全 文 ：核 农 学 报　 ２０１４，２８（１２）：２１８４ ～ ２１９１
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１４⁃０７⁃０２　 接受日期：２０１４⁃０９⁃２０
基金项目：农业部转基因生物新品种培育重大专项（２００８ＺＸ０８００８ － ００３，２００９ＺＸ０８００８ － ００８Ｂ），甘肃省高校基本科研业务费：转 ｆａｔ － １ 基因高品
质肉羊新品种的培育，甘肃农业大学动物医学院创新基金项目（ＪＹＣＸ⁃ＫＸ００７）
作者简介：常卫华，男，主要从事临床兽医学产科方向研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｈａｎｇｗｅｉｈｕａ１１２＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：张勇，男，教授，主要从事兽医产科学和发育生物学的研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｏｎｇ＠ ｇｓａｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）１２⁃２１８４⁃０８
绵羊卵巢 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的克隆及表达分析
常卫华１ 　 胡俊杰１ 　 王娟红２ 　 曹会萍２ 　 马友记３ 　 张　 勇１ 　 赵兴绪１
（ １ 甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　 ７３００７０；２ 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州　 ７３００７０；
３甘肃农业大学动物科技学院，甘肃 兰州　 ７３００７０）
摘　 要：ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）是广泛存在于真核生物中长约 １８ ～ ２５ 个核苷酸的一类非编码 ＲＮＡ，调控基
因转录后表达。 目前，对 ｍｉＲＮＡ的鉴定、功能分析及机理调控的研究已成为生物学领域的热点。 为丰
富绵羊 ｍｉＲＮＡ数据库、研究 ｍｉＲＮＡ对季节性繁殖动物繁殖活动的调控作用及调控机理提供基础。 本
研究通过克隆法构建绵羊卵巢 ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ 文库，并进行生物学分析；利用 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测 ｍｉＲＮＡ
在卵巢组织中的表达。 试验成功构建绵羊卵巢 ｍｉＲＮＡ 的 ｃＤＮＡ 文库，获得 ３０ 条绵羊 ｍｉＲＮＡ 序列。
ｍｉＲＢａｓｅ数据库序列比对，２０ 条 ｍｉＲＮＡ序列与绵羊已知 ｍｉＲＮＡ同源保守，鉴定为绵羊已知 ｍｉＲＮＡ。 其
中 ｏａｒ⁃ｍｉＲ － ３９５５ － ５ｐ 在其它物种中未注释，鉴定为绵羊特异性 ｍｉＲＮＡ。 通过比对及二级结构分析鉴
定了绵羊 １０ 条新 ｍｉＲＮＡ，其中 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１ － ５ｐ 只与牛 ｂｔａ⁃ｍｉＲ － ２２８５ 具有一定的同源性。
Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ结果表明 １０ 个 ｍｉＲＮＡ（５ 个已知 ｍｉＲＮＡ及 ５ 个新 ｍｉＲＮＡ）在绵羊卵巢组织中均有表达，
但 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３ － ３ｐ的表达量显著高于其它 ９ 个，推测该新 ｍｉＲＮＡ对绵羊卵巢发育或功能发
挥具有重要的调控作用。 试验结果对绵羊 ｍｉＲＮＡ的进一步研究具有一定的理论指导和现实意义。
关键词：绵羊；卵巢；ｍｉｃｒｏＲＮＡ；克隆；生物信息学；实时荧光定量 ＰＣＲ
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１４􀆰 １２． ２１８４
　 　 ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是存在于真核生物中长度约
为 ２０ ～ ２５ 个核苷酸的一类非编码小分子 ＲＮＡ，根据
其与靶基因的互补程度或抑制靶基因翻译或降解靶基
因的转录物进而发挥调控作用［１ － ４］。 １９９３ 年， Ｌｅｅ
等［５］人用经典的定位克隆的方法在线虫 （Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）
中首次发现了 ｌｉｎ⁃４ 基因，并通过定点突变发现 ｌｉｎ⁃４
并不编码蛋白，而是产生一种小 ＲＮＡ 分子。 ２０００ 年，
Ｒｅｉｎｈａｒｔ等［６］发现了另一个具有转录后调节功能的小
分子 ＲＮＡ：ｌｅｔ⁃７。 在随后的十几年时间里，对 ｍｉＲＮＡ
的研究逐渐成为一种热点，并迅速发展。
目前，有关 ｍｉＲＮＡ在动物繁殖调控方面的研究较
少，而且相关研究大部分集中在啮齿类动物上。 Ｒｏ
等［７］于 ２００７ 年报道了利用小鼠卵巢，通过克隆的方法
获得 ２３６ 条 ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ，其中包括 １２２ 条 ｍｉＲＮＡｓ， ７９
条 ｐｉｗｉ⁃ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡｓ （ ｐｉＲＮＡｓ ） 和 ３５ 条 ｓｍａｌｌ
ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡｓ （ ｓｎｏＲＮＡｓ ）。 卵巢上大约 ７０％ 的
ｐｉＲＮＡｓ是由位于重复区域的多重基因编码的。 这些
卵巢非编码 ＲＮＡｓ 的表达和结构表明了其在卵泡的发
育和受精方面起着重要的作用。 ２００８ 年，Ｍｉｓｈｏｍａ
等［８］学者报道，利用小鼠的卵巢和睾丸，通过克隆的
方法分别获得 ６ ６３０ 条序列（１５９ 个已知 ｍｉＲＮＡｓ 基
因）和 １０ １９２ 条序列（１５４ 个已知 ｍｉＲＮＡｓ基因），检测
了 ５５ 个 ｍｉＲＮＡ，其中发现 ２ 个新的 ｍｉＲＮＡ；同时还发
现以雄性为基础的 ｍｉＲＮＡ 表达主要发生在 Ｘ 染色体
上。 ＭｃＢｒｉｄｅ等［９］研究证实，对于绵羊，在由卵泡期向
