以无菌水冲洗 圆 次袁然后以次氯酸钠溶液消毒 圆园皂蚤灶袁
无菌水冲洗 缘 耀 远 次后袁用无菌滤纸吸干多余水分备
用遥
员郾 源郾 圆摇 研磨处理摇 接种前袁分别将经过浸泡处理的种
子在无菌研钵中研磨损伤 员皂蚤灶渊简称研磨冤和不研磨袁
研磨程度以磨破种皮为宜袁每处理重复 猿 次袁接种样本
量为 远园 粒 辕皿遥
员郾 源郾 猿摇 接种方式摇 根据种子在培养基上的放置方式
不同袁经过研磨和未研磨的种子分别以随机接种和机
械接种方式接种于愈伤组织诱导培养基上遥 机械接
种院将种子种脐朝下袁按粒排列接种于培养基上遥 每皿
种子数为 远园 粒遥 随机接种院将一定数目的种子随机放
置于培养基上袁使种子呈自然分散状态咱圆圆暂 袁每皿种子
数为 远园 粒遥 每处理重复 猿 次遥 对不同处理方法培养
的材料进行编号渊表 员冤遥
表 员摇 多年生黑麦草高帽成熟种子各个处理下不同编号说明
栽葬遭造藻 员摇 阅蚤枣枣藻则藻灶贼 灶怎皂遭藻则 燥枣 责藻则藻灶灶蚤葬造 则赠藻早则葬泽泽 贼燥责澡葬贼 泽藻藻凿泽 怎灶凿藻则 藻葬糟澡 贼则藻葬贼皂藻灶贼
接种方式
栽则葬灶泽枣藻则则蚤灶早 憎葬赠泽
浸泡 源愿澡
杂燥葬噪蚤灶早 枣燥则 源愿澡
浸泡 苑圆澡
杂燥葬噪蚤灶早 枣燥则 苑圆澡
浸泡 怨远澡
杂燥葬噪蚤灶早 枣燥则 怨远澡
研磨 郧则蚤灶凿蚤灶早
贼则藻葬贼皂藻灶贼
未研磨 宰蚤贼澡燥怎贼
早则蚤灶凿蚤灶早
研磨 郧则蚤灶凿蚤灶早
贼则藻葬贼皂藻灶贼
未研磨 宰蚤贼澡燥怎贼
早则蚤灶凿蚤灶早
研磨 郧则蚤灶凿蚤灶早
贼则藻葬贼皂藻灶贼
未研磨 宰蚤贼澡燥怎贼
早则蚤灶凿蚤灶早
机械接种 郧圆员员 郧圆圆员 郧猿员员 郧猿圆员 郧源员员 郧源圆员
随机接种 郧圆员圆 郧圆圆圆 郧猿员圆 郧猿圆圆 郧源员圆 郧源圆圆
摇 摇 注院郧代表高帽遥
摇 摇 晕燥贼藻院郧 则藻责则藻泽藻灶贼泽 贼燥责澡葬贼援
员郾 缘摇 愈伤组织的诱导
将消毒后的种子分别接种于愈伤组织诱导培养基
上袁圆缘 益黑暗培养遥 每 圆 周更换 员 次新的培养基遥 成
熟种子在愈伤组织诱导培养基上培养若干天后袁大部
分种子开始长芽和根袁待芽基部出现白色的愈伤组织
小块后袁及时剪去芽和根袁以免培养基养分流失过快袁
促进愈伤组织小块的生长咱怨暂 遥 接种 圆员凿 后开始对诱
导出的愈伤组织进行继代培养袁每 圆 周更换 员 次新的
培养基袁愈伤组织继代培养基同诱导培养基遥 分别在
培养 猿尧缘尧苑尧员源尧圆员尧圆愿尧猿缘凿后统计愈伤组织诱导率遥
员郾 远摇 防褐剂的添加
胚性愈伤组织继代培养若干次后袁逐渐出现褐化
源怨愿员
摇 员园 期 多年生黑麦草愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应
现象遥 在培养基中添加防褐剂可缓解此现象遥 试验选
取的防褐剂为柠檬酸渊糟贼则蚤糟 葬糟蚤凿冤袁设置 缘 个浓度袁将不
添加任何防褐剂的对照组浓度设为 园袁共 远 组渊表 圆冤袁
每组处理接种 源园 个外植体遥 分别记录观察柠檬酸处
理 苑凿和 员源凿后的褐化率以及在培养基中添加柠檬酸
对愈伤组织生长的影响遥
表 圆摇 柠檬酸浓度及添加量
栽葬遭造藻 圆摇 栽澡藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 葬灶凿 葬凿凿蚤贼蚤燥灶 凿燥泽葬早藻
燥枣 糟蚤贼则蚤糟 葬糟蚤凿
处理号
晕怎皂遭藻则
柠檬酸浓度
