全 文 ：核 农 学 报　 ２０１３，２７（１１）：１７４２ ～ １７４８
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０１⁃２５　 接受日期：２０１３⁃０５⁃３０
基金项目：国家科技支撑计划（２０１１ＢＡＤ３２Ｂ０３ － ０２），寒地作物品种改良与生理生态重点开放实验室项目（ｈｄｚｗ － ００８），黑龙江省博士后基金项
目（ＬＢＨ － Ｚ１０２５３）
作者简介：杨猛，男，主要从事玉米低温生理研究 。 Ｅ － ｍａｉｌ： ｊｉｍｚｕｉａｉ＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：李晶，女，副教授，主要从事作物逆境生理研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｌｉ１０２７＠ １６３． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１３）１１⁃１７４２⁃０７
玉米苗期受低温胁迫蛋白表达差异研究
杨　 猛１ 　 庄文锋２ 　 魏　 湜１ 　 顾万荣１ 　 杨　 晔１ 　 王　 萌１ 　 李　 晶 １
（ １东北农业大学农学院，哈尔滨 黑龙江　 １５００３０；２哈尔滨市农业科学院，哈尔滨 黑龙江　 １５００７０）
摘　 要：为寻找玉米苗期抗低温表达调控相关蛋白。 本试验应用双向电泳技术对吉单 １９８、 兴垦 ３ 和金
玉 ５ ３ 个品种不同温度处理全蛋白进行分析，结果表明：２３２ 个蛋白点上调，１５６ 个蛋白点下调，２８ 个新
增蛋白点，３ 个消失蛋白点，对其中 ４２ 个丰度大于 ２、差异强度大的蛋白质点采用 ＭＡＬＤＡ⁃ＴＯＦ⁃ ＭＳ 进
行肽指纹图谱分析，经数据库搜索匹配，鉴定出 ８ 个未知蛋白、７ 个假定蛋白和 ２７ 个功能蛋白，这些蛋
白参与防御反应、能量代谢、光合作用、蛋白降解、核糖体形成、信号传导、细胞运动、氮代谢等多个生理
过程，实现玉米幼苗在低温条件下的代谢平衡。
关键词：玉米；低温胁迫；蛋白表达；双向电泳
　 　 玉米是黑龙江省第一大粮食作物，２０１１ 年播种面
积近 ５６０ 万 ｈｍ２，占粮食作物总产量的 ４０％以上，播种
面积位居全国第一位，在国家粮食安全保障战略中发
挥重要作用。 地处高纬度的黑龙江省，热量资源有限，
低温冷害每 ３ ～ ４ 年发生一次，气象概率为 ２８％ ，严重
低温冷害每 ５ 年发生一次，低温导致玉米减产
２２％ ～３４％ ［１］。近些年来，随全球气候变暖，黑龙江省
成为全国气候变暖中心［２］，但气候的自然波动依然存
在，加上盲目北移和晚熟品种扩大等人为因素，低温冷
害仍存在潜在威胁［３］。
蛋白质是细胞功能的执行者，直接影响作物生长
发育。 低温胁迫会引起特异蛋白的产生， Ｂｒｉｇｇｓ 等［４］
最早在越冬期黑槐树皮中发现了 ２ ～ ３ 条新蛋白谱带，
进入 ２０ 世纪 ８０ 年代，国际上开始对低温诱导蛋白的
性质、结构和功能进行全面研究。 Ｃａｂａｎｅ 等［５］鉴定了
大豆冷响应相关蛋白，其中 １ 个为热休克蛋白 ＨＳＰ７０。
Ｓａｂｅｈａｔ 等［ ６ ］发现番茄果实通过热休克处理获得长期
耐冷性与 ＨＳＰ在体内持久性维持有关。 Ｄａｎｙｌｕｋ 等［７］
研究发现 ３ 个小麦品种受冷处理后有 １８ 个蛋白被瞬
时诱导，有 ５３ 种蛋白在诱导耐冻性所需的 ４ 周时间内
持续高水平表达，其中 ３４ 种蛋白在耐冻性最好的品系
中也有较高水平的表达。 随着蛋白质组学技术的发
展，已在油菜、菠菜、大豆、番茄、小麦、水稻、杨树等多
种植物中发现温度响应相关蛋白［８ － ９］。 这些相关蛋白
的表达是作物感受逆境信号后通过信号转导过程而调
节，进而调整自身生理状态或形态的改变来适应不利
环境。 因此，寻找与抗逆相关蛋白对了解植物抗逆机
制以及提高植物抗逆性能有着十分重要意义。
为了探求玉米苗期受低温胁迫后蛋白质代谢机
制，筛选与玉米苗期抗低温表达调控有关的关键蛋白，
本试验利用蛋白质组学技术，比较不同温度处理玉米
叶片蛋白质组变化，并对蛋白功能进行鉴定分析，以期
为玉米苗期低温胁迫相关蛋白质表达变化特征以及生
产中耐低温玉米品种选育提供理论依据。
１　 材料与方法
１． １　 材料与设计
应用 ３ 个对低温敏感程度不同品种，即耐低温型
吉单 １９８、中间型兴垦 ３ 和敏感型金玉 ５。
２４７１
　 １１ 期 玉米苗期受低温胁迫蛋白表达差异研究
采用室外盆栽播种，盆直径 ２１ｃｍ，高 ２０ｃｍ，每盆
保苗 ８ 株。 苗期正常管理。 待幼苗长至三叶一心，于
光照培养箱 ５℃下分别处理 １２ｈ和 ０ｈ，每个处理 ５ 盆，
３ 次重复。
１． ２　 试验方法
１． ２． １　 玉米幼苗叶片蛋白质的提取　 参照 Ｄａｍｅｒｖａｌ
