全 文 ：核 农 学 报　 ２０１３ꎬ２７(６):０７８２ ~ ０７８５
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期:２０１２￣０９￣２４　 接受日期:２０１２￣０３￣３１
基金项目:中国农业科学院科技经费项目 (２０１２１１)
作者简介:李淑英(１９７９￣)ꎬ女ꎬ内蒙古鄂尔多斯人ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向为微生物生化与分子生物学ꎮ Ｔｅｌ: ０１０￣６２８１１２７４ꎻＥ￣ｍａｉｌ:
ｌｉｓｈｕｙｉｎｇ＠ ｃａａｓ. ｃｎ
通讯作者:唐选明(１９６３￣)ꎬ男ꎬ山东菏泽人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ研究方向为食品科学ꎮ Ｔｅｌ: ０１０￣６２８１１８６８ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｔａｎｇｘｕａｎｍｉｎｇ＠ ｃａａｓ. ｃｎ
文章编号:１０００￣８５５１(２０１３)６￣０７８２￣０４
６０ Ｃｏ￣γ射线辐照诱变筛选纳豆激酶高活耐热菌株
李淑英１ 　 聂　 莹１ 　 杜　 欢１ 　 赵仲麟２ 　 马　 鑫３ 　 李　 燕４ 　 唐选明
( １ 中国农业科学院农产品加工研究所ꎬ北京　 １００１９３ꎻ ２河南农业大学理学院ꎬ
河南 郑州　 ４５０００２ꎻ３ 中国农业科学院信息研究所ꎬ北京　 １０００８１ꎻ
４郑州轻工业学院食品与生物工程学院ꎬ河南 郑州　 ４５０００２)
摘　 要:为得到高活热稳定性的纳豆激酶生产菌ꎬ本研究采用６０Ｃｏ￣γ射线辐照诱变纳豆激酶生产菌ꎬ以酪
蛋白平板法作为活性筛选方法ꎮ 经过辐照剂量筛选确认 ８００ Ｇｙ为最适诱变剂量ꎬ在该剂量下正突变率
最大ꎬ高达 ４５％ ꎮ 经过 ８００ Ｇｙ诱变共得到 ６０ 株活性提高的菌株ꎮ 不同温度热处理后ꎬ１１ 株菌在 ６５℃
显示了很好的热稳定性ꎮ
关键词:纳豆激酶ꎻ枯草芽孢杆菌ꎻ高活性ꎻ热稳定性
　 　 血栓疾病严重危害人类的身体健康ꎬ其发病率和
死亡率居各种疾病之首ꎬ随着血栓危害性增大ꎬ溶栓药
物的研究成为当今的热点ꎮ 纳豆激酶(Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅꎬ
ＮＫ)是由枯草芽孢杆菌分泌的高效纤维蛋白溶解酶ꎬ
最早发现于传统的日本大豆发酵产品—纳豆[１]ꎮ 纳
豆激酶属于碱性丝氨酸蛋白酶ꎬ可以直接溶解交联状
的血栓块ꎬ催化体内血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维
蛋白溶酶ꎬ增加血栓溶解因子的合成ꎬ失活纤维蛋白溶
解抑制剂[２ － ５]ꎮ 与血栓临床溶栓药物相比ꎬ纳豆激酶
具有 ｐＨ值和温度稳定性ꎬ在胃肠道中可稳定存在ꎬ具
有可以口服、高效、半衰期长、价格低廉等优点[６]ꎮ
通过菌种选育提高纳豆激酶的活力以及酶的热稳
定性是目前研究的主要途径ꎮ 夏丽等[７]通过紫外线直
接照射涂菌蛋白平板ꎬ筛选得到一个高产突变株ꎬ其纤
溶活性比出发菌株提高了 ８􀆰 ８１％ꎮ 关志伟等[８]通过盐
酸羟胺和紫外线复合诱变获得一株高产纳豆激酶突变
株ꎬ其产酶活性比野生菌提高了 ６８％ꎮ 刘新梅等[９]通
过对纳豆菌原生质体紫外诱变得到一株高产纳豆激酶
菌株ꎬ其发酵液的酶活力比诱变前提高了 ７４􀆰 ５％ꎬ克隆
突变菌株纳豆激酶编码基因ꎬ构建酵母表达菌株ꎬ对表
达蛋白进行分离纯化ꎬ６５℃处理纯化蛋白 １５ｍｉｎ 后ꎬ突
变酶热稳定性提高了 ２０％ꎬ酶活力提高了 １６􀆰 ６％ꎮ
　 　 ６０Ｃｏ￣γ射线是一种高能电磁波ꎬ其产生的电离作
用可以直接或间接改变 ＤＮＡ结构ꎬ是微生物育种的常
用方法ꎮ 费笛波等[１０]通过６０Ｃｏ￣γ 射线辐照诱变芽孢
杆菌使其产 β －葡聚糖酶活力比出发菌株提高 ３０％以
上ꎮ 本研究通过６０Ｃｏ￣γ射线对实验室保存的纳豆激酶