悦燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 糟蚤贼则蚤糟 葬糟蚤凿 辕 渊皂早窑蕴 原员 冤
员 园
圆 圆
猿 源
源 远
缘 愿
远 员园
员郾 苑摇 愈伤组织的分化和再生
挑选生长良好尧紧密尧黄色颗粒状胚性愈伤组
织咱圆猿 原 圆源暂 袁接种于分化培养基袁置于组培室培养架上袁
员远澡 辕 愿澡渊光照 辕黑暗冤袁光强 圆 园园园造曾袁温度 圆缘益遥 待出
芽后袁转于生根培养基上进行生根培养遥 生根后袁将小
植株转接于生根培养基上进行培养遥 待小植株长大袁
将无菌苗开盖练苗 猿凿袁移苗至装有等量基质渊营养土颐
草炭颐蛭石 越员颐 员颐 员冤的 员员糟皂直径花盆中袁置于 匀孕郧 原
圆愿园月光照培养箱渊东联哈尔仪器制造有限公司袁北
京冤生长 圆 个月袁员远澡 辕 愿澡渊光照 辕黑暗冤袁光强 圆 园园园造曾袁温
度 猿圆益 辕 圆圆益渊光照 辕黑暗冤袁相对湿度 远远豫 遥
员郾 愿摇 数据处理
对多年生黑麦草种子愈伤组织诱导率尧褐化率尧分
化率尧生根率进行统计遥 愈伤组织诱导率 越出愈数 辕接
种外植体数 伊 员园园豫 曰愈伤组织褐化率 越愈伤组织褐化
数 辕总愈伤组织数 伊 员园园豫 渊愈伤组织出现褐化现象即
计入褐化个数冤曰愈伤组织分化率 越有芽形成的愈伤
组织数 辕接种的愈伤组织总数 伊 员园园豫 曰生根率 越有根
形成的不定芽 辕接种的不定芽总数 伊员园园豫 遥 所得数据
进行方差分析袁采用 阅怎灶糟葬灶法对愈伤组织诱导率进行
多重比较遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 浸泡尧研磨处理及接种方式对多年生黑麦草种愈
伤组织诱导率的影响
经过处理的外植体接种诱导培养 猿凿后袁少数种子
基部出现胚芽袁少数经过研磨处理的种子基部出愈而
未出芽遥 培养 缘 耀 员园凿袁多数种子出芽渊图 员冤遥 培养
员源凿后袁多数种子诱导出非胚性愈伤组织曰出芽后的大
部分种子出愈渊图 圆冤袁此时分别拔掉和剪断新长出来
的芽和根袁以免培养基养分流失过快遥 培养 圆员凿后袁将
已经诱导出非胚性愈伤组织的种子进行第 员 次继代袁
培养于新的愈伤组织诱导培养基上渊图 猿 原 粤冤曰剩余
未出愈的种子继续培养观察袁避免污染遥 培养 员 个月袁
即非胚性愈伤组织第 员 次继代培养 员园凿 后袁非胚性愈
伤组织中出现部分胚性愈伤组织渊图 猿 原 悦冤袁培养 猿缘凿
后于新的培养基上进行第 圆 次继代渊图 猿 原 月冤遥 第 圆
次继代培养的胚性愈伤组织在新的培养基上生长 圆 周
后袁同一克隆的胚性愈伤组织生长增殖 圆 耀 猿 倍渊图 猿
原 阅冤袁每 圆 周换新的培养基继代 员 次遥
分别在培养 猿尧缘尧苑尧员源尧圆员尧圆愿尧猿缘凿 后统计愈伤组
织诱导率渊表 猿冤遥 随着诱导时间变长袁种子愈伤组织
诱导率逐渐增加遥 浸泡 源愿澡 处理下袁研磨处理的种子
愈伤组织培养 猿尧缘尧苑尧员源尧圆员凿后袁彼此的诱导率差异极
显著袁愈伤组织诱导率最高达到 怨园豫 袁而未研磨处理
的种子愈伤组织培养 缘尧苑尧员源尧圆员凿后袁彼此之间诱导率
差异极显著袁愈伤组织诱导率最高 苑园豫 曰浸泡 苑圆澡 处
理下袁研磨处理的种子愈伤组织培养 缘尧苑尧员源尧圆员凿 后袁
诱导率差异极显著袁愈伤组织诱导率最高 源员郾 远苑豫 袁而
未研磨处理的种子愈伤组织培养 苑尧员源尧圆员凿后袁彼此之
间诱导率差异极显著袁愈伤组织诱导率最高 猿猿郾 猿猿豫 曰
浸泡 怨远澡处理下袁愈伤组织诱导率最高仅 员远郾 远苑豫 袁研