黄体期转化的过程中 ｍｉＲＮＡ起着重要的调节作用。
本试验通过构建绵羊卵巢 ｍｉＲＮＡ的 ｃＤＮＡ文库，
并进行生物信息学分析，同时通过荧光定量 ＰＣＲ检测
ｍｉＲＮＡ在绵羊卵巢中的表达，为以后探索 ｍｉＲＮＡ 对
繁殖器官的发育及繁殖活动的调控作用、改造或通过
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　 １２ 期 绵羊卵巢 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的克隆及表达分析
基因调控来提高绵羊的繁殖能力及改变后代的繁殖性
状等方面具有重要意义。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 试验样品
成年绵羊屠宰（兰州小西湖屠宰场）后立即取出
卵巢并用 ＤＥＰＣ水处理，迅速投入液氮，快速冷冻，然
后 － ８０ ℃保存备用。
１􀆰 ２　 主要药品与试剂
Ｔｒｉｚｏｌ、ＳＹＢＲ􀳏 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ｍｉＲＮＡ ＲＴ⁃ＰＣＲ 试剂
盒购置日本 Ｔａｋａｒａ 公司，Ｔ４ＲＮＡ 连接酶、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚
合酶等购置美国 ＮＥＢ生物公司，其余常规试剂购自甘
肃凯驰新达生物技术有限公司和兰州鑫祥生物技术有
限公司。
１􀆰 ３　 方法
１􀆰 ３􀆰 １　 ＲＮＡ接头及引物的合成 　 根据 ｍｉｃｒｏＲＮＡ 特
点设计两端特异性接头序列，根据接头序列设计反转
录引物，根据 ｐＧＥＭ⁃Ｔ ｅａｓｙ 载体设计菌液 ＰＣＲ 引物，
具体序列见表 １。
表 １　 接头及引物序列
Ｔａｂｌｅ １　 Ａｄａｐｔｅｒ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物名称
Ｎａｍｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ ／ ｎｔ
３′接头
Ｔｈｅ ａｄａｐｔｅｒ ｏｆ ３′
（ＰＯ４）⁃ＣＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡ⁃（ＮＨ２）⁃（ＣＨ２） ６ １６
５′接头
Ｔｈｅ ａｄａｐｔｅｒ ｏｆ ５′
ＡＴＣＧＴＡＧＧＣＡＣＣＵＧＡＡＡ １７
ＲＴ引物
ＲＴ ｐｒｉｍｅｒ
ＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＴＡＣ １５
ＰＣＲ ３′引物
Ｔｈｅ ３′ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ＰＣＲ
ＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＴＡＣＡＧ １７
ＰＣＲ ５′引物
Ｔｈｅ ５′ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ＰＣＲ
ＡＴＣＧＴＡＧＧＣＡＣＣＴＧＡＡＡ １７
菌液 ＰＣＲ ３′引物
Ｔｈｅ ３′ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ＰＣＲ
ＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＡ １８
菌液 ＰＣＲ ５′引物
Ｔｈｅ ５′ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ＰＣＲ
ＣＧＡＡＴＴＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＴ １７
１􀆰 ３􀆰 ２　 总 ＲＮＡ 的提取 　 取绵羊卵巢组织 ０􀆰 １ ｇ，用
ＴＲｉｚｏｌ 试剂提取方法抽提总 ＲＮＡ［１０］，溶解于适量
ＤＥＰＣ水中，取少量总 ＲＮＡ 用微量分光光度计测定其
浓度及纯度，１％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，合格总
ＲＮＡ样品于 － ８０ ℃保存备用。
１􀆰 ３􀆰 ３　 聚乙二醇（ＰＥＧ）富集小分子 ＲＮＡ　 小分子
ＲＮＡ的富集传统上都采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
法，但由于 ＲＮＡ易降解，电泳分离时间较长，效果不理
想，本试验采用改进 ＰＥＧ（聚乙二醇）法［１１］富集小分
子 ＲＮＡ。
１􀆰 ３􀆰 ４　 ３′接头、５′接头的连接　 将 ３′接头和富集的小
分子 ＲＮＡ于 ９９ ℃变性 ２ｍｉｎ，立即置于冰上，然后 ３７
℃反应 ２ ｈ，反应体系如下：１０ × Ｔ４ ＲＮＡ 连接酶 Ｂｕｆｆｅｒ
１μＬ，Ｔ４ ＲＮＡ 连接酶 １μＬ，ＲＮａｓｅ 抑制剂 ０􀆰 ５ μＬ，３′接
头（１００μＭ·Ｌ － １）２ μＬ，ＰＥＧ８０００ ２􀆰 ５ μＬ，小分子 ＲＮＡ
３μＬ，总体积 １０ μＬ。
将 ５′接头和 ３′接头连接产物于 ９９ ℃变性 ２ ｍｉｎ，
立即置于冰上，然后 ３７ ℃反应 ２ ｈ。 反应体系如下：
１０ × Ｔ４ ＲＮＡ连接酶 Ｂｕｆｆｅｒ １ μＬ，Ｔ４ ＲＮＡ连接酶 １μＬ，
ＲＮａｓｅ 抑制剂 ０􀆰 ５ μＬ，５′接头 （１００μＭ·Ｌ － １ ） ２ μＬ，
ＰＥＧ８０００ ２􀆰 ５ μＬ，３′接头产物 ３ μＬ，总体积 １０ μＬ。
１􀆰 ３􀆰 ５　 ｃＤＮＡ的合成、ＰＣＲ反应及产物回收　 以 ３′接
头序列为模板，根据碱基互补配对原则，设计 ＲＴ 引物
反转录，具体过程及反应体系按试剂盒说明书进行。
产物 ｃＤＮＡ， －２０ ℃保存。
以上述 ｃＤＮＡ 为模板，进行 ＰＣＲ 扩增，扩增体系
及扩增过程按常规方法进行。 ＰＣＲ 反应结束后，产物
４ ℃保存，４％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，然后按
照胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收。
１􀆰 ３􀆰 ６　 连接转化及测序 　 将上述胶回收产物与
ｐＧＥＭ⁃Ｔ ｅａｓｙ 载体连接，然后转染 Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ɑ 细胞，
蓝白斑筛选，对重组质粒进行 ＰＣＲ 鉴定，最后选取阳
