全 文 ：核 农 学 报　 ２０１３，２７（１１）：１６３６ ～ １６４３
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１２⁃１２⁃１９　 接受日期：２０１３⁃０５⁃０３
基金项目：国际科技合作与交流专项（２００７２０７２），国家自然科学基金（３１２６０４２０）
作者简介：乔亚红，女，主要从事植物分子育种与荒漠半荒漠地区作物种质创新研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｑｉａｏｙａｈｏｎｇ９８＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：向本春，男，教授，主要从事植物病毒及病害防治方面研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｘｂｃ＠ ｓｈｚｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１３）１１⁃１６３６⁃０８
红番 ３ 号加工番茄遗传转化再生体系的建立
乔亚红　 郑银英　 李诗林　 田桂英　 张丽丽　 林　 涛　 向本春
（石河子大学农业生物技术重点实验室∕石河子大学生命科学学院， 新疆 石河子　 ８３２００３）
摘　 要：本研究以加工番茄红番 ３ 号子叶为外植体，对加工番茄再生体系无菌苗的苗龄、培养基激素的配
比和培养基基质选择方面进行优化。 结果表明：８ ～ １０ ｄ 的子叶为最佳的外植体。 以 ＭＳ 为基本培养
基，附加不同浓度 ＩＡＡ（０􀆰 ０５、０􀆰 １０、０􀆰 １５、０􀆰 ２０ｍｇ·Ｌ － １）分别与不同浓度 ６ － ＢＡ（１􀆰 ０、１􀆰 ５、２􀆰 ０、２􀆰 ５ｍｇ·
Ｌ － １） ／ ＺＴ（０􀆰 １、０􀆰 ５、１􀆰 ５、２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １）的组合。 经诱芽比较，在不同浓度 ６ － ＢＡ ／ ＺＴ与不同浓度 ＩＡＡ 组
合中，诱导出愈伤组织和不定芽分化最高的培养基为 ＭＳ ＋ ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １ ＋植物凝胶
２ｇ·Ｌ － １。 以 １ ／ ２ＭＳ添加不同浓度 ＩＡＡ（０􀆰 ０５、０􀆰 １０、０􀆰 １５、０􀆰 ２０ｍｇ·Ｌ － １）进行生根比较，再生芽在 １ ／ ２ＭＳ
＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １生根培养基上生根最好。
关键词：加工番茄；子叶；遗传转化；再生体系
　 　 加工番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）是一种重要的蔬
菜作物，也是番茄加工工业的主要原料［１］。 加工番茄
以适应性广、易栽培、产量高和耐储存运输等特点而著
称，其鲜果风味独特、营养丰富，而且还可以加工成番
茄制品远销国内外，深受人们的喜爱。 在我国加工番
茄主要集中在新疆，逐渐发展到内蒙、甘肃、宁夏等
地［２］。 目前，新疆加工番茄产量位居世界前三，番茄
酱出口量约占全球贸易总量的 １ ／ ４［３］。
近年来，在加工番茄新品种选育过程中发现，由于
选择压力较大，部分材料间的遗传背景较单一，致使不
同材料间的遗传距离较小，严重阻碍了高产、优质、高
抗加工番茄选育的进程［４］。 自 １９８６ 年 ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ
等［５］报道农杆菌介导番茄叶盘转化法以来，番茄作为
转基因受体植物得到迅速发展。 目前利用基因工程技
术已经获得了抗病虫害、抗逆、延熟等转基因番茄。
Ｔｈｏｍｚｉｋ等［６］将合成 １，２ －二苯乙烯的酶基因 Ｖｓｔ１ 和
Ｖｓｔ２ 导入番茄中，再将其与晚疫病真菌共培养，结果
发现在番茄植株体内产生了 １，２ －二苯乙烯的后继产
物植保素—反式白梨芦醇，这种番茄植株能抗晚疫病。
Ｊａｎｓｅｎｓ等［７］将修饰的毒蛋白基因 ＣｒｙＩＡ（ ｂ）导入番
茄，获得抗番茄钻心虫的转基因植株。 Ｄｅｓｓａｌｅｇｎｅ
等［８］将草酸氧化酶基因转入番茄中，得到的转基因番
茄在盐胁迫情况下产量大于对照。 Ｋｌｅｅ 等［９］从土壤
细菌中分离出了一种 ＡＣＣｄ酶，转入番茄，结果发现能
使番茄延熟。 但加工番茄的遗传转化研究还比较薄
弱，目前仅有加工番茄 Ｍ８２、ＢＯ２、ＢＯ４、里格儿 ８７ － ５、
亚心 ９８ － １ 等再生体系的报道［ １０ － １３］，并且认为加工
