全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１４，２８（１２）：２１７５ ～ ２１８３
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１４⁃０６⁃２４ 　 接受日期：２０１４⁃０９⁃２０
基金项目：江苏省自然基金（ＢＫ２０１２７６７），中央高校基本科研业务费专项资金（ＫＹＺ２０１３０１）
作者简介：谭河林，男，讲师，主要从事油脂生物合成的调控机制研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｌｔａｎ＠ ｎｊａｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
通讯作者：同第一作者。
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）１２⁃２１７５⁃０９
油菜 ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２ （ＢｎＬＥＣ２）
基因的克隆及表达分析
谭河林１ 　 王莉欢１ 　 李　 云１ 　 兰　 杰１ 　 唐倩莹１ 　 叶文雪１ 　 向小娥２
（ １ 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏 南京　 ２１００９５；
２南京农业大学动物科学类国家教学示范中心，江苏 南京　 ２１００９５）
摘　 要：ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２（ＬＥＣ２）为具有 Ｂ３ 结构域的 ＤＮＡ 结合蛋白家族的成员，是调控胚胎形
成、种子储藏蛋白代谢和脂肪酸代谢的重要转录因子。 本文对四倍体甘蓝型油菜 ＢｎＬＥＣ２ 基因进行了
克隆，并分析了白菜 ＢｒＬＥＣ２、甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 和甘蓝型油菜 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因的进化及其表达模式。 结果
表明，油菜、白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 同源基因在进化上较为保守；但部分白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 同源基因的表达发
生沉默。 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因表达模式与其对应的白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 发生明显改变，前者主要在种子发育
的中期高水平表达，这与油菜种子油脂等储藏物质的积累期重叠。 表明 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因通过改变其
表达模式影响油菜种子储存物质的积累。 这些结果初步揭示了多拷贝 ＢｎＬＥＣ２ 对油菜种子储存物质调
控的协同表达模式。
关键词：甘蓝型油菜；ＢｎＬＥＣ２ 基因；基因克隆；进化分析；转录分析
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１４􀆰 １２． ２１７５
　 　 我国是油料生产大国，更是油料消费大国。 目前，
我国自产油料作物仅提供植物油消费总量的 ４０％左
右，随着我国生活水平的不断提高导致我国油料供给
问题日益突显［１］。 油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）是我国第一
大油料作物，近年来，尽管我国油菜新品种不断推广使
得油菜籽单位面积产量得到一定提高，然而进一步提
升空间有限。 在我国耕地面积逐年下降的趋势下，已
不能通过增加种植面积方式来增加油菜籽产量。 现今
我国油菜品种平均油脂含量约 ４０％ ，明显低于含油量
达 ４２％ ～４７％的外国油菜品种［２ － ３］。 因此，在种植面
积难以增加的情形下，提高油菜籽含油量是解决当前
问题最根本的途径［１， ４］。
油菜籽油脂主要是脂肪酸和甘油化合而成的三脂
酰甘油 （ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ， ＴＡＧ） ［５ － ６］，脂肪酸是在种子