等［１０］的方法，取长势一致新叶中部叶片 １． ０ｇ，液氮充
分研磨；加入 １０ｍＬ －２０℃预冷的丙酮溶液（含 １０％三
氯醋酸和 ０． ０７％ β －巯基乙醇）； － ２０℃沉淀过夜，离
心（４℃，１２０００ｒ·ｍｉｎ － １，１ｈ），弃上清；沉淀重悬于含 ０．
０７％β －巯基乙醇的 － ２０℃预冷的丙酮溶液里；离心
（４℃，１２０００ｒ·ｍｉｎ － １，１ｈ），取沉淀真空干燥后分装至
Ｅｐｐｅｎｄｏｆ管里， － ８０℃保存备用。
１． ２． ２　 蛋白质裂解及浓度测定
玉米叶片蛋白干粉 ２５ｍｇ 与 ０． ５ｍＬ 裂解液 （含
９ｍｏｌ·Ｌ － １脲、４％ ＣＨＡＲＰＳ、１％ ＤＴＴ 和 ０． ２５％ ＣＡ）震
荡混匀，４℃、１２０００ｒ·ｍｉｎ － １，离心 １ｈ，取 １５μＬ 上清液
用于蛋白质浓度的测定。 使用蛋白质定量试剂盒
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司），参考 Ｂｒａｄｆｏｒｄ［１１］的方法
测定蛋白浓度，４ 次重复。 用牛血清蛋白标准品配制
不同浓度的系列，考马斯亮蓝 Ｇ２５０ 显色，测定 ５９５ｎｍ
处吸光值，绘制标准曲线。 根据标准曲线计算蛋白质
浓度。
１． ２． ３　 双向凝胶电泳　 第一向等电聚焦电泳：主要参
照 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ等电聚焦系统操作指南进行。 取 ４００μｇ 叶
片蛋白样品，加上样液（９ｍｏｌ·Ｌ － １尿素，４％ ＣＨＡＰＳ，
２％ ＩＰＧ缓冲液，４０ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＤＴＴ，４０ｍｍｏｌ·Ｌ － １ Ｔｒｉｓ⁃
ｂａｓｅ）至终体积 ４５０ μＬ；放入标准型胶条槽中。 将
１７ｃｍＩＰＧ胶条胶面朝下覆盖在样品上，室温吸收 １ ｈ
后，加 ２ ｍＬ 矿物油覆盖。 ２０℃下水化 １４ ｈ，以 ５０μＡ
电流和 ２０℃聚焦温度，进行等电聚焦电泳。
第二向 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳：等点聚焦结束后，胶条依
次在平衡液Ⅰ（含 ６ｍｏｌ·Ｌ － １尿素，２％ ＳＤＳ，０． ５ｍｏｌ·
Ｌ － １ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ，ｐＨ值 ８． ８，３０％甘油，０． ２５％溴酚蓝，５％
ＤＴＴ）和平衡液Ⅱ（含 ６ｍｏｌ·Ｌ － １尿素，２％ ＳＤＳ，０． ５ｍｏｌ
·Ｌ － １ Ｔｒｉｓ– ＨＣｌ，ｐＨ 值 ８． ８，３０％甘油，０． ２５％溴酚
蓝，５． ５％ ＩＡＡ）中各平衡 １５ ｍｉｎ 后进行电泳。 电泳后
银染显色。
１． ２． ４ 　 图象的扫描和分析 　 通过 ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ
ＬａｂＳｃａｎ电泳扫描分析系统获取图像，用 ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ
ＴＭ ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ 分析软件 （ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５． ０， Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）分析。 对图像进行背景消减、斑点检测、
凝胶匹配，检出的蛋白点进行归一化处理，相同位置的
染色点进行丰度分析，通过软件计算蛋白含量变化比
值，变化比值在 ２ 倍以上的蛋白点视为表达差异点。
１． ２． ５ 　 ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦ⁃ＭＳ 质谱分析与数据检索 　 制备
好样品送上海基康公司进行质谱检测，检测仪器：
Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅ ＭＡＬＤＴ⁃ＴＯＦ⁃ＭＳ 质谱仪。 数据检索：质
谱峰人工去除胰酶自切峰和角蛋白峰的污染后，将数
据用 ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ． ｃｏｍ 的在线软件进行
搜索匹配。
２　 结果与分析
２． １　 玉米叶片蛋白质双向电泳分析
利用双向电泳技术对经提取的各处理玉米幼苗叶
片总蛋白进行分离，获得背景清晰且分离效果较好的