番茄与鲜食番茄之间及不同的加工番茄品种之间存在
着不同的转化体系。 红番 ３ 号以里格儿 ８７ － ５（选择
优良的 ８７ － ５ 单株经 ３ 代提纯而成）为父本杂交获得，
比里格儿 ８７ － ５ 早熟，个大，耐压性和综合抗性好，有
望取代生产中里格儿 ８７ － ５，成为加工番茄主栽区的
主栽品种。 因此建立红番 ３ 号加工番茄遗传转化的再
生体系尤为重要，这为加工番茄基因工程育种、杂种优
势固定和优异种质保存提供了前提。
本试验以新疆加工番茄红番 ３ 号的子叶为外植
体，分析不同激素配比对农杆菌侵染的加工番茄子叶
外植体出愈率和诱芽率的影响，筛选出较适于加工番
茄红番 ３ 号的激素浓度组合，进而对加工番茄再生、转
化、抗性筛选等体系优化，以期为转基因加工番茄的深
入研究奠定基础。
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　 １１ 期 红番 ３ 号加工番茄遗传转化再生体系的建立
１　 材料与方法
１􀆰 １　 植物材料
以加工番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ） 品种红番部落
三号（改良 ８７ － ５）为试验材料。
１􀆰 ２　 载体、工程菌株及遗传转化方法
植物表达载体 ｐＢｉ３５ＳＴＣ１２ 是含有 ＣＭＶ 分离物
ＮＳ０ － ４ 的 １ａ复制酶 １０５１ｎｔ － １３５０ｎｔ 片段和 ＴｏＭＶ 分
离物 ＳＣＳ － ２ 的 １３０ ／ １８０ｋＤａ 复制酶 １９２０ｎｔ － ２２００ｎｔ
片段的 ＲＮＡｉ干扰载体；农杆菌 ＧＶ３１０１。 遗传转化方
法为叶盘法［１４］。
１􀆰 ３　 培养基
１􀆰 ３􀆰 １　 种子发芽培养基 　 １ ／ ２ＭＳ 培养基（１ ／ ２ＭＳ 大
量元素 ＋ ＭＳ 微量元素 ＋ ＭＳ 铁盐 ＋ ＭＳ 有机物质；蔗
糖 １５ｇ ／ Ｌ） ＋琼脂粉 ５ｇ·Ｌ － １，ｐＨ值 ５􀆰 ８。
１􀆰 ３􀆰 ２　 分化培养基　 ＭＳ（大量元素 ＋ ＭＳ 微量元素 ＋
ＭＳ铁盐 ＋ ＭＳ有机物质；蔗糖 ３０ｇ·Ｌ － １） ＋ ２ｇ·Ｌ － １植物
凝胶，ｐＨ值 ５􀆰 ８ 于上述 ＭＳ中添加 ６ － ＢＡ和 ＩＡＡ的质
量浓度分别为 ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １和 ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １。
１􀆰 ３􀆰 ３　 共培养基 　 ＭＳ（大量元素 ＋ ＭＳ 微量元素 ＋
ＭＳ铁盐 ＋ ＭＳ有机物质；蔗糖 ３０ｇ·Ｌ － １） ＋ ２ｇ·Ｌ － １植物
凝胶，ｐＨ值 ５􀆰 ８ 于上述 ＭＳ基本培养基中添加质量浓
度为 ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ 的 ６ － ＢＡ、 ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １ ＩＡＡ 和
１００μｍｏｌ·Ｌ － １乙酰丁香酮（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，ＡＳ）。
１􀆰 ３􀆰 ４　 筛选培养基　 （１）ＭＳ（大量元素 ＋ ＭＳ 微量元
素 ＋ ＭＳ铁盐 ＋ ＭＳ有机物质；蔗糖 ３０ｇ·Ｌ － １） ＋ ５ｇ·Ｌ － １
琼脂粉，ｐＨ值 ５􀆰 ８；（２）ＭＳ（大量元素 ＋ ＭＳ 微量元素
＋ ＭＳ铁盐 ＋ ＭＳ有机物质；蔗糖 ３０ｇ·Ｌ － １） ＋ ２ｇ·Ｌ － １植
物凝胶，ｐＨ 值 ５􀆰 ８。 于上述 ＭＳ 基本培养基中添加不
同浓度的细胞分裂素和生长素构成不同的不定芽诱导
培养基，设计 ＺＴ 的质量浓度为 ０􀆰 １、０􀆰 ５、１􀆰 ０、１􀆰 ５ｍｇ·
Ｌ － １与 ０􀆰 ０５、０􀆰 １、０􀆰 １５、０􀆰 ２ｍｇ·Ｌ － １ ＩＡＡ 组合；６ － ＢＡ 的
质量浓度为 １􀆰 ０、１􀆰 ５、２􀆰 ０、２􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １与 ０􀆰 ０５、０􀆰 １、
０􀆰 １５、０􀆰 ２ｍｇ·Ｌ － １ ＩＡＡ 组合，每个组合 ３ 个重复。 同时
在上述培养基中加入 Ｃａｒｂ （ ３００ｍｇ·Ｌ － １ ） 和 Ｋａｎａ
（５０ｍｇ·Ｌ － １）
１􀆰 ３􀆰 ５　 生根培养基　 １ ／ ２ＭＳ 培养基（琼脂粉 ５ｇ·Ｌ － １，
ｐＨ值 ５􀆰 ８）加入 ＩＡＡ 质量浓度为 ０、０􀆰 ０５、０􀆰 １、０􀆰 １５、