质体中通过从头合成途径合成的。 在油菜种子细胞
中，脂肪酸的合成是在质体内中以乙酰 ＣｏＡ（ ａｃｅｔｙｌ⁃
ＣｏＡ）为前体，经启动、装载、缩合、还原、脱水、释放等
七步酶促反应循环完成的［７ － ８］。 尽管现已对脂肪酸代
谢途径中部分关键酶的分子生物学、酶学特性，以及生
化过程较为清楚，但是脂肪酸代谢是受复杂调控网络
控制的，目前对于种子油脂合成过程中的调控机制却
知之甚少［９］。
目前，已从模式植物拟南芥中发现参与植物油脂
代谢调控的转录因子有 ＷＲＩＮＫＬＥＤ１ （ ＷＲＩ１ ）、
ＦＵＳＣＡ３ （ ＦＵＳ３）、 ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ２ （ ＬＥＣ２）和
ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ１ （ ＬＥＣ１ ） 等［１０ － １３］。 其 中，
ＡｔＬＥＣ２ 是含有 Ｂ３ 结构域的转录因子［１１］，在胚胎起始
过程中决定胚胎发生以及早期胚胎形态的建立，
ＡｔＬＥＣ２ 功能缺失则会影响胚胎细胞命运的维持和子
叶的特化。 过量表达 ＡｔＬＥＣ２ 能促进体细胞胚胎的形
成，使体细胞具有胚性细胞的特性［１２， １４］。 在种子成熟
阶段，ＡｔＬＥＣ２ 能促进储藏物质的积累以及种子抗脱水
性能的获得。 拟南芥 Ａｔｌｅｃ２ 突变体种子储藏物质明显
减少，种子不耐干燥［１５］。
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核　 农　 学　 报 ２８ 卷
拟南芥中诱导表达 ＡｔＬＥＣ２ 芯片数据表明，ＡｔＬＥＣ２
能影响下游大量基因的表达水平，其中包括种子贮藏
蛋白基因、油体蛋白基因、２Ｓ 蛋白类似基因等，这些基
因是合成种子储存蛋白和油体的重要基因［１５］。 此外，
脂肪酸合成途径的基因也明显上调，说明 ＡｔＬＥＣ２ 不仅
能调控储存蛋白的合成，也能调控油脂的合成。 芯片
数据中 ＡｔＷＲＩ１ 的表达水平明显上调，现已明确
ＡｔＷＲＩ１ 通过调节糖酵解途径基因的表达控制种子含
油量，说明 ＡｔＬＥＣ２ 基因可能通过调控下游 ＡｔＷＲＩ１ 基
因表达水平，从而提高种子的含油量［１５ － １８］。
油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ， ＡＡＣＣ）是由白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｒａｐａ， ＡＡ）和甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ， ＣＣ）自然杂交进
化形成的异源四倍体油料作物［１９］。 白菜和甘蓝基因
组测序表明，ＬＥＣ２ 基因在白菜和甘蓝基因组中均有两
个同源基因［２０ － ２１］。 鉴于油菜测序工作尚未完成，理论
上在油菜基因组中具有 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因，这些
ＢｎＬＥＣ２ 同源基因在油菜基因组形成和进化过程中，
通过何种模式协同表达控制油菜种子的发育和调控油
菜中油脂、储存蛋白合成，目前尚未明确。 本研究克隆
了油菜基因组中 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因，分析其与白菜、甘
蓝 ＬＥＣ２ 同源基因的进化关系；通过分析 ＢｒＬＥＣ２、
ＢｏＬＥＣ２ 和 ＢｎＬＥＣ２ 基因的表达模式， 从而了解
ＢｎＬＥＣ２ 对油菜种子油脂和存储蛋白合成的协同调控
模式。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）中双 １１、白菜型油菜
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ） ＴＮ００４ 和羽衣甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）
在 ９ 月底分别种植在试验田中，每个材料种植 １０ 行，
每行种植 ２０ 穴，每穴 １ 株，株行株距为 ２０ ｃｍ × ４０
ｃｍ。
１􀆰 ２　 白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 基因的获取