生产菌进行选育ꎬ以期从基因水平上改变纳豆激酶的
结构ꎬ得到活性和热稳定性提高的纳豆激酶突变株ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种　 菌株:ＢＳＮＫ￣５ꎬ中国农业科学院农产品
加工研究所实验室保存ꎬ由作者分离于我国黑豆豆豉
的纳豆枯草芽孢杆菌ꎮ
１􀆰 １􀆰 ２　 主要试剂　 酪蛋白购于 Ｓｉｇｍａ 公司ꎬ其余试剂
均为国产分析纯ꎮ
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基　 种子和液体发酵培养基:ＬＢ 培养基ꎮ
筛选培养基:酪蛋白平板培养基ꎻ配方:酪蛋白 １％ 、酵
母提取物 ０􀆰 ５％ 、ＮａＣｌ ０􀆰 ９％ 、琼脂 ２％ ꎬｐＨ 值 ７􀆰 ２ ~
７􀆰 ４ꎬ１２１℃灭菌 ２０ｍｉｎꎬ现配现用ꎮ
２８７
　 ６ 期 ６０Ｃｏ￣γ射线辐照诱变筛选纳豆激酶高活耐热菌株
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 活力测定方法 　 酪蛋白平板法ꎬ参照武金霞
等[１１]的方法ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 菌悬液制备 　 从活化好的 ＢＳＮＫ￣５ 平板接种
单菌落到 ２０ｍＬ ＬＢ液体培养基ꎬ３０℃培养到对数生长
期ꎬ离心收集菌体(６０００ｒ􀅰ｍｉｎ － １ꎬ５ｍｉｎ)ꎬ生理盐水清洗
２ 次ꎬ用等体积生理盐水溶解ꎬ备用ꎬ菌液浓度约为 １􀆰 ５
× １０６ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 ６０Ｃｏ￣γ 射线辐照诱变 　 取 １ｍＬ 上述菌液ꎬ加
入 ９ｍＬ生理盐水ꎬ准备 ６ 管ꎬ设置 ６ 个辐照梯度(４００、
８００、１２００、１６００、２０００、２４００ Ｇｙ)送北京大学化学与分
子工程学院应用化学系进行辐照诱变ꎮ
将未照射菌液和不同剂量辐照诱变菌液进行倍比
稀释ꎬ取 １００μＬ 涂酪蛋白平板ꎬ每个梯度涂 １０ 个酪蛋
白平板ꎬ３０℃过夜培养ꎮ 次日取出ꎬ选合适的浓度梯度
进行菌落计数和溶解圈表型观察ꎬ计算辐照诱变的致
死率ꎮ
辐照诱变致死率 / ％ ＝ Ａ － ＢＡ × １００％
Ａ:未经诱变平板菌落数ꎬＢ:诱变后平板菌落数
１􀆰 ２􀆰 ４　 目标菌株筛选　 高活菌株初筛:随机选取照射
后生长菌株点酪蛋白平板ꎬ以未经照射菌株为对照ꎬ
３０℃过夜培养 １２ ~ １４ ｈ 取出ꎬ选取正突变株(即酪蛋
白平板溶解圈直径与菌落直径比值比对照菌株溶解圈
直径与菌落直径比值增大 １０％的菌株)ꎬ重复点酪蛋
白平板多次ꎬ进行溶解圈观察ꎬ计算正突变率ꎮ
正突变率 / ％ ＝ 正突变菌株点板菌落数 × １００％
　 　 高活菌株复筛:将最终确认稳定菌株用 ３ｍＬ ＬＢ
液体培养基在 ３０℃ꎬ２２０ｒ􀅰ｍｉｎ － １培养 ５ｈꎬ取发酵液
１０μＬ点酪蛋白平板ꎬ３０℃培养 １８ ｈꎬ计算溶解圈面积ꎬ
选取诱变菌株溶解圈面积比对照菌溶解圈面积增大
１０％的菌株进行热稳定性分析ꎮ
热稳定性菌株筛选:将筛选菌株发酵液经 ３７、５５、
６０ 和 ６５℃处理 １５ｍｉｎꎬ酪蛋白平板检测活性ꎬ计算溶
解圈面积ꎬ将热处理后溶解圈面积比对照菌株大的菌
株作为正突变菌株ꎮ
将 ３７℃各个菌株的活性记为 １００ꎬ对照菌株经不
同温度处理后相对于 ３７℃的活性记为 Ａꎬ其余菌株不
同温度处理后相对于其 ３７℃的活性记为 Ｂꎬ每个菌株
不同温度的热稳定性计算公式如下:
热稳定性 / ％ ＝ Ｂ － Ａ１００ × １００％
注:Ａ和 Ｂ取相同温度处理的数值
２　 结果与分析
２􀆰 １　 不同辐照剂量对菌株 ＢＳＮＫ￣５ 致死率及正突变
率的影响
按 １􀆰 ２􀆰 ３ 的操作方法ꎬ按不同剂量对 ＢＳＮＫ￣５ 菌
液进行辐照诱变ꎬ统计平板菌落数ꎬ以未经诱变的菌液
涂平板长出的菌落数为对照ꎬ计算致死率ꎬ比较不同剂
量照射对菌株 ＢＳＮＫ￣５ 的影响ꎮ 以辐照剂量为横坐