０􀆰 ２ｍｇ·Ｌ － １。 每种培养基在 １２１℃温度下高压灭菌
２０ｍｉｎ，在培养基温度达到 ４０ ～ ５０℃时，加入相应的激
素和抗生素。
１􀆰 ４　 试验方法
１􀆰 ４􀆰 １　 无菌苗的获得　 取加工番茄种子于稀释 ５ 倍
的次氯酸钠溶液中消毒 １５ｍｉｎ，用无菌水冲洗 ３ 次，每
次 １０ｍｉｎ，于灭菌的干燥滤纸上吸干残液，接种到
１ ／ ２ＭＳ 培养基上，置 ２５℃暗培养。 ２ ｄ 后转到光下培
养，每天光照时间 １６ ｈ，光照强度 １ ６００ ～ １ ８００ ｌｘ，培
养温度为 ２５℃，继续培养 ５ ～ ６ ｄ 待子叶完全展开。
１􀆰 ４􀆰 ２　 苗龄试验　 试验选取苗龄为 ４、６、８ 和 １０ｄ 的
加工番茄子叶作为外植体，接种于 ＭＳ ＋ ６ － ＢＡ ２􀆰 ０ｍｇ
·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １培养基中，培养 ２０ ｄ，在子叶基
部的切口或伤口处形成愈伤组织，观察外植体的生长
情况，确定最适宜组织培养的番茄苗龄［１５］。
１􀆰 ４􀆰 ３　 外植体的培养 　 取 ８ ～ １０ ｄ 龄完全展开的加
工番茄幼叶，沿子叶基部将子叶切下，然后子叶顶端切
去 １ｍｍ左右弃之不用，在剩余部分中横切一刀，将一
片子叶分为两块 ０􀆰 ５ｃｍ ×０􀆰 ５ｃｍ 大小的子叶块（即叶
盘），子叶叶片下表面朝下，把番茄子叶和下胚轴均匀
放在分化培养基上 （ ＭＳ ＋ ６ － ＢＡ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋
ＩＡＡ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １），２４℃，黑暗条件下预培养 ３ ｄ。
１􀆰 ４􀆰 ４ 　 农杆菌浸 染 悬 浮 液 的 准 备 　 挑 取 含
ｐＢｉ３５ＳＴＣ１２ 质粒 ＤＮＡ 的工程菌株单菌落，接种于
５ｍＬＹＥＰ （ Ｇｅｎ４０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ Ｒｉｆ ２０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ Ｋａｎａ
５０ｍｇ·Ｌ － １）液体培养基中，于 ２８℃，２００ｒ·ｍｉｎ － １振摇
过夜，次日按 １ ∶ ５０ 转接至新鲜 ＹＥＰ 液体培养基中，
２８℃ ２００ｒ·ｍｉｎ － １振摇约 ３ ～ ５ ｈ至菌液 ＯＤ６００ 为 ０􀆰 ６
～ ０􀆰 ８。 将培养物于 ４０００ｒ·ｍｉｎ － １离心 １０ｍｉｎ，弃上
清，菌体用液体 １ ／ ２ＭＳ稀释 １０ ～ ２０ 倍，可根据情况在
此时加入 ＡＳ 至终浓度 １００μｍｏｌ·Ｌ － １， 再置于 ２８℃
２００ｒ·ｍｉｎ － １振摇 １ ～ ２ ｈ，所获菌液即为工程菌浸染悬
浮液，用作加工番茄番茄外植体的浸染。
１􀆰 ４􀆰 ５　 外植体的侵染和共培养 将预培养的加工番茄
子叶置于上述制备好的农杆菌浸染悬浮液中，浸染 １５
～ ２０ｍｉｎ，其间不断摇动，再用无菌滤纸吸去多余的农
杆菌液，取一张无菌滤纸铺于共培养基上，将浸染好的
番茄子叶置于其上，于 ２４℃暗培养 ２ｄ。
１􀆰 ４􀆰 ６　 加工番茄再生芽诱导筛选　 加工番茄芽诱导
与芽伸长期的筛选培养：芽诱导选择培养基为 ＭＳ ＋
植物激素（ ＺＴ、６ － ＢＡ） ＋ Ｃａｒｂ ３００ｍｇ·Ｌ － １ ＋ Ｋａｎａ
５０ｍｇ·Ｌ － １。 将浸染农杆菌后共培养 ２ ｄ 的加工番茄子
叶外植体转移至芽诱导筛选培养基，培养条件为光照
１６ ｈ，光照强度 ３０００ ｌｘ，培养温度 ２４℃，约 ２ 周左右继
代 １ 次，观察芽诱导生长情况，出芽的外植体转移至芽
伸长选择培养基，长愈伤的外植体更换培养基继代持
续芽诱导。
出愈率 ＝ （诱导愈伤组织外植体数 ／接种外植体
数） × １００％
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核　 农　 学　 报 ２７ 卷
不定芽的诱导率 ＝ （分化不定芽的外植体数 ／接
种外植体数） × １００％ ［１６］。
１􀆰 ４􀆰 ７　 加工番茄的生根和转基因植株的移栽　 当加
工番茄芽在培养基上生长至 １􀆰 ５ ～ ２ｃｍ 时，切下小芽，
插入生根选择培养基 １ ／ ２ＭＳ培养基 ＋ ＩＡＡ（０􀆰 ０５、０􀆰 １、
０􀆰 １５、０􀆰 ２ｍｇ·Ｌ － １） ＋ Ｋａｎａ ５０ｍｇ·Ｌ － １中，于 ２５ ～ ２８℃
光照培养，观察生根情况。 待转基因小苗生根后长至