利用拟南芥 ＡｔＬＥＣ２ （ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＬＥＣ２，
ＡｔＬＥＣ２，Ａｔ１ｇ２８３００）蛋白序列在白菜数据库 ＢＲＡＤ
（Ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｄａｔａｂａｓｅ， ＢＲＡＤ，ｈｔｔｐ： ／ ／ ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ． ｏｒｇ ／
ｂｒａｄ ／ ）进行 ＢＬＡＳＴｐ 和基因注释搜索，获得白菜和甘
蓝 ＬＥＣ２ 基因 ＣＤＳ和蛋白序列。
１􀆰 ３　 油菜 ＢｎＬＥＣ２ 基因克隆
将获得的白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ ＣＤＳ 序列，通过
ＭＥＧＡ软件比对，发现白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ ＣＤＳ 的近 ５′⁃
前端序列较为保守，近 ３′⁃端差异较大，根据序列的差
异，分别设计 １ 条正向引物（Ｆ： ＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＴＣＴＴＧＣ
ＣＣＴＴＴＴＣＣＴ）和 ２ 条反向引物（Ｒ１： ５′⁃ＴＣＡＣＣＡＴＡＡＧＡ
ＡＡＴＣＧＴＴＣＧＡＧＣＴＣ⁃３′和 Ｒ２： ５′⁃ＴＣＡＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧＴ
ＣＧＴＴＡＡＡＧＣＴＣ⁃３′），用于克隆油菜 ＢｎＬＥＣ２ 基因。 利
用甘蓝型油菜中双 １１ 幼嫩种子 ｃＤＮＡ为模板，扩增油
菜 ＢｎＬＥＣ２ 基因 ＣＤＳ 序列。 扩增所得的 ＤＮＡ 片段连
接到测序载体 ｐＵＣ － １９，转化到大肠杆菌并筛选阳性
克隆，测序阳性克隆。 最终获得 ＢｎＬＥＣ２ ＣＤＳ 序列。
１􀆰 ４　 植物组织材料的收集与总 ＲＮＡ的提取
油菜中双 １１、白菜型油菜 ＴＮ００４ 和羽衣甘蓝植物
将抽薹开花时，采集幼嫩叶片；植株开花时，标记开花
时间，收集开花后 ７、１４ 和 ２１ ｄ的角果（下简称 ＤＡＦ），
每个植株剪取 １ ～ ２ 个角果，１０ 株角果混在一起；同时
每株采取 １ ～ ２ 个花蕾，十株花蕾混在一起，每个样品
采集 ３ 个生物重复。 样品采集后立即使用液氮速冻，
然后放入 － ７０ ℃冰箱保存待用。
组织总 ＲＮＡ 提取，利用 Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ
（Ｗａｔｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） ＲＮＡ 提取试剂盒，购于上海
赛默飞世尔科技术公司，按照试剂盒的操作说明进行。
ＲＮＡ浓度采用 ＯＤ２６０测定：取 ４ μＬ ＲＮＡ，加入 ９６ μＬ
ＤＥＰＣ⁃Ｈ２Ｏ，振荡混匀，用紫外分光光度计测定其 ２６０
ｎｍ波长的 ＯＤ值，其数值即为 ＲＮＡ溶液的浓度。
１􀆰 ５　 ｃＤＮＡ合成
取 １ ～ ２ ｇ总 ＲＮＡ，加 ＤＥＰＣ水至 １０ μＬ；加入１ μＬ
Ｏｌｉｇｏ （ｄＴ） １５和 １ μＬ １０ ｍＭ ｄＮＴＰ，混匀。 然后放入
ＰＣＲ仪中，６５ ℃ ５ ｍｉｎ，取出然后放在冰上 ２ ｍｉｎ，快速
加入：５ × 缓冲液 ４ μＬ，ＲＮａｓｅ 抑制剂 １ μＬ，０􀆰 １ Ｍ
ＤＴＴ ２ μＬ，５ Ｕ·Ｌ － １反转录酶 Ｈ ０􀆰 ５ μＬ；放入 ＰＣＲ 仪
中，使用如下程序进行 ｃＤＮＡ 的合成：４２ ℃ ５０ ｍｉｎ；
４５ ℃ １０ ｍｉｎ；５０ ℃ １０ ｍｉｎ；７０ ℃ １５ ｍｉｎ。 反应结束后
加入 １ μＬ １０ ｍｇ·ｍＬ － １ ＲＮａｓｅ，３７ ℃放置 ３０ ～ ６０ ｍｉｎ。
分装产物 － ８０ ℃保存待用。
１􀆰 ６　 ＬＥＣ２ 表达模式分析
为了区别每个油菜、白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 同源基因
的表达差异，根据同源基因的 ＣＤＳ 序列设计每个基因
的特异引物（表 １）；分别用 ＢｎＡＣＴＩＮ （Ｆ： ＡＣＧＴＴＧＧＴＧ
ＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡＧ；Ｒ： ＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＡＡ）、