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核　 农　 学　 报 ２８ 卷
性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司测序。
１􀆰 ３􀆰 ７　 生物信息学分析　 测序后序列去接头、污染及
低质量序列，将 １８ ～ ２６ ｎｔ 范围内的序列首先与
ｍｉＲＮＡ 数据库（ｍｉＲＢａｓｅ：ｈｔｔｐ： ／ ／ ｍｉｃｒｏｒｎａ． ｓａｎｇｅｒ． ａｃ．
ｕｋ ／ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ／ ｉｎｄｅｘ． ｓｈｔｍｌ）中绵羊已知 ｍｉＲＮＡ 比对，
筛选与已知 ｍｉＲＮＡ 同源序列；剩余序列分类比较，去
除重复序列；然后与 ＮＣＢＩ 中绵羊基因库进行 ＢＬＡＳＴ
比对；再将其与 ＧｅｎＢａｎｋ中蛋白质及 ＲＮＡ数据库进行
比对，将编码 ＲＮＡ 等序列剔除，剩余序列则初步鉴定
为新 ｍｉＲＮＡ；最后与基因组匹配的候选 ｍｉＲＮＡ 序列
前后各延伸 ４０ ｎｔ，用 Ｍｆｏｌｄ 程序（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｂｉｏｉｎｆｏ．
ｒｐｉ． ｅｄｕ ／ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ／ ｍｆｏｌｄ ／ ｃｇｉ⁃ｂｉｎ ／ ｒｎａ⁃ｆｏｒｍ１． ｃｇｉ）分析
二级结构［１２］。
１􀆰 ３􀆰 ８　 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检测　 试验步骤及反应体系按
公司 ＳＹＢＲ 􀳏 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ｍｉＲＮＡ ＲＴ⁃ＰＣＲ 试剂盒
（Ｔａｋａｒａ）说明书进行，反转录引物有试剂盒提供，定量
ＰＣＲ引物如表 ２。 以 Ｕ６ 为对照，每个基因做 ３ 个重
复，按照 ２ － △△ＣＴ方法［１３］计算相应的表达水平，并用
ＳＰＳＳ １６􀆰 ０ 对数据进行方差分析。
表 ２　 Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ引物序列
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
名称
Ｎａｍｅ
序列（５′ － ３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ － ３′）
长度
Ｌｅｎｇｔｈ ／ ｎｔ ＧＣ ／ ％
Ｕ６ ＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡ ２２ ４５􀆰 ４５
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３９５８⁃３ｐ ＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＣＴＣＴ ２２ ４０􀆰 ９０
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４３２ ＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＧＧＴＣＡＴＴＧＧＧＴＧＧ ２３ ５２􀆰 ２０
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３７９⁃５ｐ ＴＧＧＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＧＧＣ ２２ ５０􀆰 ０
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４８５⁃５ｐ ＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＡＴ ２０ ５５􀆰 ００
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１２７ ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＴＧ ２０ ５５􀆰 ００
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１⁃５ｐ ＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＴ ２０ ４５􀆰 ００
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００２⁃５ｐ ＣＡＧＧＣＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＧＧ ２１ ４７􀆰 ６０
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ ＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣ １９ ６１􀆰 １０
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００４⁃５ｐ ＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧ ２４ ４１􀆰 ７０
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００５⁃３ｐ ＴＣＡＣＡＧＴＧＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴ ２１ ４７􀆰 ６０
２　 结果与分析
２􀆰 １　 总 ＲＮＡ提取及 ｓｍａｌｌ ＲＮＡ 分子的富集
试验采用 Ｔｒｉｚｏｌ法提取绵羊卵巢总 ＲＮＡ，１％琼脂
糖凝胶电泳检测完整性，结果显示 ２８ｓ，１８ｓ 条带完整
明亮，二者亮度比例约为 ２ ∶ １，但 ５ｓ 较暗。 ＲＮＡ 总体
完整性较好，无降解；分光光度计测量总 ＲＮＡ 浓度为
１ ０６８ ～ １ ３２６ ｎｇ·ｍＬ － １， ＯＤ 值 Ａ２６０ ／ Ａ２８０为 １􀆰 ８ ～ １􀆰 ９，
说明纯度较高，无蛋白、酚等污染。 ＰＥＧ 富集法可以
有效去除总 ＲＮＡ 中的大分子部分，而小分子 ＲＮＡ 得
到了有效富集，且条带明亮（图 １ － Ａ），产量较高，杂