标ꎬ致死率为纵坐标绘制辐照诱变致死率曲线图ꎬ如图
１ 所示ꎮ
图 １　 辐照诱变致死率曲线图
Ｆｉｇ. １　 Ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄｏｓａｇｅ
由图 １ 可知致死率随着诱变剂量增加而提高ꎬ当
诱变剂量为 ２４００ Ｇｙ时菌体致死率高达 ９２％ ꎮ
随机挑取经不同剂量辐照诱变再生菌落各 １２０ 株
点酪蛋白平板ꎬ３０℃过夜培养 １２ ｈ 取出ꎬ测量溶解圈
直径和菌落直径ꎬ按照 １􀆰 ２􀆰 ４ 公式计算不同剂量的正
突变率ꎮ 绘制不同剂量下的正突变率曲线ꎬ如图 ２ 所
示ꎮ
图 ２　 正突变率曲线
Ｆｉｇ. ２　 Ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
３８７
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
　 　 由图 １ 和图 ２ 可知ꎬ随着照射剂量增加ꎬ致死率逐
渐增大ꎬ辐照剂量为 ８００ Ｇｙ 时正突变率最大ꎬ高达
４５％ ꎬ因此采用 ８００ Ｇｙ为最佳辐照剂量进行筛菌ꎮ
２􀆰 ２　 ＢＳＮＫ￣５ 的诱变结果分析
２􀆰 ２􀆰 １　 高活菌株筛选　 利用 ８００ Ｇｙ 辐照 ＢＳＮＫ￣５ 菌
株ꎬ酪蛋白平板法筛菌ꎬ选取溶解圈直径与菌落直径比
值大于对照菌 １０％的菌株 ５ 次点酪蛋白平板ꎬ验证稳
定性ꎬ共得到 １７４ 株活性增加的菌株ꎮ 将选取的 １７４
株菌 ３ ｍＬ 液体发酵ꎬ取发酵液 １０ μＬ 点酪蛋白平板ꎬ
测溶解圈直径ꎬ计算溶解圈面积ꎬ共计得到 ６０ 株活性
增加菌株ꎮ
２􀆰 ２􀆰 ２　 热稳定性菌株筛选　 将 ６０ 株高活菌株发酵液
分别经 ３７、５５、６０ 和 ６５℃处理 １５ ｍｉｎꎬ酪蛋白平板测
溶解圈直径ꎬ计算溶解圈面积ꎮ ３７、５５、６０ 和 ６５℃处理
１５ｍｉｎ后ꎬ与对照菌株相比溶解圈面积增加的菌株数
分别为 ４６、３９、３８ 和 １１ 株ꎮ 以 ６５℃仍保留较高活性
(溶解圈面积大于对照菌株)统计ꎬ共计得到 １１ 株热
稳定性较好的菌株ꎬ结果如图 ３、图 ４ꎮ
图 ３　 筛选菌株热稳定性分析
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ
图 ４　 筛选菌株热稳定性分析
Ｆｉｇ. ４　 Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ
由图 ３、图 ４ 结果可见随着处理温度升高ꎬ溶解圈面积
减小ꎬ热稳定性降低ꎮ ５５℃处理活性变化不大甚至增
加的菌株有 ９０、９６、１５７、１７２ 和 １７４ꎮ 热稳定性最好的
菌株为 １７２ꎬ与对照相比ꎬ菌株 １７２ 在 ５５、６０ 和 ６５℃水
浴处理 １５ ｍｉｎꎬ热稳定性分别提高 ６０􀆰 ２７％ 、６４􀆰 ３９％
和 ４６􀆰 ０２％ ꎮ
３　 讨论
纤维蛋白平板法是常用的纳豆激酶活性测定方
法ꎬ但该方法铺板繁琐ꎬ试剂成本高ꎬ且纤维蛋白原不
易溶解ꎬ极易沉淀ꎬ凝血酶易失活ꎬ两者反应形成血纤
维的批次差异较大ꎬ造成实验误差增大ꎮ 根据纤维蛋
白酶能水解酪蛋白的特点ꎬ本研究选用酪蛋白法作为
辐照诱变的筛选方法ꎮ 研究证实该方法与纤维蛋白平
板法相比ꎬ具有铺板简便ꎬ灵敏度高、成本低廉等优
点[１１]ꎮ
很多研究者已经成功的应用紫外ꎬ或者紫外与化
学试剂复合诱变的方法成功的提高了纳豆菌生产纳豆
激酶的活力[７ － ８]ꎮ 与紫外诱变、化学诱变或二者的复
合诱变育种方法相比ꎬ６０Ｃｏ￣γ射线辐照强度大ꎬ致突变
率高ꎬ使用该方法育种极易获得基因水平的突变菌株ꎬ
大大减小了筛菌工作量ꎮ 本研究采用６０Ｃｏ￣γ射线辐照
诱变 ＢＳＮＫ￣５ꎬ确定最适诱变剂量为 ８００ Ｇｙꎬ在该剂量
下正突变率最大ꎬ高达 ４５％ ꎮ 经过 ８００ Ｇｙ 诱变后ꎬ获
得纳豆激酶活性提高的菌株 ６０ 株ꎬ热稳定性提高的菌
株 １１ 株ꎬ远优于以上方法的结果ꎮ