ＢｒＡＣＴＩＮ （Ｆ： ＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴ； Ｒ： ＡＧＣＧ
ＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＡＡＣ）和 ＢｏＡＣＴＩＮ （Ｆ： ＡＴＣＧＡＧＣＡ
ＣＧＧＴＡＴＴＧＴＡＡＧＣ； Ｒ： ＣＣＣＡＣＴＡＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡ
Ｇ）为内参，ＢｎＬＥＣ２ 基因的定量 ＰＣＲ引物序列见表 １。
实时定量 ＰＣＲ 分析使用 Ｐｒｏｍｅｇａ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ ｍｉｘ 试剂，
反应体积 ２０ μＬ，反应体系为： ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０ μＬ，上下游引物引物各加 ０􀆰 ５ μＬ，合成
的 ｃＤＮＡ经 １０ 倍稀释后加 ８􀆰 ５ μＬ 为模板，荧光定量
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　 １２ 期 油菜 ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２ （ＢｎＬＥＣ２）基因的克隆及表达分析
ＰＣＲ反应条件为：９５ ℃ ５ ｍｉｎ，９５ ℃ １０ ｓ，５８ ℃ ３０ ｓ，
６５ ℃ １０ ｓ，４０ 个循环。 每个反应 ３ 个重复。
表 １　 基因表达分析所用引物及其序列
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ
基因名
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ
引物名
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列（５′⁃３′）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′⁃３′）
ＢｎＬＥＣ２⁃１ ｑＲＴＦ１ ＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡ
ｑＲＴＲ１ ＧＴＡＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧ
ＢｎＬＥＣ２⁃２ ｑＲＴＦ１ ＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡ
ｑＲＴＲ２ ＴＡＡＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＧＡ
ＢｎＬＥＣ２⁃３ ｑＲＴＦ３ ＧＴＡＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＴＧＴＴ
ｑＲＴＲ３ ＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＴ
ＢｎＬＥＣ２⁃４ ｑＲＴＦ４ ＴＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧＴＡＴＴＡＣ
ｑＲＴＲ４ ＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣ
注：用白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 序列设计扩增 ＢｎＬＥＣ２ 的引物，以油菜中双 １１ 种子 ｃＤＮＡ 为模板扩增油菜 ＢｎＬＥＣ２，１ ～ ４ 泳道相应为油菜
　 　 　 　 ＢｎＬＥＣ２⁃１ ～ ４，箭头指示为目的条带，第 ５ 泳道为 ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ，右边数值标注为 ＤＡＮ相应条带分子量。