磨损伤处理的种子愈伤组织在培养 苑 和 员源凿 后袁彼此
之间诱导率差异极显著袁而未研磨处理的种子愈伤组
织培养 员源凿 和 圆员凿 后袁彼此之间诱导率差异极显著遥
由图 源 可知袁在研磨条件下袁分别培养 缘尧苑尧员源尧圆员尧圆愿尧
猿缘凿后袁浸泡 源愿尧苑圆尧怨远澡 处理所得到的种子愈伤组织
诱导率彼此之间差异极显著袁结果表明袁浸泡 源愿澡处理
有利于种子愈伤组织诱导袁而随着浸泡时间的延长袁种
子愈伤组织诱导率逐渐降低袁且出愈时间逐渐往后推
迟遥 根据上述结果袁之后的研究均在种子浸泡 源愿澡 处
理条件下进行遥 由图 缘 可知袁在种子浸泡 源愿澡条件下袁
种子愈伤组织培养 缘尧苑尧员源尧圆员尧圆愿尧猿缘凿后袁研磨处理与
未研磨处理所得到的种子愈伤组织诱导率差异极显
著袁结果表明袁研磨处理更有利于种子愈伤组织诱导遥
由图 远 可知袁在种子浸泡 源愿澡和研磨处理条件下袁种子
愈伤组织分别培养 苑尧员源尧圆员尧圆愿尧猿缘凿后袁采用随机接种
与机械接种方式所得到的种子愈伤组织诱导率差异极
显著袁结果表明袁随机接种方式更有利于种子愈伤组织
诱导遥 综上袁种子浸泡 源愿澡条件下袁经过研磨后以随机
缘怨愿员
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
摇 摇 摇 摇 表 猿摇 各处理下不同时间多年生黑麦草种愈伤组织诱导率的变化
栽葬遭造藻 猿摇 栽澡藻 糟澡葬灶早藻 燥枣 糟葬造造怎泽 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣 孕藻则藻灶灶蚤葬造 则赠藻早则葬泽泽 泽藻藻凿泽 葬贼 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼蚤皂藻 怎灶凿藻则 藻葬糟澡 贼则藻葬贼皂藻灶贼 辕 豫
接种天数
陨灶燥糟怎造葬贼蚤燥灶 凿葬赠泽 辕 凿 郧圆员员 郧圆员圆 郧圆圆员 郧圆圆圆 郧猿员员 郧猿员圆 郧猿圆员 郧猿圆圆 郧源员员 郧源员圆 郧源圆员 郧源圆圆
猿 员郾 远苑 依员郾 猿远遭
缘郾 园园 依
员郾 猿远葬
园郾 园园 依
园郾 园园遭
员郾 远苑 依
员郾 猿远遭
员郾 远苑 依
园郾 园园遭
猿郾 猿猿 依
员郾 猿远遭
园郾 园园 依
园郾 园园遭
园郾 园园 依
园郾 园园遭
园郾 园园 依
园郾 园园遭
园郾 园园 依
园郾 园园遭
园郾 园园 依
园郾 园园遭
园郾 园园 依
园郾 园园遭
缘 员猿郾 猿猿 依员郾 猿远粤
员远郾 远苑 依
圆郾 苑圆粤
远郾 远苑 依
员郾 猿远月
员缘郾 园园 依
员郾 猿远粤
缘郾 园园 依
员郾 猿远月
愿郾 猿猿 依
员郾 猿远月
猿郾 猿猿 依
园郾 园园悦
缘郾 园园 依
员郾 猿远月
猿郾 猿猿 依
员郾 猿远悦
缘郾 园园 依
员郾 猿远月
员郾 远苑 依
园郾 园园悦
猿郾 猿猿 依
员郾 猿远悦
苑 圆缘郾 园园 依圆郾 苑圆月
猿猿郾 猿猿 依
员郾 猿远粤
员愿郾 猿猿 依
员郾 猿远悦
圆远郾 远苑 依
员郾 猿远月
员园郾 园园 依
员郾 猿远阅
员缘郾 园园 依
员郾 猿远悦
愿郾 猿猿 依
员郾 猿远阅
员园郾 园园 依
圆郾 苑圆阅
缘郾 园园 依
园郾 园园耘
员园郾 园园 依
员郾 猿远阅
猿郾 猿猿 依
员郾 猿远耘
愿郾 猿猿 依
园郾 园园阅
员源 源远郾 远苑 依源郾 园愿月
远远郾 远苑 依
圆郾 苑圆粤
猿缘郾 园园 依
员郾 猿远悦
缘园郾 园园 依
