全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊圆冤院园猿圆源 耀 园猿圆怨允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员员鄄园缘鄄园猿摇 接受日期院圆园员员鄄员员鄄园员
基金项目院国家自然科学基金项目渊猿员园苑员远园缘冤
作者简介院章栋梁渊员怨愿远鄄冤袁男袁安徽望江人袁硕士袁研究方向为食品微生物及生物技术遥 栽藻造院园圆缘鄄愿源猿怨缘缘苑圆曰耘鄄皂葬蚤造院扎凿造葬澡员员圆苑岳 员远猿郾 糟燥皂
通讯作者院陆兆新渊员怨缘苑鄄冤袁男袁江苏无锡人袁教授袁博士生导师袁研究方向为食品生物技术遥 栽藻造院园圆缘鄄愿源猿怨远源猿员曰耘鄄皂葬蚤造院 枣皂遭岳 灶躁葬怎援 藻凿怎援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园圆鄄园猿圆源鄄园远
响应面法优化重组枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶条件
章栋梁摇 钟摇 蔚摇 张摇 充摇 吕凤霞摇 别小妹摇 陆兆新
渊南京农业大学食品科技学院袁江苏 南京摇 圆员园园怨缘冤
摘摇 要院采用 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶设计法袁对影响重组枯草芽孢杆菌发酵产脂肪氧合酶的 苑 个相关因子进行
筛选袁并建立枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶的最佳工艺遥 结果表明对重组菌发酵产酶具有显著影响的因
子是乳糖尧发酵时间和发酵温度遥 依据 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 设计法的筛选结果袁进一步采用响应面中心组
合设计渊悦藻灶贼则葬造 悦燥皂责燥泽蚤贼藻 阅藻泽蚤早灶冤对显著影响因子的最佳水平和交互作用进行研究袁通过模型方程的 猿鄄
阅图和等高线图发现袁当乳糖浓度为 员远郾 怨早 辕 蕴尧发酵时间为 愿愿郾 源怨 澡尧发酵温度为 圆怨郾 苑员益和装液量为
远员郾 猿员皂造时袁出现酶活最大预测值 员远源郾 怨园 哉 辕 皂造袁验证试验证实了在上述条件下得出的酶活为 员远苑郾 猿圆哉 辕
皂造袁与预测值高度吻合遥 优化后的培养基和培养条件使得重组脂肪氧合酶产量较优化前提高了 圆郾 猿苑
倍遥
关键词院脂肪氧合酶曰 枯草芽孢杆菌曰 条件优化曰 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶设计曰 响应曲面法
韵孕栽陨酝陨在粤栽陨韵晕 韵云 悦韵晕阅陨栽陨韵晕杂 云韵砸 蕴陨孕韵载再郧耘晕粤杂耘 孕砸韵阅哉悦栽陨韵晕 云砸韵酝 砸耘悦韵酝月陨晕粤晕栽
月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 月再 砸耘杂孕韵晕杂耘 杂哉砸云粤悦耘 酝耘栽匀韵阅韵蕴韵郧再
在匀粤晕郧 阅燥灶早鄄造蚤葬灶早摇 在匀韵晕郧 宰藻蚤摇 在匀粤晕郧 悦澡燥灶早摇 蕴灾 云藻灶早鄄曾蚤葬摇 月陨耘 载蚤葬燥鄄皂藻蚤摇 蕴哉 在澡葬燥鄄曾蚤灶
渊悦燥造造藻早藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 晕葬灶躁蚤灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 晕葬灶躁蚤灶早袁 允蚤葬灶早泽怎摇 圆员园园怨缘冤
粤遭泽贼则葬糟贼院陨灶枣造怎藻灶糟藻泽 燥枣 泽藻增藻灶 则藻造葬贼藻凿 枣葬糟贼燥则泽 燥灶 责则燥凿怎糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣 造蚤责燥曾赠早藻灶葬泽藻 遭赠 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 憎藻则藻 泽贼怎凿蚤藻凿
遭赠 贼澡藻 皂藻贼澡燥凿 燥枣 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 凿藻泽蚤早灶援 粤泽 葬 则藻泽怎造贼袁 贼澡藻 造葬糟贼燥泽藻袁 枣藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 葬灶凿 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 憎藻则藻 枣燥怎灶凿 贼燥 遭藻