Ｎｏｔｅ：Ｕｓｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ， ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｅｓ ｏｆ ＬＥＣ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ， ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ＢｎＬＥＣ２ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｎａｐｕｓ ｃＤＮＡ． Ｔｈｅ ｌａｎｅｓ １ ～ ４ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｌ ｆｒｏｍ ｌｅｆｔ ｔｏ ｒｉｇｈｔ ａｒｅ ＢｎＬＥＣ２⁃１ ～ ４ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｂａｎｄｓ；Ｔｈｅ ｌａｓｔ ｌａｎｅ ｉｓ ｔｈｅ ＤＬ２０００
　 　 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｅａｃｈ ＤＮＡ ｂａｎｄ ｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｌ．
图 １　 扩增油菜 ＢｎＬＥＣ２ 基因
Ｆｉｇ． １　 Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ＢｎＬＥＣ２ ｆｒｏｍ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＢｎＬＥＣ２ 基因全长 ｃＤＮＡ的克隆
利用拟南芥 ＡｔＬＥＣ２蛋白序列在白菜数据库 ＢＲＡＤ
（Ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｄａｔａｂａｓｅ， ＢＲＡＤ，ｈｔｔｐ： ／ ／ ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ． ｏｒｇ ／
ｂｒａｄ ／ ）进 行 ＢＬＡＳＴｐ， 获 得 两 个 白 菜 ＬＥＣ２ 基 因
（ Ｂｒａ０３２８９０， Ｂｒａ０３００８７ ） 和 两 个 甘 蓝 ＬＥＣ２ 基 因
（Ｂｏｌ０１５７２８， Ｂｏｌ０４１８２５）。 进一步在白菜和甘蓝数据库
中通过基因注释方式检索 ＬＥＣ２ 基因，分别检索到两个
ＬＥＣ２基因，与利用拟南芥蛋白 ＢＬＡＳＴｐ 比对的结果相
一致。 将获得的 ＢｒＬＥＣ２ 基因命名为：ＢｒＬＥＣ２⁃１ 和
ＢｒＬＥＣ２⁃２； ＢｏＬＥＣ２ 基因命名为：ＢｏＬＥＣ２⁃１ 和 ＢｏＬＥＣ２⁃
２。
油菜源自白菜和甘蓝杂交形成的异源四倍体。 目
前，油菜全基因组测序尚未完成，根据白菜和甘蓝
ＬＥＣ２ 基因序列设计油菜 ＢｎＬＥＣ２ 同源克隆引物。 以
油菜中双 １１ 发育种子 ｃＤＮＡ 为模板，进行 ＰＣＲ 扩增
（图 １）。 扩增片段经克隆测序，最终获得 ４ 个全长
ＢｎＬＥＣ２ 基因 ＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ＣＤＳ），序列长度
分别为 １ ０３５、１ ０３５、１ ０８０ 和 １ ０６５ ｂｐ。 把所获得的油
菜 ＢｎＬＥＣ２ 基因分别命名为 ＢｎＬＥＣ２⁃１、 ＢｎＬＥＣ２⁃２、
ＢｎＬＥＣ２⁃３ 和 ＢｎＬＥＣ２⁃４。
２􀆰 ２　 ＢｎＬＥＣ２ 和 ＢｒＬＥＣ２、ＢｏＬＥＣ２ 蛋白相似性分析
为了解所克隆的 ＢｎＬＥＣ２ 是否源自白菜和甘蓝基
因组的 ＬＥＣ２ 基因，将克隆获得的 ＢｎＬＥＣ２ 基因序列通
过 ＭＥＧＡ软件翻译获得相应 ＢｎＬＥＣ２ 基因的蛋白序
列。 将 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 蛋白序列与 Ｇｅｎｂａｎｋ 中白菜和甘
蓝的 ＬＥＣ２ 蛋白序列进行比对。
序列比对分析发现，克隆所得的 ＢｎＬＥＣ２ 蛋白序
列与白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 蛋白具有较高的同源性。 其
中，ＢｎＬＥＣ２⁃２ 与 ＢｏＬＥＣ２⁃１ 氨基酸序列相似性达到
９３􀆰 １５％ ； ＢｎＬＥＣ２⁃１ 与 ＢｒＬＥＣ２⁃１ 氨基酸序列相似性
达到 ９９􀆰 ５４％ ； ＢｎＬＥＣ２⁃３ 与 ＢｒＬＥＣ２⁃２ 氨基酸相似性
达到 ９７􀆰 ８５％ ； ＢｎＬＥＣ２⁃４ 与 ＢｏＬＥＣ２⁃２ 氨基酸序列相
似性达到 ９９􀆰 ５７％ 。 上述结果表明克隆获得的油菜
ＣＤＳ序列为 ＢｎＬＥＣ２ 基因。
蛋白序列比对结果表明白菜、甘蓝和油菜 ８ 个