质较少，为后续试验提供了良好基础。
２􀆰 ２　 ３′和 ５′的连接及 ｃＤＮＡ链的合成
在 Ｔ４ ＲＮＡ 连接酶作用下，将富集得到的小分子
ＲＮＡ两端分别加 ３′和 ５′接头，并以此为模板进行反转
录合成 ｃＤＮＡ，然后 ＰＣＲ 反应，４％琼脂糖凝胶电泳进
行检测，产物大小预期在 ５１ ～ ５９ ｂｐ范围内。 由图 １ －
Ｂ可知，在目的条带范围内有较亮的弥散条带，说明试
验成功连接小分子 ＲＮＡ两端接头。
２􀆰 ３　 连接转化及菌液 ＰＣＲ鉴定
ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳后，胶回收纯化，将纯
化产物连接 ｐＧＥＭ⁃Ｔ ｅａｓｙ载体，并转化 Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ɑ感
受态细胞、蓝白斑筛选，挑取阳性菌斑进行菌液 ＰＣＲ
鉴定。
根据 ｐＧＥＭ⁃Ｔ ｅａｓｙ 载体序列设计菌液 ＰＣＲ 上下
游引物，目的片段预期在 ２０８ ～ ２１６ ｂｐ 左右，２％琼脂
糖凝胶电泳结果见图 ２，将片段大小在 ２００ ｂｐ 左右的
阳性克隆进行测序。
２􀆰 ４　 生物信息学分析
测序分析后发现该试验获得 １５０ 条符合 ｍｉＲＮＡ
长度的序列。 去除接头自连产物、绵羊 ｍＲＮＡ 及其它
非编码 ＲＮＡ，将其余序列与 ｍｉＲＢａｓｅ 数据库中绵羊已
知 ｍｉＲＮＡ 序列进行 ＢＬＡＳＴ。 去除已知 ｍｉＲＮＡ，将剩
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　 １２ 期 绵羊卵巢 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的克隆及表达分析
注：Ａ：小 ＲＮＡ的富集； Ｂ：琼脂糖凝胶检测 ＰＣＲ产物 ／ Ｍ：ｍａｒｋｅｒ。
Ｎｏｔｅ：Ａ： Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ． Ｂ：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｍ：ｍａｒｋｅｒ．
图 １　 电泳检测
Ｆｉｇ． １　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
注：Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１、２、３、４、５、６ 分别代表阳性菌斑。
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ｍａｒｋｅｒ：１，２，３，４，５，６：ｐｏｓｉｔｖｅ ｐｌａｑｕｅ．
图 ２　 菌液 ＰＣＲ筛选阳性克隆
Ｆｉｇ． ２　 Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａ ＰＣＲ
余序列在绵羊基因组中截取其两侧共约 ８０ ～ １００ ｎｔ的
序列利用 Ｍｆｏｌｄ 软件进行二级结构预测，最小自由能
（ＭＦＥ）小于等于 － ２０ 且能够折叠形成茎环结构的序
列鉴定为绵羊新 ｍｉＲＮＡ。
　 　 经比对分析及结构预测最终获得 ３０ 条 ｍｉＲＮＡ序
列。 其中 ２０ 条为绵羊已知 ｍｉＲＮＡ，分别为 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃
１１８５⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１１８５⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１２７、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１３４⁃
５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３２３ｃ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３７９⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３９５８⁃３ｐ、
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３９５９⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４１１ａ⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４３２、 ｏａｒ⁃
ｍｉＲ⁃４３３⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４８５⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４８５⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃
４９４⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４９５⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃５４３⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４９３⁃
５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４０９⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃５４１⁃５ｐ 和 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３２３ａ⁃
３ｐ。 １０ 条未找到绵羊同源 ｍｉＲＮＡ 序列，鉴定为绵羊