在现有工作的基础上ꎬ本研究下一步将克隆筛选
菌株的纳豆激酶编码基因ꎬ经过测序确认突变位点ꎬ对
于确认基因突变的菌株ꎬ进行下一轮辐照诱变ꎬ寻找更
多的活性位点ꎬ随后对活性位点进行深入的催化机理
研究ꎮ
４　 结论
辐照诱变是一种极易从基因水平改变菌株性状ꎬ
导致菌株永久突变的有效手段ꎻ本研究采用 ８００ Ｇｙ 辐
照处理菌株 ＢＳＮＫ￣５ꎬ在该剂量下正突变率高达 ４５％ ꎬ
结合 ６５℃热处理ꎬ共得到 １１ 株活性和热稳定性提高
的纳豆激酶突变菌株ꎮ
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Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ
Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ ｂｙ ６０ Ｃｏ γ￣ｒａｙ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ
ＬＩ Ｓｈｕ￣ｙｉｎｇ１ 　 ＮＩＥ Ｙｉｎｇ１ 　 ＤＵ Ｈｕａｎ１ 　 ＺＨＡＯ Ｚｈｏｎｇ￣ｌｉｎ２ 　 ＭＡ Ｘｉｎ３ 　 ＬＩ Ｙａｎ４ 　 ＴＡＮＧ Ｘｕａｎ￣ｍｉｎｇ１
( １ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ　 １０００８１ꎻ
２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕꎬ Ｈｅｎａｎ　 ４５０００２ꎻ ３Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１ꎻ ４Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕꎬ Ｈｅｎａｎ　 ４５０００２)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ｗａｓ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｂｙ ６０Ｃｏ γ￣ｒａｙꎬ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｃａｓｅｉｎ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｇｅｔ ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｒａｉｎｓ. ６０ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｂｙ
８００ Ｇｙ ６０Ｃｏ γ￣ｒａｙ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｄｏｓｅꎬ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４５％ . Ｔｈｅｎ ６０ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｅｍｐｒｅｔｕｒｅ ａｎｄ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔ ６５℃ .
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅꎻ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓꎻ Ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙꎻ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ
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