缘郾 远远月
圆园郾 园园 依
圆郾 苑圆阅
圆缘郾 园园 依
员郾 猿远阅
员猿郾 猿猿 依
员郾 猿远耘
员远郾 远苑 依
圆郾 苑圆耘
员园郾 园园 依
员郾 猿远云
员猿郾 猿猿 依
员郾 猿远耘
猿郾 猿猿 依
员郾 猿远云
员猿郾 猿猿 依
员郾 猿远耘
圆员 缘猿郾 猿猿 依圆郾 苑圆月
愿园郾 园园 依
源郾 园愿粤
源缘郾 园园 依
圆郾 苑圆悦
缘愿郾 猿猿 依
源郾 园愿月
猿猿郾 猿猿 依
圆郾 苑圆阅
源园郾 园园 依
源郾 园愿悦
圆园郾 园园 依
圆郾 苑圆耘
猿园郾 园园 依
园郾 园园阅
员员郾 远苑 依
员郾 猿远耘
员远郾 远苑 依
员郾 猿远耘
缘郾 园园 依
员郾 猿远云
员缘郾 园园 依
员郾 猿远耘
圆愿 缘远郾 远苑 依源郾 园愿悦
愿缘郾 园园 依
圆郾 园苑粤
缘园郾 园园 依
圆郾 苑圆悦
远远郾 远苑 依
圆郾 苑圆月
猿猿郾 猿猿 依
圆郾 苑圆耘
源员郾 远苑 依
圆郾 苑圆阅
圆缘郾 园园 依
圆郾 苑圆云
猿猿郾 猿猿 依
员郾 猿远耘
员员郾 远苑 依
员郾 猿远郧
员远郾 远苑 依
员郾 猿远郧
远郾 远苑 依
园郾 园园匀
员远郾 远苑 依
员郾 猿远郧
猿缘 远园郾 园园 依圆郾 苑圆悦
怨园郾 园园 依
圆郾 苑圆粤
缘猿郾 猿猿 依
员郾 猿远悦
苑园郾 园园 依
圆郾 苑圆月
猿猿郾 猿猿 依
圆郾 苑圆耘
源员郾 远苑 依
圆郾 苑圆阅
圆缘郾 园园 依
圆郾 苑圆云
猿猿郾 猿猿 依
员郾 猿远耘
员员郾 远苑 依
员郾 猿远郧
员远郾 远苑 依
员郾 猿远郧
愿郾 猿猿 依
员郾 猿远匀
员远郾 远苑 依
员郾 猿远郧
摇 摇 注院利用 阅怎灶糟葬灶法进行多重比较遥 不同大写字母表示组间差异极显著渊孕 约 园郾 园员冤袁不同小写字母表示组间差异显著渊孕 约 园郾 园缘冤遥 下同遥
晕燥贼藻院 哉泽蚤灶早 阅怎灶糟葬灶 皂怎造贼蚤责造藻 糟燥皂责葬则蚤泽燥灶援 阅蚤枣枣藻则藻灶贼 糟葬责蚤贼葬造 造藻贼贼藻则泽 皂藻葬灶 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 葬贼 园郾 园员 造藻增藻造袁 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 造燥憎藻则糟葬泽藻 造藻贼贼藻则泽 皂藻葬灶 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼
凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻泽 葬贼 园郾 园缘 造藻增藻造援 栽澡藻 泽葬皂藻 葬泽 枣燥造造燥憎蚤灶早援
图 员摇 多年生黑麦草随机接种培养 猿凿后种子的出芽情况
云蚤早援 员摇 杂责则燥怎贼蚤灶早 泽藻藻凿泽 燥枣 孕藻则藻灶灶蚤葬造 则赠藻早则葬泽泽 葬枣贼藻则 则葬灶凿燥皂造赠 蚤灶燥糟怎造葬贼藻凿 葬灶凿 糟怎造贼怎则藻 枣燥则 猿 凿葬赠泽
接种方式接种袁有利于多年生黑麦草愈伤组织诱导遥
圆郾 圆摇 不同浓度柠檬酸对愈伤组织褐化的抑制效应
外植体接种后在愈伤组织诱导培养基上诱导培养
员 个月左右袁胚性愈伤组织形成袁在新的培养基上每生
长 圆 周更换新的培养基继代 员 次遥 在胚性愈伤组织形
成后第 猿 耀 缘 次继代培养过程中袁逐渐开始出现愈伤组
织褐化现象渊图 苑 原 粤冤遥 选择继代 猿 次生长良好的胚
性愈伤组织袁分为 远 组袁在培养基中添加不同浓度的柠