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注：油菜 ＢｎＬＥＣ２ 蛋白序列通过 ＭＥＧＡ软件翻译克隆获得的 ＣＤＳ序列，白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 序列从 ＢＲＡＤ网站下载，比对软件为 ＭＥＧＡ，方法
为 ｃｌｕｓｔｅｒ ｗ。 相同氨基酸用红色底标出，差异氨基酸用白底标出，黑线标注下方为 Ｂ３ 结构域，右边数字为氨基酸在每个蛋白的实际位置。
Ｎｏｔｅ：Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＬＥＣ２ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｏ， Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ； Ｂｒ， Ｂ． ｒａｏａ； Ｂｎ， Ｂ． ｎａｐｕｓ． Ｎｕｍｂｅｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｔｈｅ
ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｅａｃｈ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｈｅｒｅ． Ｔｈｅ ｒｅｄ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ
　 　 　 　 ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｂｅｌｏｗ ｔｈｅ ｂｌａｃｋ ｌｉｎｅ ｉｓ ｔｈｅ Ｂ３ ｄｏｍａｉｎ．
图 ２　 油菜、白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 蛋白比对
Ｆｉｇ． ２　 ＬＥＣ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｂ． ｒａｐａ， Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ ａｎｄ Ｂ． ｎａｐｕｓ
ＬＥＣ２ 蛋白可明显分成两类，每一类型均包括 ４ 个蛋
白：１ 个白菜和 １ 个甘蓝，以及 ２ 个 ＢｎＬＥＣ２ 蛋白。 这
两类蛋白主要差异在于蛋白序列中发生 ３ 处短片段的
缺失，并且 ４ 个蛋白缺失位点均在相同位置。 说明
ＬＥＣ２ 基因在白菜、甘蓝和油菜的进化中是较为保守
的。 鉴于 ＬＥＣ２ 为 Ｂ３ ｄｏｍａｉｎ 的转录因子［１５］，其 ＤＮＡ
结合域，除甘蓝 ＢｏＬＥＣ２⁃１ 外，较为保守（图 ２，图中黑
线标注下方氨基酸序列）。 甘蓝 ＢｏＬＥＣ２⁃１ ＤＮＡ 结合
结构域中较 ＢｏＬＥＣ２⁃２ 以及白菜、油菜 ＬＥＣ２ ＤＮＡ 结
合结构域多了 ５ 个氨基酸（ＳＦＫＹＫ），这表明 ＢｏＥＣ２⁃１
的 ＤＮＡ结合结构域三维结构可能发生改变，从而影响
ＢｏＥＣ２⁃１ 下游被调控基因的转录。 基于油菜是白菜和
甘蓝杂交加倍形成的，ＢｏＥＣ２⁃１ 较白菜、油菜 ＬＥＣ２ 发
生改变，说明甘蓝 ＢｏＥＣ２⁃１ 的 ＤＮＡ结合结构域变异发
生在油菜物种形成后。
２􀆰 ３　 ＢｒＬＥＣ２、ＢｏＬＥＣ２ 和 ＢｎＬＥＣ２ 进化分析
为了解所克隆的 ＢｎＬＥＣ２ 基因与白菜和甘蓝
ＬＥＣ２ 基因的进化关系，进一步利用油菜、白菜、甘蓝和
拟南芥的蛋白序列采用 ＭＥＧＡ６􀆰 ０６ 软件构建蛋白质
序列进化树。 分析结果表明白菜、甘蓝和油菜蛋白与
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　 １２ 期 油菜 ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２ （ＢｎＬＥＣ２）基因的克隆及表达分析
拟南芥蛋白进化树整体分为 ３ 支（图 ３），白菜、甘蓝和
油菜的蛋白聚为两支，而拟南芥独为一支，说明拟南芥
与白菜和甘蓝的 ＬＥＣ２ 基因变异较大、分化早；白菜、
甘蓝和油菜 ＬＥＣ２ 两簇主要是以 ２ 个直系同源基因形
式分开的，每簇均包含一个白菜、甘蓝和 ２ 个油菜基
因。 说明油菜的 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因分别来自白菜