贼澡藻 皂燥泽贼 蚤皂责燥则贼葬灶贼 枣葬糟贼燥则泽援 酝藻葬灶憎澡蚤造藻袁 葬 贼澡则藻藻鄄造藻增藻造 枣燥怎则鄄枣葬糟贼燥则 糟藻灶贼则葬造 糟燥皂责燥泽蚤贼藻 凿藻泽蚤早灶 憎葬泽 葬责责造蚤藻凿 贼燥 燥责贼蚤皂蚤扎藻 贼澡藻
造藻增藻造泽 燥枣 贼澡藻 糟澡燥泽藻灶 增葬则蚤葬遭造藻泽 葬灶凿 贼澡藻蚤则 蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶援 月赠 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 猿鄄阅 责造燥贼泽 葬灶凿 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 责造燥贼泽袁 憎澡蚤造藻 贼澡藻
造葬糟贼燥泽藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 憎葬泽 员远郾 怨早 辕 蕴袁 枣藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 愿愿郾 源怨澡袁 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 圆怨郾 苑员益 葬灶凿 糟怎造贼怎则藻 增燥造怎皂藻 憎葬泽 远员郾 猿员皂造袁
藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 则藻葬糟澡藻凿 贼澡藻 皂葬曾蚤皂怎皂 增葬造怎藻 员远源郾 怨园哉 辕 皂造援 灾藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼泽 怎灶凿藻则 贼澡藻 葬遭燥增藻 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 早葬增藻 贼澡藻
藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣 员远苑郾 猿圆哉 辕 皂造袁 憎澡蚤糟澡 泽澡燥憎藻凿 澡蚤早澡 澡燥皂燥造燥早赠 憎蚤贼澡 责则藻凿蚤糟贼蚤增藻 增葬造怎藻援 栽澡藻 赠蚤藻造凿 燥枣 造蚤责燥曾赠早藻灶葬泽藻 憎葬泽 圆郾 猿苑
贼蚤皂藻泽 澡蚤早澡藻则 贼澡葬灶 遭藻枣燥则藻 蚤灶 贼澡藻 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 枣藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 造蚤责燥曾赠早藻灶葬泽藻曰 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽曰 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶 燥责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶曰 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 凿藻泽蚤早灶曰 则藻泽责燥灶泽藻 泽怎则枣葬糟藻
皂藻贼澡燥凿燥造燥早赠
摇 摇 脂肪氧合酶渊 蕴蚤责燥曾赠早藻灶葬泽藻袁耘悦员郾 员猿郾 员员郾 员圆 冤袁简
称脂氧酶袁属氧化还原酶袁可催化含顺鄄顺鄄员袁源 鄄戊二烯
结构的不饱和脂肪酸渊如亚油酸尧亚麻酸等冤及酯形成
氢过氧化物咱员袁圆暂 袁生成的不稳定氢过氧化物能氧化面
筋蛋白质形成二硫键袁使蛋白质分子聚合袁从而达到增
强面筋的作用咱猿暂 遥 脂氧酶还可以通过偶合反应破坏
类胡萝卜素的双键结构咱源暂 袁使面粉漂白袁兼具面粉强
筋和增白的功效袁可以减少或替代化学强筋剂溴酸钾
源圆猿
摇 圆 期 响应面法优化重组枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶条件
及化学漂白剂过氧化苯甲酰的使用袁降低其对人体健
康的危害遥 但由于目前脂氧酶主要从动植物组织中分
离获得袁产量低尧纯度不够是制约其大规模应用的主要
原因遥 对于脂氧酶的研究目前国内外学者主要集中在
其分离提取尧结构分析和酶学性质研究袁如 阅蚤藻造 等咱缘暂
采用硫酸铵沉淀尧热处理和柱层析等方法从大豆中分