檬酸分别培养 员 周和 圆 周遥 由褐化个数统计结果渊表
源冤可知袁不同浓度的柠檬酸对愈伤组织褐化现象的抑
制程度不同袁愈伤组织褐化程度最轻的是 圆皂早窑蕴 原员柠
檬酸处理袁培养 员 周和 圆 周的褐化率分别为 苑郾 缘豫和
员缘豫 袁培养过程中愈伤组织增殖生长未受明显影响曰愈
伤组织褐化程度较为严重的是 员园 皂早窑蕴 原员柠檬酸处
理袁培养 员 周和 圆 周的褐化率分别为 圆园豫和 源园豫 曰而
对照组褐化现象最为严重袁培养 员 周和 圆 周的褐化率
分别为 圆缘豫和 缘园豫 袁其生长缓慢甚至趋于死亡遥
远怨愿员
摇 员园 期 多年生黑麦草愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应
图 圆摇 多年生黑麦草随机接种培养 员源凿后种子出愈情况
云蚤早援 圆摇 陨灶凿怎糟藻凿 糟葬造造怎泽 燥枣 孕藻则藻灶灶蚤葬造 则赠藻早则葬泽泽 泽藻藻凿泽 葬枣贼藻则 则葬灶凿燥皂造赠 蚤灶燥糟怎造葬贼藻凿 葬灶凿 糟怎造贼怎则藻 枣燥则 员源 凿葬赠泽
注院 粤袁 接种 圆员凿后第 员次继代培养非胚性愈伤组织曰 月袁 接种 猿缘凿
后第 圆次继代培养胚性愈伤组织曰 悦袁第 员次继代培养 员园凿后袁部分
摇 胚性愈伤组织形成曰 阅袁 同一克隆胚性愈伤组织生长增殖遥
晕燥贼藻院 粤袁 栽澡藻 枣蚤则泽贼 泽怎遭糟怎造贼怎则藻 燥枣 灶燥灶鄄藻皂遭则赠燥早藻灶蚤糟 糟葬造造怎泽 葬枣贼藻则 糟怎造贼怎则藻
枣燥则 圆员 凿葬赠泽援 月袁 栽澡藻 泽藻糟燥灶凿 泽怎遭糟怎造贼怎则藻 燥枣 藻皂遭则赠燥早藻灶蚤糟 糟葬造造怎泽 葬枣贼藻则
糟怎造贼怎则藻 枣燥则 猿缘 凿葬赠泽援 悦袁 栽澡藻 责葬则贼 藻皂遭则赠燥早藻灶蚤糟 糟葬造造怎泽 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 葬枣贼藻则 贼澡藻
枣蚤则泽贼 泽怎遭糟怎造贼怎则藻 燥枣 灶燥灶鄄藻皂遭则赠燥早藻灶蚤糟 糟葬造造怎泽 枣燥则 员园 凿葬赠泽援 阅袁 栽澡藻
摇 摇 摇 摇 责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 泽葬皂藻 糟造燥灶藻 藻皂遭则赠燥 糟葬造造怎泽援
图 猿摇 胚性愈伤组织的继代培养与增殖
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圆郾 猿摇 愈伤组织的分化与生根培养
经观察发现 圆 皂早窑蕴 原员柠檬酸对愈伤组织的增殖
和分化再生无明显影响遥 光照下将胚性愈伤组织进行
分化培养 员 周有绿色芽点出现袁培养 圆 周子叶形成袁第
猿 周转入生根培养基袁进行生根培养渊图 愿冤遥 胚性愈
伤组织分化率为 苑园豫 袁生根率 员园园豫 遥
图 源摇 研磨处理下浸泡时间对愈伤组织诱导率的影响
云蚤早援 源摇 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 泽燥葬噪蚤灶早 贼蚤皂藻 燥灶 贼澡藻 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶
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图 缘摇 源愿澡浸泡处理下研磨处理对愈伤
组织诱导率的影响
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苑怨愿员