２ － ＤＥ 图谱（图 １）。 经 ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ ＴＭ ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ
软件检测，每个蛋白双向电泳凝胶图谱上均检测到 ２
６００ 多个有效蛋白点，重复样品图谱间的相关系数
（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）在 ０． ９０ ～ ０． ９５ 之间。 软件统
计学分析表明，３ 个品种图谱存在显著差异的蛋白点
为 ４２０ 个。 吉单 １９８、兴垦 ３ 和金玉 ５ 图谱中发生显著
变化的蛋白点分别为 １２３、１５５ 和 １４２ 个。 吉单 １９８ 中
６７ 个蛋白点被上调，５１ 个被下调，５ 个新增蛋白点。
兴垦 ３ 中 ８３ 个蛋白点被上调，５７ 个被下调，１１ 个新增
点，３ 个消失蛋白点。 金玉 ５ 中 ８２ 个蛋白点被上调，
４８ 个被下调，１２ 个新增的蛋白点。
２． ２　 差异表达蛋白点的质谱鉴定
既符合定量分析又符合统计学分析的差异蛋白点
为 ８３个，选取其中丰度大于 ２、分离效果清晰的 ４２个点
进行质谱鉴定（蛋白点相对丰度表略）。 ＭＡＬＤＡ⁃ＴＯＦ⁃
ＭＳ分析 ４２个差异蛋白质点，均获得肽指纹图谱。 差异
蛋白点质谱鉴定结果见表 １，其中，８ 个未知蛋白（蛋白
点 ６、１２、１３、１７、２０、２３、３１、３２）、７ 个假定蛋白（蛋白点 ５、
１０ 、１６、２６、２９、３０、４０）和 ２７ 个功能蛋白。 图 ３ 为其中
ＡＴＰ合酶 ＣＦ１β亚基（点 Ｐ２２）肽质量指纹图谱。
３　 讨论
关于植物逆境胁迫下特异蛋白及相关基因筛选已
有研究报道［１２ － １３］。 Ｉｍｉｎ Ｎ等［１４］研究发现在幼嫩小孢
子阶段 １２℃低温处理 ４ｄ后有 ７０ 个差异显示蛋白，其
中新诱导蛋白 １２ 个，上调蛋白 ４７ 个，下调蛋白 １１ 个。
本研究通过 ３ 个不同低温敏感玉米品种幼苗叶片低温
处理蛋白质组分析，共鉴定出 ２７ 个功能蛋白，参与防
御反应、能量代谢、光合作用、蛋白降解、核糖体形成、
信号传导、细胞运动、氮代谢等。 ３ 个类型品种中，耐
３４７１
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
　 　 　 　
注：Ａ、Ｂ为吉单 １９８ 对照和 ５℃低温处理叶片蛋白质双向电泳图谱。 Ｃ、Ｄ为兴垦 ３ 对照和 ５℃低温处理叶片蛋白质双向电
泳图谱。 Ｅ、Ｆ为金玉 ５ 对照和 ５℃低温处理叶片蛋白质双向电泳图谱。
Ｎｏｔｅ：Ａ，Ｂ：２ － ＤＥ ｇｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ５℃ ｓａｍｐｌｅ ｆｏｒ Ｊｉｄａｎ１９８；Ｃ、Ｄ：２ － ＤＥ ｇｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ５℃
ｓａｍｐｌｅ ｆｏｒ Ｘｉｎｇｋｅｎ３；Ｅ、Ｆ：２ － ＤＥ ｇｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ５℃ ｓａｍｐｌｅ ｆｏｒＪｉｎｙｕ５．
图 １　 玉米叶片蛋白质组的双向电泳图谱
Ｆｉｇ． １　 Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ２ － ＤＥ ｇｅｌｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｌｅａｖｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
４４７１
　 １１ 期 玉米苗期受低温胁迫蛋白表达差异研究
表 １　 叶片 ２ － ＤＥ图谱部分蛋白点初步鉴定结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｏｆｌｅａｖｅｓ
品种
Ｃｕｌｔｉｖａｒｓ
蛋白点
Ｓｐｏｔ
序列号
Ｎｏ．
分子量
Ｍａｓｓ
分值
Ｓｃｏｒｅ
匹配蛋白
Ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｍｅ
吉单 １９８ １ ｇｉ ｜１６２４６４３２１ ３５５６７ ２００ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ
‘Ｊｉｄａｎ １９８’ ２ ｇｉ ｜１６７２３５７１２ ３５５９４ １６４ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｎａｓｅ
３ ｇｉ ｜１５７４１４７６２ １４５６２ １２０ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＰＰ１⁃ＷｓＣ