新 ｍｉＲＮＡ，命名为 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１⁃５ｐ、ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００２⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００４⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００５⁃３ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００６⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００７⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００８⁃５ｐ、ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００９⁃５ｐ和 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ００１０⁃３ｐ（新 ｍｉＲＮＡ 序列见表 ３、二级结构见图
３）。
２􀆰 ５　 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ
选取克隆数较多的 ５ 个已知 ｍｉＲＮＡｓ（ ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃
３９５８⁃３ｐ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃ ４３２、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３７９⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃ ４８５⁃
５ｐ和 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１２７）和 ５ 个新 ｍｉＲＮＡｓ（ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃
ｍ０００１⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００２⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃
ｍ０００３⁃３ｐ、ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００４⁃５ｐ和 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃
ｍ０００５⁃３ｐ）进行实时荧光定量 ＰＣＲ，检测其在绵羊卵
巢组织中的表达。 结果表明，１０ 个 ｍｉＲＮＡ 在绵羊卵
巢组织中均有表达（图 ４），但不同 ｍｉＲＮＡ 表达量不
同。 且 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ的表达量极显著高于
其它 ９ 个 ｍｉＲＮＡｓ，说明 １０ 个 ｍｉＲＮＡｓ 在绵羊卵巢组
织的生长发育或功能调控方面均有一定的作用，且
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ 可能在卵巢繁殖功能的调控
方面发挥着更重要的作用，但其具体作用机制及功能
还有待进一步研究。
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核　 农　 学　 报 ２８ 卷
表 ３　 绵羊新 ｍｉＲＮＡｓ
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｎｅｗ ｍｉＲＮＡｓ ｏｆ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ
名称
Ｎａｍｅ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ ／ ｎｔ
最小自由能
ＭＦＥ ／ （ｋｃａｌ·ｍｏｌ － １）
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１⁃５ｐ ＧＡＡＡＧＧＵＵＣＡＵＵＵＧＧＧＵＵＵＵＵ ２１ － ４５􀆰 ４
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００２⁃５ｐ ＣＡＧＧＣＵＡＧＧＡＧＡＡＡＵＧＡＵＵＧＧ ２１ － ２７􀆰 １
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ ＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＡＧ ２１ － ５２􀆰 ７２
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００４⁃５ｐ ＵＧＧＡＡＧＡＣＵＡＧＵＧＡＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵ ２４ － ４３􀆰 ０
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００５⁃３ｐ ＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＣＣＧＧＵＣＵＣＵＵＵ ２１ － ４０􀆰 １
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００６⁃５ｐ ＡＡＧＧＵＡＧＡＵＡＧＡＡＣＡＧＧＵＣＵＵＧ ２２ － ２１􀆰 ７
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００７⁃５ｐ ＡＡＣＵＧＵＵＵＧＣＡＧＡＧＧＡＡＡＣＵＧＡＧ ２３ － ３４􀆰 ９
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００８⁃５ｐ ＣＡＡＧＵＣＡＣＵＡＧＵＧＧＵＵＣＣＧＵＵＵＡ ２３ － ３８􀆰 １
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００９⁃５ｐ ＵＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＡＣＡＧＵＡＣＵＧＣＡＧ ２３ － ５２􀆰 ８
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ００１０⁃３ｐ ＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＵＧＡＵＡＡＣＵＧＡＡ ２１ － ３４􀆰 ０
　 　 Ｎｏｔｅ： ＭＦＥ： ｍｉｎｉｍｕｍ ｆｒｃｅ ｅｎｅｒｇｙ．