离出脂氧酶的 圆 种同工酶 蕴鄄员 和 蕴鄄圆袁等电点分别为
缘郾 远 和 缘郾 愿袁分子量均约为 员园园噪阅袁结构分析表明每摩
尔酶蛋白分子中均含有 园郾 怨 摩尔的铁离子遥 杨文鸽
等咱远暂用羟基磷灰石柱层析法分离纯化南美白对虾血
淋巴脂肪氧合酶袁并对其催化亚油酸的动力学进行了
研究袁结果表明脂氧酶催化亚油酸的最适反应温度为
圆缘益袁最适 责匀 为 怨郾 远袁最适底物浓度为 园郾 圆缘皂皂燥造 辕 蕴袁
灾皂葬曾值为 员郾 远苑 伊 员园猿哉 辕 渊 皂早 蛋白窑皂蚤灶 冤袁 运皂 值为园郾 缘皂皂燥造 辕 蕴遥 但对于实现脂氧酶的高效生产和工业化
应用袁目前国内相关研究甚少遥 脂氧酶的异源表达和
重组菌发酵产酶条件优化目前国内外还未见相关报
道遥 南京农业大学食品科技学院酶工程研究室之前从
鱼腥藻 粤灶葬遭葬藻灶葬 泽责援 孕悦悦 苑员圆园 中克隆了脂肪氧合酶
基因并将其转化枯草芽孢杆菌 宰月愿园园袁成功实现了脂
氧酶的异源分泌表达咱苑暂 遥 本研究在此基础上对构建
的重组枯草芽孢杆菌进行发酵培养基组分和发酵条件
的优化袁采用 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 设计法从影响重组菌发
酵产脂氧酶的相关因素中筛选出显著影响因子袁通过
响应面中心组合设计法渊悦藻灶贼则葬造 悦燥皂责燥泽蚤贼藻 阅藻泽蚤早灶冤研
究显著影响因子的交互作用并确定各因子的最佳组
合袁以期寻找重组菌发酵产酶的最佳条件袁为其大规模
的生产提供一定的指导遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员摇 菌种 摇 重组枯草芽孢杆菌 责匀孕杂月砸鄄葬灶葬鄄蕴韵载
由南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏遥 该
菌是从鱼腥藻 粤灶葬遭葬藻灶葬 泽责援 孕悦悦 苑员圆园 菌株中克隆出
脂氧酶基因并成功转化枯草芽孢杆菌 宰月愿园园 构建而
成袁具有分泌表达脂氧酶的性能遥
员郾 员郾 圆摇 培养基摇 斜面活化培养基院蕴粤培养基渊胰蛋白
胨 员园早 辕 蕴尧酵母浸粉 缘早 辕 蕴尧晕葬悦造 员园早 辕 蕴尧琼脂 员愿 耀 圆园早 辕
蕴袁去离子水 员园园园皂造袁 责匀 值 苑郾 园 耀 苑郾 圆袁 员圆员益 灭菌
圆园皂蚤灶冤遥 使用时向培养基中添加经过滤除菌的氯霉
素和红霉素袁使 圆 种抗生素终浓度均为 员园滋早 辕 皂造遥
种子培养基和基础发酵培养基院 蕴月 培养基渊胰蛋
白胨 员园早 辕 蕴尧酵母浸粉 缘早 辕 蕴尧 晕葬悦造 员园早 辕 蕴袁去离子水
员园园园皂造袁责匀 苑郾 园 耀 苑郾 圆袁员圆员益灭菌 圆园皂蚤灶冤遥 使用时向
其中添加经过滤除菌的氯霉素和红霉素袁使 圆 种抗生
素终浓度均为 员园滋早 辕 皂造遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 菌种活化摇 将甘油管保藏菌渊 原 苑园益冤在 猿苑益
水浴中迅速解冻袁转接到 蕴粤 培养基平板上袁猿苑益恒温
培养袁待平板上长出单菌落后袁将单菌落转接至 蕴粤 新
鲜斜面培养基袁猿苑益恒温活化培养遥
员郾 圆郾 圆摇 摇瓶培养 摇 将斜面活化的菌株接入装有
员园园皂造 蕴月 培养基的 圆缘园皂造 三角瓶中袁猿苑益尧员愿园则 辕 皂蚤灶
摇床培养 圆源澡袁再将培养好的种子液按 圆郾 园豫接种量接
入装有 员园园皂造发酵培养基的 圆缘园皂造 三角瓶中袁在设定
的发酵条件下进行培养遥
员郾 圆郾 猿摇 脂氧酶的制备 摇 发酵液经 员园园园园则 辕 皂蚤灶 离心
缘皂蚤灶去菌体后即得到发酵粗酶液遥
员郾 圆郾 源摇 脂氧酶活力测定摇 脂氧酶活力测定参照蔡琨
的方法咱愿暂并根据本研究的实际情况稍加改进遥 猿皂造 反
应体系中含有 圆郾 苑愿皂造 酶反应缓冲液 渊 园郾 园源皂燥造 辕 蕴
责匀远郾 愿 磷酸缓冲液冤尧圆园园滋造 底物渊缘园皂造 底物中包含
圆苑滋造亚油酸袁圆缘滋造 吐温 圆园袁园郾 缘皂燥造 辕 蕴 晕葬韵匀 员郾 员皂造袁并
用脱氧蒸馏水定容至刻度冤和 圆园滋造 粗酶液袁混合均匀
后 猿缘益下测定其在 圆猿源灶皂处的吸光值变化遥
反应体系每分钟吸光值增加 园郾 园园园员 定义为 员 个
酶活力单位渊哉 辕 皂造冤遥
员郾 圆郾 缘摇 重组菌发酵产酶的单因素筛选 摇 在 蕴月 培养
基基础上考察碳源渊葡萄糖尧乳糖尧蔗糖尧麦芽糖尧果