近培养瓶高时，揭膜注入水，以淹没培养基即可，同时
注意保湿，进行驯化培养，温度为白天 ２４℃，夜间
２０℃，光照培养 １６ｈ·ｄ － １，３ ｄ后，从锥形瓶中取出小苗
洗去根部培养基防止细菌滋生，将再生植株转移到注
入 １ｃｍ水的锥形瓶中，在 ２０ ～ ２５℃下生长。 ４ ｄ 后，移
栽到土中，观察其成活率。
表 １　 不同浓度的 ＺＴ和 ＩＡＡ的组合对加工番茄红番 ３ 号外植体的芽诱导的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＺＴ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＩＡＡ ｏｎ ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ Ｈｏｎｇｆａｎ ３
激素浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ／
（ｍｇ·Ｌ － １）
ＺＴ ＩＡＡ
叶盘数
Ｎｏ． ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ
诱导愈伤的叶盘数
Ｎｏ． ｏｆ ｃａｌｌｕｓ
出愈率
Ｃａｌｌｕｓ ｒａｔｅ ／ ％
出芽叶盘数
Ｎｏ． ｏｆ ｂｕｄｄｉｎｇ
出芽率
Ｂｕｄｄｉｎｇ ｒａｔｅ ／ ％
０􀆰 １ ０􀆰 ０５ ４０ ２８ ７０􀆰 ０ １４ ３５􀆰 ０
０􀆰 １ ０􀆰 １０ ４０ ３１ ７７􀆰 ５ １６ ４０􀆰 ０
０􀆰 １ ０􀆰 １５ ４０ ２７ ６７􀆰 ５ １５ ３７􀆰 ５
０􀆰 １ ０􀆰 ２０ ４０ ３０ ７５􀆰 ０ １７ ４２􀆰 ５
０􀆰 ５ ０􀆰 ０５ ４０ ３４ ８５􀆰 ０ ２８ ７０􀆰 ０
０􀆰 ５ ０􀆰 １０ ４０ ３８ ９５􀆰 ０ ３１ ７７􀆰 ５
０􀆰 ５ ０􀆰 １５ ４０ ３５ ８７􀆰 ５ ３０ ７５􀆰 ０
０􀆰 ５ ０􀆰 ２０ ４０ ３６ ９０􀆰 ０ ２６ ６５􀆰 ０
１􀆰 ０ ０􀆰 ０５ ４０ ２６ ６５􀆰 ０ ２１ ５２􀆰 ５
１􀆰 ０ ０􀆰 １０ ４０ ２７ ６７􀆰 ５ ２２ ５５􀆰 ５
１􀆰 ０ ０􀆰 １５ ４０ ２３ ５７􀆰 ５ ２１ ５２􀆰 ５
１􀆰 ０ ０􀆰 ２０ ４０ ２４ ６０􀆰 ０ １６ ４０􀆰 ０
１􀆰 ５ ０􀆰 ０５ ４０ ２０ ５０􀆰 ０ １３ ３２􀆰 ５
１􀆰 ５ ０􀆰 １０ ４０ ２５ ６２􀆰 ５ １９ ４７􀆰 ５
１􀆰 ５ ０􀆰 １５ ４０ ２２ ５５􀆰 ０ １５ ３７􀆰 ５
１􀆰 ５ ０􀆰 ２０ ４０ ２３ ５７􀆰 ５ １６ ４０􀆰 ０
２　 结果与分析
２􀆰 １　 苗龄对加工番茄愈伤组织及不定芽诱导的影响
选取 ４、６、８ 和 １０ｄ加工番茄子叶接种于 ＭＳ ＋６ －
ＢＡ ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １培养基，４ｄ 龄的子叶
接种 ３ｄ 后，没有明显变化，５ｄ 后有 ２０％子叶边缘发
黑，７ｄ后边缘变黑的子叶增加到 ４０％ ，而先前已经变
黑的子叶边缘向中间扩散直至完全变黑，有 ３０％的子
叶明显增大，叶片增厚，而剩下 ３０％的子叶到 １０ ～ １５ｄ
后增大，叶片增厚；６ｄ 龄的子叶接种 ４ｄ 后，有 ３０％的
子叶明显增大，７ｄ后有 ７０％子叶明显增大，叶片增厚，
１０ ～ １４ｄ剩余子叶全部增大，叶片增厚；在 ２０ ～ ２５ｄ，４ｄ
和 ６ｄ龄中明显增大和增厚的子叶开始产生愈伤，但出
芽率很低，仅是出愈子叶的 ５％ ～ １０％ 。 ８ｄ 和 １０ｄ 龄
子叶在接种 ４ｄ 后，均明显增大，叶片增厚；培养时间
５ｄ后，外植体颜色加深； 接种 １０ｄ后，子叶切口处均产
生大量愈伤组织，子叶变形、变脆，易于折断，培养二周
后，子叶边缘卷起处可见绿色或浅黄色小突起，即为潜
在的芽点（图 １），随着培养时间延长最终长成不定芽
（图 ２）。 所以应选取 ８ ～ １０ｄ 龄的子叶作为最适宜的
外植体。
２􀆰 ２　 不同激素浓度配比对愈伤组织及不定芽诱导的
影响
本试验是通过确定细胞分裂素 ＺＴ、６ － ＢＡ 与不同
浓度的生长素 ＩＡＡ配比和确定生长素 ＩＡＡ与不同浓度
的细胞分裂素 ＺＴ、６ － ＢＡ配比筛选最佳诱芽培养基，试
验中 ＭＳ培养基中均添加植物凝胶（２ｇ·Ｌ －１）。 将共培
养 ２ｄ 的加工番茄子叶外植体转移到含不同激素的 ＭＳ
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　 １１ 期 红番 ３ 号加工番茄遗传转化再生体系的建立