４ ｇｉ ｜２８４５２５３１ ５２０４３ １０１ ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ
５ ｇｉ ｜２１２７２２２９０ ３１８０３ １３６ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００１９４０２９
６ ｇｉ ｜１２４６９９１５９ ２６９２５ ７９ ｕｎｋｎｏｗｎ
７ ｇｉ ｜１１４６７１９９ ５４１５７ ８１ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＣＦ１ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ
８ ｇｉ ｜１５２６０６１８１ ５４２１３ ９７ ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ⁃１，７⁃ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
９ ｇｉ ｜１１０９１５６１０ ４９３７２ １７８ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ
１０ ｇｉ ｜２２６５０７９８２ ３０６９７ ３４４ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００２７６０４７
兴垦 ３ １１ ｇｉ ｜７２２８７ ２５４６５ ８４ ｂｅｔａ⁃ｇｌｏｂｕｌｉｎ ａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
‘Ｘｉｎｇｋｅｎ ３’ １２ ｇｉ ｜１６９９１５２９ １９２５２ １０２ ｕｎｋｎｏｗｎ
１３ ｇｉ ｜２２３９４２６１３ １８０４２ ９７ ｕｎｋｎｏｗｎ
１４ ｇｉ ｜２２６４９３１９３ １４８９５ １２９ ａｂｓｃｉｓｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２
１５ ｇｉ ｜２８４５１５３１ ５２０４３ ５９ ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ
１６ ｇｉ ｜３０８０４４２０７ １６４４２ ３８１ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００５０１５６０
１７ ｇｉ ｜１９４６９９１４０ １９０４５ ４７９ ｕｎｋｎｏｗｎ
１８ ｇｉ ｜２２６５３３２４８ ２７１７４ １９７ ｐｌａｓｔｉｄ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ２
１９ ｇｉ ｜１９５６３４６５９ ４１７５２ １３７ ｆｒｕｃｔｏｓｅ⁃ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ
２０ ｇｉ ｜２１９８８６８２１ ４６８２８ ２２６ ｕｎｋｎｏｗｎ
２１ ｇｉ ｜１５９１０６８７１ ５３７８３ １８８ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＣＦ１ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ
２２ ｇｉ ｜１１４６７１９９ ５４００７ １３９ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＣＦ１ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ
２３ ｇｉ ｜２３８９０８８８３ ３００９７ ３４７ ｕｎｋｎｏｗｎ
２４ ｇｉ ｜１５２６０６１８１ ５４２１３ １９５ ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ⁃１，７⁃ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
２５ ｇｉ ｜４９６００５１ １５３６６１ １５９ ｍｙｏｓｉｎ ＸＩ
金玉 ５ ２６ ｇｉ ｜２４２０８４９３６ ４１８４３ ８４ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｒｏｔｅｉｎ ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０８ｇ００４５００