糖尧淀粉和麸皮冤袁金属离子渊酝早圆 垣 尧悦葬圆 垣 尧在灶圆 垣 尧云藻圆 垣 尧
悦怎圆 垣 尧酝灶圆 垣 尧悦燥圆 垣 尧云藻猿 垣 冤袁培养基 责匀渊远尧远郾 缘尧苑尧苑郾 缘尧
愿冤袁装液量渊圆缘园皂造 三角瓶分别装 源园尧远园尧愿园尧员园园 和
员圆园皂造培养基冤和发酵温度渊圆园益尧圆缘益尧猿园益尧猿苑益冤及
发酵时间渊圆源尧猿远尧源愿尧远园尧苑圆尧愿源尧怨远尧员园愿 和 员圆园澡冤对重
组菌发酵产酶的影响遥 研究碳源影响时袁蕴月 培养基中
不添加氮源源及无机盐遥
员郾 圆郾 远摇 影响重组菌发酵产酶的关键因子筛选摇 以 蕴月
培养基为基础发酵培养基袁采用 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 设计
法对影响重组菌发酵产酶的 苑 个相关因素进行筛选
渊前期单因素试验结果显示 苑 个因素效果明显袁文章
未发表冤袁各因素及其代码尧编码水平见表 员袁其中 粤 耀
阅为培养基组分袁耘 耀 郧 为发酵条件袁响应值为酶活力
大小遥 试验设计尧数据分析和模型建立都采用 允酝孕 软
件渊灾藻则泽蚤燥灶 源郾 园郾 缘袁杂粤杂 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 陨灶糟援 冤遥
员郾 圆郾 苑摇 发酵条件的中心组合设计优化摇 采用响应面
中心组合设计渊悦藻灶贼则葬造 悦燥皂责燥泽蚤贼藻 阅藻泽蚤早灶袁 悦悦阅冤对重组
菌发酵产酶显著影响因子的浓度水平进一步优化遥 从
缘圆猿
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶试验结果中筛选出对重组菌发酵产酶
的显著影响因子袁结合因素的效应大小和试验中的实
际情况袁选择下步试验水平的中心点和各水平的步长遥
各因子及代码和水平见表 圆袁响应值为酶活力大小遥
借助试验设计及分析软件 阅藻泽蚤早灶鄄耘曾责藻则贼 渊 灾藻则泽蚤燥灶
远郾 园郾 缘袁 杂贼葬贼鄄耘葬泽藻 陨灶糟援 冤进行中心组合设计遥
表 员摇 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶设计试验因素水平及编码
栽葬遭造藻 员摇 蕴藻增藻造 葬灶凿 糟燥凿藻 燥枣 增葬则蚤葬遭造藻泽 枣燥则 孕造葬糟噪藻贼贼鄄
月怎则皂葬灶 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 凿藻泽蚤早灶
因子
枣葬糟贼燥则
代码
泽赠皂遭燥造
水平 造藻增藻造
原 员 员
乳糖 造葬糟贼燥泽藻渊早 辕 蕴冤 粤 员园 猿园
酝早悦造圆 渊皂皂燥造 辕 蕴冤 月 员 缘悦葬悦造圆 渊皂皂燥造 辕 蕴冤 悦 员 缘
初始 责匀 蚤灶蚤贼蚤葬造 责匀 阅 苑郾 缘 愿
装液量 增燥造怎皂藻 燥枣 皂藻凿蚤怎皂渊皂造冤 耘 缘园 远园
发酵温度 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻渊益冤 云 圆缘 猿园
发酵时间 贼蚤皂藻渊澡冤 郧 员员园 员源园
表 圆摇 响应面设计试验因素水平及编码
栽葬遭造藻 圆摇 蕴藻增藻造 葬灶凿 糟燥凿藻 燥枣 增葬则蚤葬遭造藻泽 枣燥则
砸藻泽责燥灶泽藻 杂怎则枣葬糟藻 酝藻贼澡燥凿燥造燥早赠
因子
枣葬糟贼燥则
代码
泽赠皂遭燥造
水平 造藻增藻造
原 员 园 员
乳糖 造葬糟贼燥泽藻 渊早 辕 蕴冤 粤 员园 圆园 猿园
装液量 增燥造怎皂藻 燥枣 皂藻凿蚤怎皂 渊皂造冤 耘 缘园 远园 苑园
发酵温度 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 渊益冤 云 圆愿 猿园 猿圆
发酵时间 贼蚤皂藻 渊澡冤 郧 苑圆 怨远 员圆园
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 重组菌发酵产酶的关键因子确定
不同碳源对影响重组菌发酵产酶存在很大的差
异袁其中乳糖对其产酶的促进作用最大袁使酶产量接近
怨园哉 辕 皂造袁而其他碳源促进作用不大遥 不同二价金属离
子对重组菌生长及发酵产酶影响各异袁其中 酝早圆 垣 尧
悦葬圆 垣对其产酶具有一定促进作用袁这可能与 圆 种离子
是大多数酶的辅因子有着一定的关系袁而其他金属离
子则抑制其产酶袁悦燥圆 垣甚至抑制重组菌的生长繁殖遥
责匀值影响结果显示 责匀苑郾 缘 左右有利于重组菌发酵产