培养基上。 试验发现，不同浓度配比的 ＺＴ ＋ ＩＡＡ 处理
对外植体出愈率和诱导率存在明显差异（表 １）。ＺＴ
０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ －１ ＋ ＩＡＡ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ －１处理外植体出愈率和诱导
率最高分别为 ９５％和 ７７􀆰 ５％，ＺＴ １􀆰 ５ｍｇ·Ｌ －１ ＋ ＩＡＡ
０􀆰 ０５ｍｇ·Ｌ －１处理外植体出愈率和诱导率最低分别为
５０％和 ３２􀆰 ５％。 ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ －１ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ －１处理
为最理想的诱芽培养基。 根据观察发现，ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ －１
＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ －１处理的培养基上，加工番茄子叶分化
能力强，在 ３ ～ ４ｄ 后明显增大，叶片增厚，在 ７ｄ 后开始
分化，边缘膨大、弯曲、产生愈伤组织。
表 ２　 不同浓度的 ６ － ＢＡ和 ＩＡＡ的组合对加工番茄红番 ３ 号外植体芽诱导的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ６ － ＢＡ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＩＡＡ ｏｎ ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ Ｈｏｎｇｆａｎ３
激素浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ／
ｍｇ·Ｌ － １
６ － ＢＡ ＩＡＡ
叶盘数
Ｎｏ． ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ
诱导愈伤的叶盘数
Ｎｏ． ｏｆ ｃａｌｌｕｓ
出愈率
Ｃａｌｌｕｓ ｒａｔｅ ／ ％
出芽叶盘数
Ｎｏ． ｏｆ ｂｕｄｄｉｎｇ
出芽率
Ｂｕｄｄｉｎｇ ｒａｔｅ ／ ％
１􀆰 ０ ０􀆰 ０５ ４０ １０ ２５􀆰 ０ ５ １２􀆰 ５
１􀆰 ０ ０􀆰 １０ ４０ １５ ３７􀆰 ５ ８ ２０􀆰 ０
１􀆰 ０ ０􀆰 １５ ４０ １３ ３２􀆰 ５ ７ １７􀆰 ５
１􀆰 ０ ０􀆰 ２０ ４０ １２ ３０􀆰 ０ ７ １７􀆰 ５
１􀆰 ５ ０􀆰 ０５ ４０ １１ ２７􀆰 ５ ６ １５􀆰 ０
１􀆰 ５ ０􀆰 １０ ４０ １６ ４０􀆰 ０ ９ ２２􀆰 ５
１􀆰 ５ ０􀆰 １５ ４０ １３ ３２􀆰 ５ ６ １５􀆰 ０
１􀆰 ５ ０􀆰 ２０ ４０ １８ ４５􀆰 ０ １０ ２５􀆰 ０
２􀆰 ０ ０􀆰 ０５ ４０ ２４ ６０􀆰 ０ １７ ４２􀆰 ５
２􀆰 ０ ０􀆰 １０ ４０ ２８ ７０􀆰 ０ ２３ ５７􀆰 ５
２􀆰 ０ ０􀆰 １５ ４０ ２５ ６２􀆰 ５ １８ ４５􀆰 ０
２􀆰 ０ ０􀆰 ２０ ４０ ２３ ５７􀆰 ５ １５ ４２􀆰 ５
２􀆰 ５ ０􀆰 ０５ ４０ １７ ４２􀆰 ５ ９ ２２􀆰 ５
２􀆰 ５ ０􀆰 １０ ４０ １７ ４２􀆰 ５ １０ ２５􀆰 ０
２􀆰 ５ ０􀆰 １５ ４０ １４ ３５􀆰 ０ ８ ２０􀆰 ０
２􀆰 ５ ０􀆰 ２０ ４０ １３ ３２􀆰 ５ ６ １５􀆰 ０
　 　 不同浓度配比的 ６ － ＢＡ ＋ ＩＡＡ处理对外植体出愈
率和诱导率的影响 （表 ２）。 ６ － ＢＡ ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ
０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １处理，加工番茄外植体出愈率和诱导率均
最高分别为 ７０％和 ５７􀆰 ５％ ，６ － ＢＡ １􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ
０􀆰 ０５ｍｇ·Ｌ － １处理，加工番茄外植体出愈率和诱导率均
最低分别为 ２５％和 １２􀆰 ５％ 。 ６ － ＢＡ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ
０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １处理为最理想的诱芽培养基。 根据观察发