‘Ｊｉｎｙｕ ５’ ２７ ｇｉ ｜２０５９７ ４７６９８ １０２ ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
２８ ｇｉ ｜１５２６０６１８１ ５４２１３ １４９ ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ⁃１，７⁃ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
２９ ｇｉ ｜２２６５０６０５２ ３８０７１ ２１０ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００２７６３７０
３０ ｇｉ ｜２４２０４８２９８ ３７６９０ １２９ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０２ｇ００９９７０
３１ ｇｉ ｜２２６４９２２０１ ４１７２４ １０８ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００２７３１９６
３２ ｇｉ ｜２１９８８４５５１ ４７７１２ ２０９ ｕｎｋｎｏｗｎ
３３ ｇｉ ｜１１８５６６６ １５９６５ ２０５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ⁃ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
３４ ｇｉ ｜１１４６７１９９ ５４１５７ １１２ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＣＦ１ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ
３５ ｇｉ ｜７２２８７ ２９４６５ ８４ ｂｅｔａ⁃ｇｌｏｂｕｌｉｎ ａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
３６ ｇｉ ｜２６９９１３３２８ １５７６２ １０９ ＡＢＡ， ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
３７ ｇｉ ｜９８４５３２５ ５６３２４ ８５ ＡＴＰａｓｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ
３８ ｇｉ ｜２８５３２２ ２５４７５ １０４ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
３９ ｇｉ ｜ ２８４５１５３１ ５２０４３ １９５ ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ
４０ ｇｉ ｜２２６５０７９８２ ３０６９７ ３４４ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００２７６０４７
４１ ｇｉ ｜１１０９１５５８８ ５０８０１ １７６ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ
４２ ｇｉ ｜２８５３２ ２５４６８ ８９ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
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核　 农　 学　 报 ２７ 卷
注：切取的蛋白点经胰蛋白酶酶解后进行 ＭＡＬＤＩ － ＴＯＦ质谱分析，利用 Ｍａｓｃｏｔ软件查询肽质量指纹图谱数据库，查询物种为玉米。 鉴定
结果为 ＡＴＰ合酶 ＣＦ１β亚基。
Ｎｏｔｅ： Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｃｉｓｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｌｓ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｅｄ ｂｙ ＭＡＬＤＩ － ＴＯＦ． ＰＭＦ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｗａｓ
ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｓｃｏｔ ｐｒｏｇｒａｍ． Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔａｋｉｎｇ Ｚｅａ ｍａｙｓ ａｓ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＣＦ１ ｂｅｔａ