图 ３　 新 ｍｉＲＮＡｓ的二级结构图
Ｆｉｇ． ３　 Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｎｅｗ ｍｉＲＮＡｓ
３　 讨论
到目前为止，ｍｉＲＮＡ的鉴定方法主要有克隆法和
生物信息学预测法［１４］。 生物信息学预测主要是利用
ｍｉＲＮＡ在物种进化上的保守性，将两个物种的基因组
进行比较，筛选出能够产生发夹结构的序列来预测新
的 ｍｉＲＮＡ。 但该方法存在明显缺陷，而且由生物信息
８８１２
　 １２ 期 绵羊卵巢 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的克隆及表达分析
注：∗∗代表差异极显著（Ｐ ＜ ０􀆰 ０１）。
Ｎｏｔｅ：∗∗ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ ＜ ０􀆰 ０１） ．
图 ４　 不同 ｍｉＲＮＡ在绵羊卵巢组织中的表达情况
Ｆｉｇ． ４　 Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉＲＮＡ ｉｎ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ｏｖａｒｙ
学预测的 ｍｉＲＮＡ必须经过实验方法进行验证才能确
定［１５］。 鉴于生物信息学预测法的缺点，我们采用直接
克隆法构建绵羊卵巢小分子 ＲＮＡ的 ｃＤＮＡ文库，测序
鉴定绵羊 ｍｉＲＮＡ。 ｍｉＲＮＡ的克隆难度较大，很重要的
原因在于其在细胞或组织中表达丰度较低且很难分离
纯化。 传统方法利用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离小分子 ＲＮＡ，对于试验操作的要求极高。 由于需要
进行切胶回收，分离效率仅在 １０％左右，且电泳时间
较长，容易造成 ＲＮＡ 污染及降解。 本试验在参考
Ｂａｒｔａｌ 实验室发表的 ｍｉＲＮＡ 克隆方法［１６］的基础上进
行改进，采用骆明勇等［１１］ ＰＥＧ 法分离富集小分子
ＲＮＡ，去除加接头后的纯化步骤。 纯化接头产物虽然
可以提高产物的纯度，却增加了小分子 ＲＮＡ 的损失，
且很容易遭到污染，ＰＥＧ法是在总 ＲＮＡ提取后直接加
入配制的 ＰＥＧ溶液，省去了使用聚丙烯酰胺凝胶电泳
回收 ＲＮＡ，减少了 ｍｉＲＮＡ 的降解，也省去了反复洗涤
沉淀而引起的 ｍｉＲＮＡ丢失。
通过与 ｍｉＲＢａｓｅ 数据库中绵羊已知 ｍｉＲＮＡ 序列
比对，共鉴定出 ２０ 条与已知 ｍｉＲＮＡ 同源保守的
ｍｉＲＮＡ 序列。 其中，ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１３４⁃５ｐ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１２７、ｏａｒ⁃
ｍｉＲ⁃１１８５⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３７９⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４１１ａ⁃５ｐ、 ｏａｒ⁃
ｍｉＲ⁃４３２、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４３３⁃３ｐ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４８５⁃３ｐ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４８５⁃
５ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４９４⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃５４３⁃３ｐ、 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４９３⁃５ｐ、
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４０９⁃３ｐ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃５４１⁃５ｐ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３２３ａ⁃３ｐ 与人
类、小鼠、大鼠、牛及猩猩等物种具有 １００％同源性；而
ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃１１８５⁃３ｐ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３２３ｃ、ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃４９５⁃５ｐ 与其它
物种仅差一个或两个碱基，这是由于 ｍｉＲＮＡ的 ３′端容
易发生变异所致；ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３９５８⁃３ｐ 与牛 ｂｔａ⁃ｍｉＲ⁃１５４ｃ
１００％同源，与其它物种同源性较低，说明 ｍｉＲＮＡ在哺
乳动物中具有高度的保守性［１７］。 而 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３９５５⁃５ｐ
仅在绵羊中报道过，其它物种到目前为止 ｍｉＲＢａｓｅ 数
据库中未注册，说明 ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３９５５⁃５ｐ 可能是绵羊特异
性 ｍｉＲＮＡ。
鉴定出的 １０ 条新 ｍｉＲＮＡ，具有 ｍｉＲＮＡ 的典型特
点，长度均在 ２１ ～ ２４ ｂｐ 之间，绵羊 ｍｉＲＮＡ 数据库未
注册，但在其它物种中有相关报道。 其中，ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００４⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００５⁃３ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００６⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００７⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００８⁃５ｐ、 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃
ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００９⁃５ｐ 和 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ００１０⁃３ｐ 与人、小
鼠、大鼠、牛、猕猴等物种的 ｍｉＲ⁃２１４⁃３ｐ、 ｍｉＲ⁃７⁃５ｐ、
ｍｉＲ⁃１２８⁃３ｐ、 ｍｉＲ⁃１８３９⁃５ｐ、 ｍｉＲ⁃４５２⁃５ｐ、 ｍｉＲ⁃２２４⁃５ｐ、
ｍｉＲ⁃５０３⁃５ｐ和 ｍｉＲ⁃５４２⁃３ｐ具有 １００％同源性。 这 ８ 个
新 ｍｉＲＮＡ 虽在绵羊中首次发现，但与其它物种
ｍｉＲＮＡ序列具有高度同源性，说明该 ｍｉＲＮＡ 高度保
守。 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００２⁃５ｐ 与野猪 ｓｓｃ⁃ｍｉＲ⁃６６４⁃５ｐ、
家犬 ｃｆａ⁃ｍｉＲ⁃６６４、人 ｈｓａ⁃ｍｉＲ⁃６６４ａ⁃５ｐ 在 ３′端只有两
个碱基的差异，可能是 ３′端发生变异所致；而 ｏｖｉｓ⁃
９８１２
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１⁃５ｐ 与其它物种同源性较差，说明
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１⁃５ｐ 有可能是绵羊特异性的
ｍｉＲＮＡ，甚至是绵羊卵巢特异性表达的 ｍｉＲＮＡ，这有
待进一步验证。
实时荧光定量 ＰＣＲ是检测 ｍｉＲＮＡ 表达最常用的
方法，它具有高的灵敏度及精确度［１８ － １９］。 本试验采用
ＳＹＢＲ􀳏 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ｍｉＲＮＡ ＲＴ⁃ＰＣＲ Ｋｉｔ 试剂盒检测
ｍｉＲＮＡ在绵羊卵巢组织的表达水平，Ｐｏｌｙ（Ａ）加尾反
应和反转录反应在同一 ＰＣＲ管中同时进行，可以在较
短时间内高效合成 ｃＤＮＡ，作为 ｍｉＲＮＡ 实时定量 ＰＣＲ
反应时的模板，由于耗时较短，且两个反应在同一体系
中，可以快速、准确地对 ｍｉＲＮＡ的表达定量分析，且一
次合成 ｃＤＮＡ 就可以同时对多个 ｍｉＲＮＡ 分子进行检
测。 研究表明 ｍｉＲＮＡ 的表达具有时序性及组织或细
胞特异性的特点，可能参与了决定组织和细胞功能特
异性的基因调控，在生物体生长和发育过程中发挥多
种调节作用［２０ － ２１］。 实时荧光定量 ＰＣＲ 结果显示，
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ 在绵羊卵巢组织中的表达量
显著高于其它 ９ 个。 序列分析发现 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃
ｍ０００３⁃３ｐ与人类 ｍｉＲ⁃２１４ 序列同源性为 １００％ ，证明
了 ｍｉＲＮＡ在物种进化上的保守性。 Ｙａｎｇ 等［２２］研究
表明，ｍｉＲ⁃２１４ 在人卵巢癌中表达上调，通过结合在靶
基因 ＰＴＥＮ 的 ３＇ＵＴＲ 促进细胞的成活。 ｍｉＲ⁃２１４ 抑制
ＰＴＥＮ蛋白的表达从而活化 Ａｋｔ 信号通路，而特定
ｍｉＲＮＡ的表达上调很可能是卵巢发生癌变的重要因
子［２３］。 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ 在绵羊卵巢中的高
表达以及与人 ｍｉＲ⁃２１４ 同源性，推测 ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃
ｍ０００３⁃３ｐ对卵巢功能具有重要调控作用。
４　 结论
综上所述，本试验利用直接克隆法成功构建了绵
羊卵巢 ｍｉＲＮＡ的 ｃＤＮＡ文库，结合生物信息学软件分
析鉴定出 ３０ 条绵羊 ｍｉＲＮＡ 序列。 ｍｉＲＢａｓｅ 数据库序
列比对，２０ 条 ｍｉＲＮＡ 序列与绵羊已知 ｍｉＲＮＡ １００％
同源，鉴定为绵羊已知 ｍｉＲＮＡ，ｏａｒ⁃ｍｉＲ⁃３９５５⁃５ｐ 在其
它物种中未注释，鉴定为绵羊特异性 ｍｉＲＮＡ。 二级结
构及自由能分析鉴定出绵羊 １０ 条新 ｍｉＲＮＡ，其中
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１⁃５ｐ只与牛 ｂｔａ⁃ｍｉＲ⁃２２８５ 具有一
定的同源性。 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ结果表明 １０ 个 ｍｉＲＮＡ在
绵羊卵巢组织中均有表达，不同基因表达量不同，但
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３⁃３ｐ 的表达量显著高于其它 ９
个，与人类 ｍｉＲ⁃２１４ 具有 １００％ 同源性，推测该新
ｍｉＲＮＡ对绵羊卵巢发育或功能发挥具有重要的调控
作用，其作用方式及调控机理有待进一步验证。
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ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： ｍｉＲ － ２１４
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ＣＨＡＮＧ Ｗｅｉ⁃ｈｕａ１ 　 ＨＵ Ｊｕｎ⁃ｊｉｅ１ 　 ＷＡＮＧ Ｊｕａｎ⁃ｈｏｎｇ２ 　 ＣＡＯ Ｈｕｉ⁃ｐｉｎｇ２
ＭＡ Ｙｏｕ⁃ｊｉ３ 　 ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ１ 　 ＺＨＡＯ Ｘｉｎｇ⁃ｘｕ１
（ １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｇａｎｓｕ　 ７３００７０；
２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｇａｎｓｕ　 ７３００７０；