现，６ － ＢＡ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １处理的培养基
上，加工番茄子叶分化能力较强，在 ４ｄ后增大，叶片增
厚，在 １０ｄ 后开始分化，边缘膨大、弯曲、产生愈伤组
图 １　 诱导愈伤
Ｆｉｇ． １　 Ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
织。 研究表明：加工番茄外植体出愈率和诱芽率，ＺＴ
０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １处理效果均明显优于
９３６１
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
图 ２　 分化生芽
Ｆｉｇ． ２　 Ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
６ － ＢＡ ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １处理。
２􀆰 ３　 不同的培养基对加工番茄红番 ３ 号外植体芽诱
导的影响
表 ３　 不同的培养基基质对加工番茄红番 ３ 号外植体芽诱导的影响
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ Ｈｏｎｇｆａｎ３
培养基
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ６ － ＢＡ ／ （ｍｇ·Ｌ
－ １） ＺＴ ／ （ｍｇ·Ｌ － １） ＩＡＡ ／ （ｍｇ·Ｌ － １）
接种的愈伤数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ
出芽率
Ｂｕｄｄｉｎｇ ｒａｔｅ ／ ％
ＭＳ ＋琼脂粉（５ｇ·Ｌ － １） ２􀆰 ０ ０􀆰 １ ４０ ２０􀆰 ０
ＭＳ ＋琼脂粉（５ｇ·Ｌ － １） ０􀆰 ５ ０􀆰 １ ４０ ２５􀆰 ０
ＭＳ ＋植物凝胶（２ｇ·Ｌ － １） ２􀆰 ０ ０􀆰 １ ４０ ５２􀆰 ５
ＭＳ ＋植物凝胶（２ｇ·Ｌ － １） ０􀆰 ５ ０􀆰 １ ４０ ７５􀆰 ０
表 ４　 不同浓度 ＩＡＡ对加工番茄红番 ３ 号不定芽生根的影响
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＡＡ ｏｎ ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ Ｈｏｎｇｆａｎ ３
ＩＡＡ ／ （ｍｇ·Ｌ － １）
生根率
Ｒｏｏｔｉｎｇ ｒａｔｅ ／ ％
生根时间
Ｒｏｏｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ／ ｄ
平均根数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｏｏｔ
根生长状况
Ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ
０􀆰 ０５ ５０􀆰 ２ ９ ～ １２ ３􀆰 ２ 主根少，须根少
０􀆰 １０ ８４􀆰 ５ ６ ～ ８ ６􀆰 ８ 主根粗壮，须根多
０􀆰 １５ ６５􀆰 ３ ９ ～ １１ ４􀆰 ２ 主根细长且少，须根少
０􀆰 ２０ ４２􀆰 ５ １０ ～ １２ ３􀆰 ５ 主根细长且少，须根少
　 　 将农杆菌侵染共培养 ２ ｄ的加工番茄子叶外植体
分别转移到添加琼脂粉或植物凝胶 ＭＳ 培养基，结果
如表 ３ 所示，在添加琼脂粉和植物凝胶的 ＭＳ 培养基
上，６ － ＢＡ ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １处理诱芽率分
别为 ２０％和 ５２􀆰 ５％ ，ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １
处理诱芽率分别为 ２５％和 ７５％ ；ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ
０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １ 处理均高于 ６ － ＢＡ ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ
０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １处理。 结果表明在 ＭＳ 培养基上添加植物
凝胶和 ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １的组合更有利
于加工番茄红番 ３ 号外植体芽的诱导。
２􀆰 ４　 不同浓度 ＩＡＡ对加工番茄红番 ３ 号不定芽生根
的影响
通过抗性筛选获得的转基因加工番茄小苗进行根
筛选诱导，结果如表 ４ 所示，在生根培养基上添加
０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １ ＩＡＡ后，转基因加工番茄小苗在生根时间、
平均根数、植株生长势等方面具有明显的优势（图 ３）；
不同浓度的 ＩＡＡ对根的生长也不同，不定芽在 ６ ～ １２
ｄ均可生根，但对根长势的影响差异比较明显。
转基因加工番茄幼苗生长到 ６ ～ ８ｃｍ，根长为 ４ ～
５ｃｍ时，打开锥形瓶封口膜，在锥形瓶中注入水，以淹
没培养基即可，同时注意保湿，进行驯化培养，温度昼
夜 ２４℃ ／ ２０℃，光照周期为 １６ｈ 光照 ／ ８ｈ 黑暗（图 ４）。
３ ｄ后，从锥形瓶中取出小苗洗去根部培养基防止细
菌滋生，将转基因再生植株转移到注入 １ｃｍ 水的锥形
瓶中，在 ２０ ～ ２５℃下生长。 ４ ｄ 后，移栽到营养土中
（图 ５），移栽成活率达到 ９８％ 。
３　 讨论
本文研究了无菌苗苗龄对外植体再分化的影响，
０４６１
　 １１ 期 红番 ３ 号加工番茄遗传转化再生体系的建立
图 ３　 分化生根
Ｆｉｇ． ３　 Ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
图 ４　 转基因再生植株炼苗
Ｆｉｇ． ４ Ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ
结果表明红番 ３ 号加工番茄 ８ ～ １０ ｄ 苗龄更有利于出
芽，出芽率最高达到 ８５％ 。 低苗龄加工番茄子叶虽然
膨大、增厚及出愈，但出愈子叶 ９０％ ～ ９５％不能分化
出芽。 究其原因可能是较低苗龄的子叶自身的修复能
力比较差，进行切割对其正常的生理代谢产生影响，从
而阻碍了细胞全能性的发挥。 而 ８ ～ １０ ｄ 苗龄，子叶
图 ５　 转基因再生植株的移栽
Ｆｉｇ． ５　 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔ
细胞生理代谢活跃，容易受到外界环境因子的影响，更
容易经过脱分化、再分化形成芽［１７］。 因此，选择适宜
苗龄的无菌苗是提高出芽率的关键。
不同加工番茄品种遗传转化再生体系中细胞分裂
素和生长素不同配比决定愈伤出愈率、不定芽诱导率、
再生芽诱导和不定芽生根等诸多环节。 Ｃａｒｏｌｉｎａ
１４６１
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
Ｃｏｒｔｉｎａ等［１０］以加工番茄 Ｍ８２ 为材料，对番茄再生体
系进行分析和优化，认为诱导芽再生最佳的激素浓度
为 ＺＴ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 ５ｖ 组合。 寇晓虹等［１８］以新
疆加工番茄（代号 ９９ － １６２ 混）为材料，诱芽培养基以
ＭＳ ＋ ＺＴ２􀆰 ０ｖ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 ２ｍｇ·Ｌ － １效果为最佳；张丽华
等［１１］以加工番茄 ＢＯ２ 和 ＢＯ４ 为研究材料报道以 ＭＳ
＋ ＺＴ １􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ０􀆰 ０５ｍｇ·Ｌ － １为诱芽培养基为
最佳；陈丽萍等［１２］以加工番茄 ＢＯ４ 为研究材料报道
在不同的激素组合中，不定芽诱导率最高的培养基为
ＭＳ ＋ ＺＴ２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ０􀆰 ２ｍｇ·Ｌ － １。 而本研究以加
工番茄红番 ３ 号为材料，认为不定芽诱导的最适宜培
养基是 ＭＳ ＋ ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １，研究中
发现当 ＺＴ的质量浓度在 ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １时，子叶多可形成
致密型绿色或黄色小愈伤，得到较高的芽分化率，芽分