ｓｕｂｕｎｉｔ ａｆｔｅｒ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ．
图 ２　 ＡＴＰ合酶 ＣＦ１β亚基（点 Ｐ２２）肽质量指纹图谱
Ｆｉｇ． ２　 ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＣＦ１ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ（ｐｏｉｎｔ ２２ ） ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
低温品种功能蛋白表达率最高，敏感型品种表达率最
低，表明功能蛋白表达与温度敏感程度存在相关关系。
３． １　 与抗性有关的蛋白
蛋白点 ３ 被鉴定为类似抗性蛋白 （ ｄｉｓｅａｓｅ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＰＰ１ － ＷｓＣ），有研究指出抗病的植
株会有这种蛋白，当外界出现胁迫时，诱导这种抗性蛋
白的变化［１５］。 郝强等［１６］在北海道黄杨叶片低温胁迫
中发现了这种蛋白的应答表达。 本试验也获得类似结
果，低温下此蛋白点表达量上调，表明在低温逆境下作
物存在一个反馈回路，控制着细胞程序性死亡和植株
抗性反应的程度。
蛋白点 ３８、４２ 为几丁质酶（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）。 几丁质酶
广泛存在于多种生物中。 具有抗冰冻损伤的能力，在
冷驯化过程中直接作用于对冰冻胁迫的调节［１７］。
３． ２　 与能量有关蛋白
蛋白点 １ 和 ２ 被鉴定是胞质苹果酸脱氢酶
（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ｃｙｔｏｐｌａｓｍｃ），其调控三羧酸循
环。 本研究表明 ｃＭＤＨ上调，说明低温胁迫可能影响
三羧酸循环。 李友勇等［１８］在小麦转换系中发现，胞质
苹果酸脱氢酶蛋白表达丰富，认为其表达可能受其上
游温度感应子调控。 前面试验已经证实低温使 ＣＯ２浓
度增加，从而抑制了三羧酸循环的正常运行，使 ｃＭＤＨ
发生变化。
蛋白点 ７、 ２１、 ２２、 ３４ 为 ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＣＦ１ ｂｅｔａ
ｓｕｂｕｎｉｔ － － ＡＴＰ 合酶 ＣＦ１β 亚基，这是 ３ 个品种共有
的差异蛋白点。 ＡＴＰ合酶 ＣＦ１β亚基能够催化 ＡＴＰ的
合成和水解，３ 个品种低温胁迫下光合作用减弱，ＡＴＰ
合酶 ＣＦ１β 亚基表达量也随之下降，表明玉米光合系
统遭到破坏成为低温下品种共性特征。
蛋白点 ３７ 为 ＡＴＰａｓｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ － － ＡＴＰ α 亚
基，蛋白点 ９、４１ 为 ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ － － ＡＴＰ
合酶 β 亚基。 ＡＴＰ 是生物体内的“能量通货”，依靠
ＡＴＰ 合酶催化合成。 Ｆ －型 ＡＴＰ 合酶（Ｆ１Ｆｏ － ＡＴＰ 合
酶）是参与能量代谢的关键酶，它利用跨膜质子动力
势通过光合磷酸化或氧化磷酸化反应将 ＡＤＰ和 Ｐｉ 合
成 ＡＴＰ。 本试验结果可表明低温胁迫下影响了 ＡＴＰ
合酶 ＣＦ１ 的 α、β亚基上具有核苷酸结合和催化位点，
使 ＡＴＰ亲水部位改变。 蛋白点 １９ 是果糖二磷酸醛缩
酶（ｆｒｕｃｔｏｓｅ － ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ）。 Ｊｏｒｇｅ 等［１９］在研
究圣栎（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｉｌｅｘ Ｌ． ）叶片蛋白质组应答干旱胁迫
时也发现 ＦＢＰａｓｅ 增强表达。 本试验观察到的玉米幼
苗叶片低温下蛋白点 １９ 表达量增加的结果与之一致。
３． ３　 与光合有关的蛋白
蛋白点 ８、 ２４、 ２８ 是景天庚酮糖二磷酸酶
（ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ － １，７ － ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ），这是又一个 ３
个品种共有的差异蛋白点。 ＳＢＰａｓｅ 活性降低阻碍了
６４７１
　 １１ 期 玉米苗期受低温胁迫蛋白表达差异研究
ＲｕＢＰ再生，从而限制了光合碳同化，最终导致植物光
合能力的下降。 本研究发现，低温胁迫下 ＳＢＰａｓｅ 表达