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
图 远摇 源愿澡浸泡和研磨处理下接种方式
对愈伤组织诱导率的影响
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注院粤 愈伤组织褐化现象曰月 柠檬酸处理后的愈伤组织生长状况遥
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图 苑摇 柠檬酸对高帽愈伤组织褐化现象的抑制效应
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图 愿摇 高帽愈伤组织分化与再生
云蚤早援 愿摇 阅蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶 葬灶凿 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 栽燥责澡葬贼 糟葬造造怎泽
猿摇 讨论
刘雅丽等咱圆圆暂 尧方文娟等咱圆源暂的研究中袁浸泡处理后
的日本结缕草成熟种子愈伤组织诱导率均得到提高遥
本研究中未经处理的多年生黑麦草高帽种子在正常生
长状态下的平均发芽率为 苑苑豫 袁而浸泡 圆凿 后的种子
平均发芽率达到 怨缘豫 遥 随着浸泡时间再延长袁种子因
呼吸受阻而生活力下降袁愈伤组织诱导率也相应大大
下降遥
通过研磨处理多年生黑麦草成熟种子提高愈伤组
织诱导率是本研究的创新点之一遥 本研究在浸泡 源愿澡
处理下袁研磨处理的种子愈伤组织诱导率显著高于未
研磨处理的种子袁这种方式打破了用解剖刀割破种胚
以促进愈伤组织诱导的常规方法遥 这与刘雅丽等咱圆圆暂
提出的日本结缕草成熟种子经过研磨处理后的愈伤组
织诱导率得到提高研究结果具有相似性袁可能是由于
研磨处理造成种子表层轻度破裂袁不仅打破了种子休
眠袁而且激发种子活性袁提高种子的发芽率和愈伤组织
诱导率遥 试验过程中研磨处理时应以种子种皮磨损为
宜遥 研磨程度过重会导致种子内部受损破坏种子生活
力袁而研磨程度过轻袁种皮层并没有受到破坏袁种子发
芽率和出愈率也不高遥
试验发现继代时间过短或过长都不利于成熟种子
和下胚轴愈伤组织的分化遥 随着继代培养时间的延
长袁愈伤组织的颜色逐渐变黄袁且结构致密袁干燥易碎遥
但是后期愈伤组织出现不同程度的褐化现象袁而愈伤
组织的分化率也随着继代时间的增加呈先上升后大幅
下降的趋势遥 这说明愈伤组织继代时间的长短对愈伤
组织的再生有着重要的影响袁继代天数过长不利于愈
伤组织的生长袁这与杨茹等咱源暂提出的禾本科草的愈伤
组织再生率随着继代培养时间的延长而降低的结论相
一致遥
此外袁周玉珍等咱员圆暂 尧刘真华等咱员远暂 尧张淑红等咱员愿暂 尧何
松林等咱员怨暂的研究中袁在培养基中添加一定浓度的柠檬
酸等防褐剂袁能够在一定程度上缓解愈伤组织褐化现
象遥 本研究结果表明袁以柠檬酸为防褐剂添加在愈伤
组织生长培养基中袁同样能够有效的抑制外植体的褐
化现象遥 经观察发现袁柠檬酸处理后袁愈伤组织褐化率
降低的同时袁其生长增殖情况未见明显影响袁因此添加
适当浓度的柠檬酸可有效抑制多年生黑麦草愈伤组织
褐化遥 此外袁在组织培养过程中要从多方面预防外植
体发生褐变袁首先尽量减小外植体受伤害程度袁同时保
证外植体在空气中暴露的时间不可过长袁其次要选择
愿怨愿员