酶袁酸性和碱性条件下均不利于菌体的正常生长遥 装
液量在 远园皂造时袁单因素试验结果最好袁过低或过高的
装液量均不适合重组菌发酵产酶遥 该重组菌在温度为
猿园益和发酵时间为 怨远澡 时最适合其发酵产酶袁酶活力
达到 员员源郾 苑圆哉 辕 皂造遥
孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶试验结果及其预测值见表 猿袁方
摇 摇 摇 摇 摇 摇表 猿摇 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶设计结果及预测值
栽葬遭造藻 猿摇 粤糟贼怎葬造 葬灶凿 责则藻凿蚤糟贼藻凿 增葬造怎藻泽 遭赠
孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 凿藻泽蚤早灶
试验
贼藻泽贼
代码
泽赠皂遭燥造
酶活力渊哉 辕 皂造冤
藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠
粤 月 悦 阅 耘 云 郧 试验值贼藻泽贼 增葬造怎藻
预测值
责则藻凿蚤糟贼蚤增藻 增葬造怎藻
员 员 员 员 员 员 员 员 苑园郾 园园 苑园郾 远源
圆 原 员 员 原 员 员 员 员 原 员 员苑猿郾 苑远 员远缘郾 苑远
猿 原 员 原 员 员 原 员 员 员 员 员员猿郾 苑远 员员怨郾 远愿
源 员 原 员 原 员 员 原 员 员 员 远猿郾 愿源 缘愿郾 员远
缘 原 员 员 原 员 原 员 员 原 员 员 员园员郾 远愿 员园猿郾 员圆
远 原 员 原 员 员 原 员 原 员 员 原 员 员远愿郾 员远 员远圆郾 圆源
苑 原 员 原 员 原 员 员 原 员 原 员 员 怨怨郾 远愿 员园缘郾 猿远
愿 员 原 员 原 员 原 员 员 原 员 原 员 苑愿郾 愿愿 苑圆郾 源
怨 员 员 原 员 原 员 原 员 员 原 员 愿缘郾 源源 怨愿郾 源愿
员园 员 员 员 原 员 原 员 原 员 员 缘愿郾 缘远 缘园郾 缘远
员员 原 员 员 员 员 原 员 原 员 原 员 员缘怨郾 缘圆 员远园郾 源
员圆 员 原 员 员 员 员 原 员 原 员 愿园郾 远源 愿苑郾 员圆
表 源摇 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶设计回归方程系数及其显著性检验
栽葬遭造藻 源摇 砸藻早则藻泽泽蚤燥灶 糟燥藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼泽 葬灶凿 贼澡藻蚤则
泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻 遭赠 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 凿藻泽蚤早灶
模型项
皂燥凿藻造
回归系数
糟燥藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼
标准误差
杂耘
贼比值
贼 则葬贼蚤燥
孕值
孕则燥遭 跃 渣 贼 渣
蚤灶贼藻则糟藻责贼 员园源郾 源怨猿猿 猿郾 圆怨员 猿员郾 苑缘 约 园援 园园园员鄢
粤 原猿员郾 远 猿郾 圆怨员 原 怨郾 远 园郾 园园园苑鄢
月 猿郾 远远远远远苑 猿郾 圆怨员 员郾 员员 园郾 猿圆苑苑
悦 猿郾 怨源远远远苑 猿郾 圆怨员 员郾 圆 园郾 圆怨远远
阅 猿郾 源员猿猿猿猿 猿郾 圆怨员 员郾 园源 园郾 猿缘愿圆
耘 原 员郾 猿苑猿猿猿 猿郾 圆怨员 原 园郾 源圆 园郾 远怨苑怨
云 愿 猿郾 圆怨员 圆郾 源猿 园郾 园猿员怨鄢
郧 原员怨郾 怨园远苑 猿郾 圆怨员 原 远郾 园缘 园郾 园园猿愿鄢
砸圆 越 园郾 怨苑员怨缘猿 砸圆粤凿躁 越 园郾 怨圆圆愿苑员
注院鄢表示该因子效应显著遥
晕燥贼藻院野鄢冶则藻枣藻则泽 贼燥 葬 枣葬糟贼燥则 憎蚤贼澡 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 藻枣枣藻糟贼援
差分析和各因素显著性检验结果见表 源遥 上述 苑 个因
子中对重组菌发酵产酶具有显著影响的因子为乳糖
渊孕 越园郾 园园园苑冤尧发酵温度渊孕 越 园郾 园猿员怨冤和发酵时间渊孕
越园郾 园园猿愿冤袁其中乳糖渊粤冤和发酵时间渊郧冤为负效应渊 贼
值均为负袁贼值为正代表因素在高水平时响应值越大袁