量下调，这可能来自于胁迫下 ＳＢＰａｓｅ 的降解，最终表
现在玉米幼苗净光合速率和气孔导度的下降。
蛋白点 ４ 和 １５、３９ 是 Ｒｕｂｉｓｃｏ 大亚基。 Ａｈｓａｎ
等［２０］曾在研究番茄叶片应答水分缺失胁迫时发现
ＲｕＢｉｓＣＯ和 ＲｕＢｉｓＣＯ活化酶出现下调表达，推测 ＲＯＳ
促进 ＲｕＢｉｓＣＯ或 ＲｕＢｉｓＣＯ活化酶的降解，其可能参与
了水分缺失及其他环境胁迫下叶片衰老时的分子应
答。 本试验也证实了这个结论，即低温胁迫下，造成
Ｒｕｂｉｓｃｏ发生裂解。 这与低温胁迫下导致玉米叶片光
合速率下降相一致，表明光合系统受到破坏。
３． ４　 与蛋白降解有关的蛋白
蛋白点 １１、３５ 为 β球蛋白前体 （ｂｅｔａ － ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）。 Ｉｍｉｎ 等［１４］通过蛋白质组学研究发现，水
稻花粉囊在低温胁迫下也存在蛋白降解现象，并鉴定
出 ７ 种蛋白降解产物。 Ｔａｙｌｏｒ等［２１］也发现低温胁迫下
豌豆线粒体内的甘氨酸脱氢酶也会发生降解。 本试验
也出现相类似结果，有 ２ 个蛋白点被鉴定为 β －球蛋
白，它们可能都是球蛋白降解的中间产物。 表明低温
胁迫会加速细胞蛋白的降解。
３． ５　 与核糖体形成有关的蛋白
蛋白点 １８ 为特定的质体核糖体蛋白（ ｐｌａｓｔｉｄ －
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）。 很多核糖体蛋白受
低温条件的诱导，在大豆中发现了 ３ 个受低温胁迫诱
导的核糖体蛋白［２２］。 从以上结果可以看出，参与蛋白
质翻译的不同蛋白在低温胁迫下的表达模式是不一样
的，这进一步说明了蛋白质翻译的调控是很复杂的，具
体影响还有待进一步研究。
３． ６　 与氮代谢有关的蛋白
蛋白点 ２７ 为天冬氨酸转氨酶 （ ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），天冬氨酸转氨酶是一类广泛存在于生物
细胞内的转氨酶，在氮代谢中起到非常重要的作用。
温度影响酶结合不同底物亲和能力。 酶与底物亲和能
力的提高，则可能提高酶对底物的反应速率。 本试验
说明低温胁迫下影响了天冬氨酸转氨酶结合底物的亲
和能力。
３． ７　 与信号传导有关的蛋白
蛋白点 １４ 为 脱落酸促成熟蛋白（ ａｂｓｃｉｓｉｃ ｓｔｒｅｓｓ
ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２），蛋白点 ３６ 为脱落酸促成熟蛋白
（ＡＢＡ － ， ｓｔｒｅｓｓ － ａｎｄ ｆｒｕｉｔ － ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ － ｌｉｋｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ）。 脱落酸是植物体内抗逆基因表达的＂第一信
使＂ ，可有效激活植物体内抗逆免疫系统。 低温胁迫
下，脱落酸含量增高可能诱导脱落酸促成熟蛋白的增
加来抵御低温。
蛋白点 ３３ 为蛋白磷酸酶 ２Ｃ 类的蛋白 （ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ － ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）。 蛋白磷酸酶 ２Ｃ是植物
中最大一类蛋白磷酸酶，参与很多信号转导途径。
ＡＢＡ信号途径在低温胁迫反应中起非常重要的作用，
而蛋白磷酸酶 ２Ｃ是 ＡＢＡ 信号转导中的负调节因子。
通过信号转导途径，植物可进一步调节基因的表达水
平。
３． ８　 与细胞运动有关的蛋白
蛋白点 ２５ 为肌浆球蛋白（ｍｙｏｓｉｎ ＸＩ）。 有研究表
明，贻贝（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）鳃组织在多氯联苯等胁迫下
被检测出诱导的差异蛋白表达信号，为肌浆球蛋
白［２３］，说明外界环境胁迫诱导了肌浆球蛋白表达。 许
多肌浆球蛋白通过生物化学隔离、分子克隆、基因序列
分析被鉴定在许多生物体中，只有少量的在细胞中特
殊功能未知。 本试验结果表明低温可能使细胞液的流
动性减弱，导致肌浆球蛋白的变化。 已经被假定为有
促进细胞质移动功能，迄今肌浆球蛋白被了解到这种
程
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Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｌｏｗ － ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ － ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