摇 员园 期 多年生黑麦草愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应
适当的培养基并及时转移袁培养的时间不可过长等遥
源摇 结论
低温浸泡时间的长短尧研磨处理或未研磨处理尧随
机接种或机械接种方式对多年生黑麦草品种高帽的成
熟种子的愈伤组织诱导率及出愈时间有着不同程度的
影响袁浸泡时间越长越不利于愈伤组织诱导曰研磨处理
能够提高种子愈伤组织诱导率曰与机械接种相比袁随机
接种方式更有利于种子愈伤组织诱导遥 成熟种子在低
温浸泡 源愿澡后袁经过研磨袁以随机接种方式接种袁愈伤
组织诱导率最高达到 怨园豫 遥 此外袁在愈伤组织的继代
培养中添加不同浓度的柠檬酸对继代培养中的愈伤组
织褐化和生长状况产生不同程度的影响袁圆皂早窑蕴 原员柠
檬酸的培养基上愈伤组织褐化率最低袁随着柠檬酸浓
度增加褐化率呈上升趋势袁而未添加柠檬酸的培养基
上愈伤组织的褐化现象最为严重遥 因此在愈伤组织的
继代培养中对愈伤组织褐化抑制效果较好的柠檬酸浓
度是 圆皂早窑蕴 原员袁从而有效解决了愈伤组织继代培养中
的褐化问题遥
参考文献院
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原 苑猿
咱 源 暂摇 杨茹袁袁庆华袁曹致中袁王锁民援 农杆菌介导多年生黑草遗传转
化体系的建立咱允暂 援 中国草地学报袁 圆园员园袁 猿圆渊员冤院 圆远 原 猿员
咱 缘 暂 摇 杨凤萍袁 梁荣奇袁 张立全袁 陈绪清袁 张晓东袁 王国英袁 孙振元援
抗逆调节转录因子 悦月云员 基因提高多年生黑麦草的抗旱能力
咱允暂 援 华北农学报袁 圆园园远袁 圆员渊员冤院员源 原 员愿
咱 远 暂摇 李雪袁 韩烈宝袁 陈季琴援 多年生黑麦草愈伤组织诱导与芽分化
的研究咱允暂 援草业科学援 圆园园缘袁 圆圆渊缘冤院源缘 原 源怨
咱 苑 暂摇 李雪袁 韩烈保袁 刘君援 多年生黑麦草转基育种及其安全性的研
究进展咱允暂 援 中国草地学报袁 圆园园愿袁 猿园渊源冤院 怨猿 原 怨怨
咱 愿 暂 摇 刘文真袁 玄松南袁 陈惠哲袁 朱睦元袁 孙宗修援 几种作用因子对多
年生黑麦草组织培养影响的研究咱允暂 援 林业科学研究袁 圆园园源袁 员苑
渊员冤院 怨缘 原 员园员
咱 怨 暂摇 曾升坚袁 卞建春袁 方钲袁 张冬霞袁 邹新海援 多年生黑麦草成熟种
子愈伤组织的诱导和植株再生研究咱 允暂 援 安徽农业科学袁 圆园园怨袁
猿苑渊猿缘冤院员苑猿源猿 原 员苑猿源缘袁 员苑猿远源
咱员园暂摇 刘庆昌袁 吴国良援 植物细胞组织培养咱酝暂援 北京院中国农业大学
出版社袁 圆园园猿
咱员员暂摇 杨雪袁 董立峰袁 付金峰袁 郑国勇袁王凤宝援 低酚酶活性选择对小
麦面粉褐变的影响咱允暂 援核农学报袁 圆园员源袁 圆愿渊缘冤院愿缘员 原 愿远园
咱员圆暂摇 周玉珍袁 张雨清援 金叶风箱果初代离体培养中影响外植体褐化
的因素咱允暂 援 植物生理学通讯袁 圆园园员袁 猿苑渊圆冤院员圆圆
咱员猿暂摇 董浩袁夏光利袁毕军袁朱国梁袁史桂芳援 玉米幼嫩叶片愈伤诱导及
分化过程优化的研究咱允暂 援核农学报袁圆园员猿袁圆苑渊怨冤院员圆缘猿 原 员圆缘苑
咱员源暂摇 李东杰袁 魏景芳袁 鲁绍伟袁 张进献袁 胡玉霞援 不同植物激素对冬
凌草愈伤组织增殖及褐化的影响咱允暂 援 水土保持研究袁 圆园园远袁 员猿
渊猿冤院员源怨 原 员缘园
咱员缘暂摇 李素娟袁樊秀霞袁王华袁邵健丰袁赵辉袁解芳袁钱前袁陶跃之援 水稻
不同品种组培再生和转基因频率研究咱 允暂 援 核农学报袁圆园员猿袁圆苑