反之亦然咱怨暂 冤袁说明二者在水平下限时更有利于重组
菌产酶袁这与前期单因素试验中乳糖浓度在 员园早 辕 蕴尧发
酵时间为 怨远澡产酶效果较好的试验结果相似袁在下一
步中心组合设计时其中心点应适当下移遥 而发酵温度
渊云冤为正效应渊 贼值为正冤袁也符合单因素筛选的试验结
果袁中心点应适当上移遥 从 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶 试验结果
可以发现装液量渊耘冤并不是影响重组菌发酵产酶的显
著影响因子渊孕 越园郾 远怨苑怨冤袁这可能是由于此处 孕造葬糟噪藻贼贼鄄
远圆猿
摇 圆 期 响应面法优化重组枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶条件
月怎则皂葬灶设计选择的装液量水平范围过窄袁并未能充分
体现装液量大小与酶产量的关系袁在下一步的中心组
合设计中仍将装液量作为一个考察因子进行设计遥
圆郾 圆摇 响应面中心组合设计优化重组菌发酵产酶条件
圆郾 圆郾 员摇 预测模型建立及显著性检验摇 中心组合试验
对显著影响因子的水平进行设计的试验结果及预测值
见表 缘袁利用 阅藻泽蚤早灶鄄耘曾责藻则贼 分析软件对表 缘 中的数据
进行多元回归拟合袁得到酶活力 再 对编码自变量乳糖
渊粤冤尧装液量渊耘冤尧发酵温度渊云冤和发酵时间渊郧冤的二
次多项回归方程为院
再 越 员远员郾 猿缘 原 员圆郾 园缘粤 垣 缘郾 远耘 原 缘郾 远愿云 原 缘郾 愿源郧 原
员郾 圆猿粤耘 原 园郾 怨怨粤云 原 员郾 怨缘粤郧 原 员郾 员员耘云 原
员郾 缘怨耘郧 原 远郾 员缘云郧 原 员愿郾 缘愿粤圆 原 圆缘郾 猿耘圆 原
员圆郾 缘愿云圆 原 苑郾 猿郧圆
表 缘摇 响应面中心组合设计结果及预测值
栽葬遭造藻 缘摇 粤糟贼怎葬造 葬灶凿 责则藻凿蚤糟贼藻凿 增葬造怎藻泽 遭赠 糟藻灶贼则葬造 糟燥皂责燥泽蚤贼藻 凿藻泽蚤早灶
试验
贼藻泽贼
代 码 泽赠皂遭燥造 酶活力 藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 渊哉 辕 皂造冤
粤 耘 云 耘 验值贼藻泽贼 增葬造怎藻
预测值
责则藻凿蚤糟贼蚤增藻 增葬造怎藻
试验
贼藻泽贼
代 码 泽赠皂遭燥造 酶活力 藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 渊哉 辕 皂造冤
粤 耘 云 耘 验值贼藻泽贼 增葬造怎藻
预测值
责则藻凿蚤糟贼蚤增藻 增葬造怎藻
员 原 员 原 员 原 员 原 员 员园源郾 员远 员园圆郾 缘缘 员源 员 原 员 员 员 缘怨郾 园源 远猿郾 圆远
圆 员 原 员 原 员 原 员 愿源郾 怨远 愿远郾 苑愿 员缘 原 员 员 员 员 怨愿郾 源园 怨怨郾 园缘
猿 原 员 员 原 员 原 员 员圆猿郾 猿远 员圆员郾 远员 员远 员 员 员 员 远怨郾 员圆 远远郾 远园
源 员 员 原 员 原 员 员园源郾 员远 员园园郾 怨圆 员苑 原 员 园 园 园 员猿怨郾 远愿 员缘源郾 愿猿
缘 原 员 原 员 员 原 员 员园怨郾 源源 员园苑郾 远怨 员愿 员 园 园 园 员猿怨郾 圆园 员猿园郾 苑圆
远 员 原 员 员 原 员 愿苑郾 猿远 愿苑郾 怨远 员怨 园 原 员 园 园 员猿园郾 缘远 员猿园郾 源缘
苑 原 员 员 员 原 员 员圆缘郾 苑远 员圆圆郾 猿员 圆园 园 员 园 园 员猿源郾 愿愿 员源员郾 远缘
愿 员 员 员 原 员 怨猿郾 远园 怨苑郾 远远 圆员 园 园 原 员 园 员源远郾 愿愿 员缘源郾 源缘
怨 原 员 原 员 原 员 员 员员员郾 愿源 员员园郾 圆缘 圆圆 园 园 员 园 员源源郾 园园 员源猿郾 园怨
员园 员 原 员 原 员 员 愿苑郾 猿远 愿远郾 远愿 圆猿 园 园 园 原 员 员缘源郾 缘远 员缘怨郾 愿怨
员员 原 员 员 原 员 员 员圆苑郾 远愿 员圆圆郾 怨缘 圆源 园 园 园 员 员源远郾 愿愿 员源愿郾 圆员
员圆 员 员 原 员 员 怨园郾 圆源 怨源郾 源远 圆缘 园 园 园 园 员远园郾 愿园 员远员郾 猿远
员猿 原 员 原 员 员 员 怨员郾 远愿 怨园郾 苑怨 圆远 园 园 园 园 员愿员郾 怨圆 员远员郾 猿远
摇 摇 对上述回归模型进行方差分析袁表 远 表明袁该模型
达到了极显著水平渊孕 约 园郾 园园园员冤袁回归方程的失拟性