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ｉｎ ｂｌｕｅ ｍｕｓｓｅｌｓ （Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ） ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ： ａ
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Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｕｎｄｅｒ Ｌｏｗ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
Ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ｍａｉｚｅ Ｓｅｅｄｌｉｎｇ
ＹＡＮＧ Ｍｅｎｇ１ 　 ＺＨＵＡＮＧ Ｗｅｎ⁃ｆｅｎｇ２ 　 ＷＥＩ Ｓｈｉ１ 　 ＧＵ Ｗａｎ⁃ｒｏｎｇ１ 　 ＹＡＮＧ Ｙｅ１
ＷＡＮＧ Ｍｅｎｇ１ 　 ＬＩ Ｊｉｎｇ１
（ １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　 １５００３０；
２Ｈａｒｂｉｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　 １５００７０）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｋｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ
ｏｆ ‘Ｊｉｄａｎ １９８’， ‘Ｘｉｎｇｋｅｎ ３’ ａｎｄ ‘Ｊｉｎｙｕ ５’ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ２⁃
ＤＥ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ２３２ ｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ， １５６ ｄｏｗｎ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ， ２８ ｎｅｗ ａｄｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ
ａｎｄ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ⁃ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ． ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦ⁃ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ８ ｕｎｋｎｏｗｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ７ ａｓｓｕｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ２７ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｓｏｍｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，
ｓｉｇｎａｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｃｅｌｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｍａｉｚｅ
ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍａｉｚｅ； Ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ； Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； Ｔｗｏ⁃ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
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