化正常，比较粗壮。 这与 Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｃｏｒｔｉｎａ 等［１０］的结果
是一致的，然而寇晓虹等［１８］和陈丽萍等报道［１２］ ＺＴ 为
２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １时不定芽产生的速度最快，与本试验 ＺＴ 质
量浓度为 ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １时不定芽产生的速度最快有一定
差异，这可能与试验中所选取材料的苗龄［１９］、外植体
的类型［２０ － ２２］、生长调节剂［２３ － ２４］、接种方式等有关，另
外这种较大的差异可能与番茄的品种及其基因型密切
有关［２５ － ２８］。 因以针对不同品种的加工番茄，探索激素
的配比和建立高效的加工番茄遗传转化再生体系，仍
是今后研究的重点。
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８５： １５９ － １６８
Ａ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｏｍａｔｏ Ｈｏｎｇｆａｎ３
ＱＩＡＯ Ｙａ⁃ｈｏｎｇ　 ＺＨＥＮＧ Ｙｉｎ⁃ｙｉｎｇ　 ＬＩ Ｓｈｉ⁃ｌｉｎ　 ＴＩＡＮ Ｇｕｉ⁃ｙｉｎｇ　 ＺＨＡＮＧ Ｌｉ⁃ｌｉ　 ＬＩＮ Ｔａｏ　 ＸＩＡＮＧ Ｂｅｎ⁃ｃｈｕｎ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ／ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｉｈｅｚｉ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ　 ８３２００３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ Ｈｏｎｇｆａｎ３ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｏｉｃｅｓ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ａｇｅ， ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｄｉａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ
ｂｅｓｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇ⁃ａｇｅ ｗｅｒｅ ８ ～ １０ ｄａｙｓ． ＭＳ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｕｍ， ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＩＡＡ（０􀆰 ０５，０􀆰 １０，
０􀆰 １５，０􀆰 ２０ｍｇ·Ｌ － １）ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ６ － ＢＡ（１􀆰 ０，１􀆰 ５，２􀆰 ０，２􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １） ／ ＺＴ （０􀆰 １，０􀆰 ５，１􀆰 ５，
２􀆰 ０ｍｇ·Ｌ － １ ｍｇ ／ Ｌ） ｏｎ ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ＭＳ ＋ ＺＴ ０􀆰 ５ｍｇ·Ｌ － １ ＋ ＩＡＡ ０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １ ＋ Ｐｈｙｔａｇｅｌ ２ｇ·Ｌ － １ ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １ ／ ２ＭＳ ＋ ＩＡＡ
０􀆰 １ｍｇ·Ｌ － １ ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｏｍａｔｏ； Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ； Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
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