渊孕 越 园郾 愿愿猿源冤检验是极不显著的遥 其拟合优度可通过
校正决定系数 砸圆粤凿躁和决定系数 砸圆 来验证袁此回归模型
的 砸圆粤凿躁 越 园郾 怨园圆愿袁说明该模型能够解释 怨园郾 圆愿豫的变
化袁其总变异中仅有 怨郾 远圆豫不能由该模型来解释袁决
定系数 砸圆 越 园郾 怨缘苑猿袁表明重组菌发酵产酶量的实测值
与预测值之间具有很好的拟合度遥 因此袁可用此模型
对重组菌发酵产酶的条件进行分析和预测遥
圆郾 圆郾 圆摇 重组菌酶产量的响应面分析与优化摇 通过中
心组合模型方程得出的响应面三维图示见图 员袁图中
分别表示了显著影响重组菌发酵产酶 源 个因素间的两
两交互作用遥
乳糖和装液量对重组菌发酵产酶的交互影响效应
如图 员 原 粤袁由图可知二者交互作用不显著袁因为等高线
近似圆形咱员园暂 遥 同样袁由图 员 原 月可知乳糖和发酵温度对
重组菌发酵产酶的交互作用也不是很显著遥 当发酵温
度和装液量分别处于最佳值时乳糖浓度和发酵时间的
交互影响效应如图 员 原 悦袁图中反应出两因素的交互作
用较显著袁因为其等高线图呈现出明显的椭圆形状咱员园暂 遥
当乳糖浓度较低渊员园 耀 员缘早 辕 蕴冤时酶活力较高袁而随着乳
糖浓度的增加袁酶活力迅速下降遥 这可能是因为当乳糖
处于较高浓度时培养基的黏度过大袁不利于发酵过程中
氧气的传递袁同时袁高渗的环境中也不利于菌体正常生
长遥 因此要想获得较高的酶活力袁乳糖必需控制在一定
的浓度范围内遥 图 员 原 阅和图 员 原 耘分别反应了装液量
和发酵温度及装液量和发酵时间的交互作用袁都反映出
当装液量处于水平下限渊缘园皂造冤时酶活力很低袁适当增加
装液量渊至 远园皂造冤酶活力显著上升袁这主要是因为低的
装液量使得液体培养基中溶解氧过高袁菌体生长过旺袁
消耗大量的营养物使得后期营养不能满足其发酵产酶
的需求遥 而在装液量超过 苑园皂造 时酶活力则又不断下
降袁这是因为过多的装液量使得培养基中溶解氧水平不
足袁不能满足菌体的生长和代谢产酶需求遥 发酵温度和
发酵时间对重组菌发酵产酶的交互影响效应见图 员 原
云袁由图可知 圆 因素的交互作用极显著遥 在发酵温度为
猿园益时得到较高酶产量只需要约 苑圆 澡袁而当温度降到
圆愿郾 缘益时则需要近 怨远澡袁说明在 圆愿益 耀猿园益范围内适当
增加温度对发酵产酶有利并能有效地缩短发酵时间袁但
温度高于猿圆益时则不利于重组菌产酶袁这可能是因为分
泌到培养基中的酶在该温度下容易失活袁酶产量也就随
着下降遥
苑圆猿
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
图 员摇 试验因子交互作用对酶活力的影响
云蚤早援 员摇 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽 燥枣 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 枣葬糟贼燥则泽 燥灶 藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠
表 远摇 回归模型方程方差分析
栽葬遭造藻 远摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 增葬则蚤葬灶糟藻 憎蚤贼澡 则藻早则藻泽泽蚤燥灶 皂燥凿藻造
变异源
泽燥怎则糟藻
平方和
杂韵杂
自由度
阅云
均方
酝杂
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责值
孕则燥遭 跃 云
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云 缘愿园郾 苑圆 员 缘愿园郾 苑圆 远郾 缘猿 园郾 园圆远愿
郧 远员猿郾 怨园 员 远员猿郾 怨园 远郾 怨园 园郾 园圆猿远
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粤云 员缘郾 远愿 员 员缘郾 远愿 园郾 员愿 园郾 远愿圆苑
粤郧 远园郾 愿源 员 远园郾 愿源 园郾 远愿 园郾 源圆缘怨
耘云 员怨郾 苑员 员 员怨郾 苑员 园郾 圆圆 园郾 远源苑员
耘郧 源园郾 源缘 员 源园郾 源缘 园郾 源缘 园郾 缘员源员
云郧 远园缘郾 员远 员 远园缘郾 员远 远郾 愿园 园郾 园圆源源
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耘圆 员远猿怨郾 猿猿 员 员远猿怨郾 猿猿 员愿郾 源圆 园郾 园园员猿