３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｇａｎｓｕ　 ７３００７０）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＭｉＲＮＡ （ｍｉｃｒｏＲＮＡ） ｉｓ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ， ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ １８ ～ ２５ｂｐ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｄｅｌｙ ｓｐｒｅａｄｅｄ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅ
ｇｅｎｏｍｅ， ｗｈｉｃｈ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ． Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ， ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ ｉｎ ｍｕｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ
ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ， ａｎａｌｙｓｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｔｏ ｒｉｃｈ ｍｉＲＮＡ
ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ｏｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅａｓｏｎａｌ
ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｉｍａｌｓ， Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ｏｖａｒｙ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． Ｌａｓｔ， Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ｏｖａｒｙ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ， ｉｎ ｗｈｉｃｈ， ３０ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ｍｉＲＮＡｓ ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｌａｓｔ ｔｈｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｍｉＲＢａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ， ２０ ｍｉＲＮＡｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｉＲＮＡ， ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ ｋｎｏｗｎ
ｍｉＲＮＡｓ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｏａｒ⁃ｍｉＲ － ３９５５ － ５ｐ ｈａｄ ｎｏｔ ｍｉＲＢａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｎｏｔｅｓ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ， ｐｏｓｓｉｂｌｌｙ ｓｐｅｃｉａｌ ｆｏｒ Ｏｖｉｓ
ａｒｉｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ １０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ｎｅｗ ｍｉＲＮＡｓ ｂｙ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇｌｙ，
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１ － ５ｐ ｏｎｌｙ ｈａｄ ｓｏｍｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉＲＮＡ ｂｔａ⁃ｍｉＲ － ２２８５􀆰 １０ ｍｉＲＮＡｓ （ ｆｉｖｅ ｋｎｏｗｎ
ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｆｉｖｅ ｎｅｗ ｍｉＲＮＡｓ） ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ｏｖａｒｙ， ａｎｄ
ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３ － ３ｐ ｈａｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｇｈｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｍｉＲＮＡｓ ｗｈｉｃｈ ｗｉｌｌ ｈａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｎ ｏｖａｒｉａｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｈａｖｅ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ ａｎｄ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｎ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ｍｉＲＮＡｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ； Ｏｖａｒｙ； ｍｉｃｒｏＲＮＡ； Ｃｌｏｎｅ； Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ； Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ
１９１２