渊员圆冤院员愿员苑 原 员愿圆苑
咱员远暂摇 刘真华袁 葛红袁 郭绍霞袁 刘洪涛袁 曹灿景袁 周玉杰袁 李秋香援 蝴
蝶兰组织培养中的褐化控制研究咱允暂 援 园艺学报袁 圆园园缘袁猿圆渊源冤院
苑猿圆 原 苑猿源
咱员苑暂摇 刘兰英援 薄壳香核桃组培中的褐化及防止措施研究咱允暂 援 园艺学
报袁 圆园园圆袁 圆怨渊圆冤院员苑员 原 员苑圆
咱员愿暂摇 张淑红袁 王蒂袁 王清援 影响马铃薯叶肉原生质体褐化的因素及
对其褐化和分裂的作用咱允暂 援 中国马铃薯袁 圆园园源袁 员愿渊圆冤院苑苑 原 愿员
咱员怨暂摇 何松林袁 陈笑蕾袁 陈莉袁 孔德政袁 任凝辉援 牡丹叶柄离体培养中
褐化防止的初步研究咱允暂 援 河南科学袁 圆园园缘袁 圆猿渊员冤院 源苑 原 缘园
咱圆园暂摇 酝怎则葬泽澡蚤早藻 栽袁 杂噪燥燥早 云援 粤则藻增蚤泽藻凿皂藻凿蚤怎皂 枣燥则 则葬责蚤凿 早则燥憎贼澡 葬灶凿
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员怨远圆袁 员缘渊猿冤院源苑猿 原 源怨苑
咱圆员暂摇 代小梅袁 孙振元袁 韩蕾援 草地早熟禾愈伤组织诱导及柠檬酸对
其褐化的抑制效应咱允暂 援 核农学报袁 圆园员缘袁 圆怨渊圆冤院圆苑园 原 圆苑苑
咱圆圆暂摇 刘雅丽袁 费永俊袁 曾会明援 影响日本结缕草成熟种子愈伤组织
诱导率和出愈时间的相关因子研究咱允暂 援 长江大学学报院自然科
学版袁 圆园员园袁 苑渊员冤院远猿 原 远远
咱圆猿暂摇 蕴藻藻 宰 蕴袁 悦澡葬灶 蕴 运援 耘泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼 燥枣 韵则贼澡燥则泽蚤责澡燥灶 泽贼葬皂蚤灶藻怎泽 糟藻造造
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悦怎造贼怎则藻袁 圆园园源袁 苑愿渊圆冤院 员园员 原 员园远
咱圆源暂摇 方文娟袁韩烈保袁 张振环袁曾会明援 草地早熟禾悬浮过程中体系
的建立及悬浮过程中细胞形态观察咱 允暂 援 生物技术通报袁 圆园园远袁
猿怨渊圆冤院愿缘 原 愿苑
咱圆缘暂摇 月葬蚤 再袁 匝怎 砸援 云葬糟贼燥则泽 蚤灶枣造怎藻糟蚤灶早 贼蚤泽泽怎藻 糟怎造怎贼怎则藻 则藻泽责燥灶泽藻泽 燥枣 皂葬贼怎则藻
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月则藻藻凿蚤灶早袁 圆园园员袁 员圆园渊圆冤院 圆猿怨 原 圆源圆
咱圆远暂摇 陈季琴袁 韩烈保援 正交设计在多年生黑麦草组织培养中的应用
咱允暂 援 中国草地袁 圆园园源袁 圆远渊员员冤院 缘苑 原 远圆袁 苑圆
咱圆苑暂摇 蕴蚤灶葬糟藻则燥 砸袁 灾葬扎择怎藻扎 粤 酝援 杂燥皂葬贼蚤糟 藻皂遭则赠燥早藻灶藻泽蚤泽 枣则燥皂 皂蚤皂葬贼怎则藻
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咱圆愿暂摇 杨茹袁袁庆华袁曹致中援 圆袁 源 原 阅和 远 原 月粤 对黑麦草不同外植体
愈伤组织诱导与分化的影响咱允暂 援 中国草地学报袁 圆园园愿袁 猿园渊源冤院
猿源 原 猿怨
怨怨愿员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
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园园怨员