云圆 源园缘郾 猿猿 员 源园缘郾 猿猿 源郾 缘远 园郾 园缘远圆
郧圆 员猿远郾 缘园 员 员猿远郾 缘园 员郾 缘猿 园郾 圆源员猿
失拟值 造葬糟噪 燥枣 枣蚤贼 员园 苑缘郾 缘愿 园郾 猿源 园郾 愿愿猿源
纯差 责怎则藻 藻则则燥则 员 圆圆猿郾 园猿
总离差 糟燥则 贼燥贼葬造 圆缘
砸圆 越 园郾 怨缘苑猿摇 砸圆粤凿躁 越 园郾 怨园圆怨摇 砸圆孕则藻 越 园郾 愿源苑圆
摇 摇 对于模型方程袁采用 阅藻泽蚤早灶鄄耘曾责藻则贼 软件进行分
析袁求得曲面的极值点渊即酶活力最大值为 员远源郾 怨园哉 辕
皂造冤袁对应的发酵最优条件为乳糖浓度 员远郾 怨早 辕 蕴尧发酵
时间 愿愿郾 源怨澡尧发酵温度 圆怨郾 苑员益和装液量 远员郾 猿员皂造袁为
了检验响应面法的可靠性袁采用上述相同发酵条件进
行了 猿 次重复验证实验袁得出重组菌发酵产酶量的平
均值为 员远苑郾 猿圆哉 辕 皂造袁与预测值基本吻合袁其相对误差
为 员郾 源远苑豫 袁说明该模型方程与实际情况拟合较好袁可
以用来较准确地预测重组菌发酵产酶袁优化后的重组
菌发酵产酶比优化前高出 圆郾 猿苑 倍遥
猿摇 讨论
培养基组分和发酵条件对微生物生长和发酵产代
谢物有着重要的影响袁合理选择培养基组分不仅能使
菌体尽快生长繁殖袁最大潜力地发酵产代谢物袁对能源
物质也是一种最大化的利用遥 同时袁对发酵条件的研
究也能有效地增加微生物代谢性能袁缩短培养周期袁节
约生产成本和创造更大的价值遥 本研究通过响应曲面
法建立连续变量曲面模型袁对影响重组枯草芽孢杆菌
发酵产脂肪氧合酶的生物过程因子及其交互作用进行
评价遥 研究表明袁低浓度的乳糖有助于菌体发酵产酶袁
这与脂肪氧合酶基因外源转入枯草芽孢杆菌后可能会
存在的分解代谢物阻遏效应有一定关系袁但该代谢过
程是否存在分解代谢物阻遏效应还有待进一步研究遥
较低浓度乳糖不易导致培养基黏度过大和渗透压过
高袁较适合菌体生长代谢遥 枯草芽孢杆菌虽是一类好
愿圆猿
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员圆袁圆远渊员冤院园猿圆源 耀 园猿圆怨
氧菌袁但是过低装液量并不适合菌体发酵产酶袁因为溶
解氧的过多使得培养基中大量的营养物主要流向菌体
的生长繁殖袁而很少流入代谢产酶途径袁所以该研究中
装液量为 远员郾 猿员皂造袁过高或过低均会使产酶量降低遥
从研究结果中能看出袁适当提高发酵温度能有效减少
发酵时间袁因为温度适当提高袁代谢途径中的各种酶系
反应速度会相应加快袁必然加速了代谢产目标物的过
程袁在这在工业生产上是一个很可观的改变袁不但缩短
了发酵周期袁节约了不必要的能源耗费袁而且使得酶产
量更高袁提高了设备的生产效率遥 目前该研究仅仅是
停留在实验室规模的探索袁如何实现重组枯草芽孢杆
菌工业规模高效生产脂氧酶及其在食品工业中的应用
将是我们以后研究的主要方向遥
源摇 结论
在前期单因素试验的基础上采用 孕造葬糟噪藻贼贼鄄月怎则皂葬灶
设计法对影响重组枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶的 苑 个
相关因子进行了筛选袁得出乳糖尧发酵时间和发酵温度
是影响重组菌产酶的显著影响因子袁进一步采用响应
面中心组合设计法渊悦藻灶贼则葬造 悦燥皂责燥泽蚤贼藻 阅藻泽蚤早灶冤对显著
影响因子的最佳水平和交互作用进行了研究袁通过对
模型方程的求解得出当乳糖浓度为 员远郾 怨早 辕 蕴尧发酵时
间为 愿愿郾 源怨 澡尧发酵温度为 圆怨郾 苑员益 和装液量为
远员郾 猿员皂造时袁酶活最大袁为 员远源郾 怨园 哉 辕 皂造袁验证试验证实
了在上述条件下得出的酶活为 员远苑郾 猿圆哉 辕 皂造袁与预测值
高度吻合遥 优化后的培养基和培养条件使得重组脂肪
氧合酶产量较优化前提高了 圆郾 猿苑 倍遥
参考文献院
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血淋巴脂肪氧合酶的分离纯化及其生化特性研究咱 允暂 援 中国食
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取及影响酶活因素的研究咱 允暂 援 林产化学与工业袁圆园园源袁圆源渊圆冤院
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