和甘蓝的 ２ 个 ＬＥＣ２ 基因，这 ２ 个 ＬＥＣ２ 基因已经存在
于古老白菜和甘蓝祖先种植物基因组中，并且在后续
的进化过程中这 ２ 个直系同源基因是独自进化的［２０］。
油菜 ＢｎＬＥＣ２ 蛋白聚簇结果表明，每个油菜
ＢｎＬＥＣ２ 蛋白均能找到与之相对应的白菜 ＢｒＬＥＣ２ 和
甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 蛋白，形成一对一相似配对关系：
ＢｏＬＥＣ２⁃１ 与 ＢｎＬＥＣ２⁃２ 相似；ＢｒＬＥＣ２⁃１ 与 ＢｎＬＥＣ２⁃４
相似； ＢｏＬＥＣ２⁃２ 与 ＢｎＬＥＣ２⁃１ 相似； ＢｒＬＥＣ２⁃２ 与
ＢｎＬＥＣ２⁃３ 相似，配对结果与蛋白序列比对结果相同。
油菜与白菜和甘蓝相对应的分枝节点置信度均超过
８０。 上述结果表明克隆获得的 ＢｎＬＥＣ２ 基因为油菜真
实 ＬＥＣ２ 基因，也表明油菜基因组进化上是由白菜和
甘蓝基因组杂交而来［１９］。
进化树表明，尽管 ＬＥＣ２ 基因在进化上较为保守，
但是拟南芥 ＡｔＬＥＣ２ 和芸薹的 ２ 个 ＬＥＣ２ 同源基因在
分化后均发生变异。 从油菜同源蛋白同其亲本白菜和
甘蓝一对一的同源配对关系可以看出，油菜 ＢｎＬＥＣ２
同源蛋白与白菜和甘蓝的 ＬＥＣ２ 蛋白之间变异较小。
可以推断白菜和甘蓝从古老十字花科祖先种植物分化
后的进化历程较油菜形成演变时间长，该结论与近期
通过基因组比较分析研究的结果相似。
２􀆰 ４　 ＬＥＣ２ 器官表达差异性分析
为了解 ＬＥＣ２ 基因的表达模式，本研究采用实时
定量 ＰＣＲ（ｑＲＴ⁃ＰＣＲ）检测了白菜 ２ 个 ＢｒＬＥＣ２ 同源基
因在白菜叶片、花蕾和 ７、１４ 和 ２１ｄ角果等器官中的表
达水平。 发现在这些器官中，２ 个 ＢｒＬＥＣ２ 同源基因的
相对表达水平差异较大（图 ４）。 ＢｒＬＥＣ２⁃１ 在叶片、花
蕾和 ２１ｄ角果中均能表达，而在 ７ｄ和 １４ｄ角果中基本
不表达。 其中叶片中的表达水平最高，其次是 ２１ｄ 角
果，然后是花蕾中。 而 ＢｒＬＥＣ２⁃２ 仅在叶片和 ２１ｄ 角果
中低水平表达。 说明白菜基因组多倍化后，为了维持
一定水平的基因剂量，部分同源基因被沉默或低水平
表达。
甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 同源基因各器官表达分析发现，２ 个
甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 同源基因在叶片、花蕾、７ｄ和 １４ｄ角果等
３ 个器官中表达水平差异明显，主要在角果中表达（图
５）。 ２ 个甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 同源基因中，仅 ＢｏＬＥＣ２⁃２ 基因
在角果发育 ７ｄ和 １４ｄ 时高水平表达，而 ＢｏＬＥＣ２⁃１ 表
注：白菜、甘蓝、油菜和拟南芥 ＬＥＣ２ 蛋白进化树使用 ＭＥＧＡ ６􀆰 ０６ 软
　 　 　 件利用 ＮＪ （ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ） 建树法构建。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｂｙ ｔｈｅ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ （ ＮＪ ） ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＭＥＧＡ
ｓｏｆｔｗａｒｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ６􀆰 ０６． Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｔ ｅａｃｈ ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ
ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｓｃｏｒｅｓ （１，０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ） ． Ａ ｂｒａｎｃｈ ｗｉｔｈ ａ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｓｃｏｒｅ
　 　 　 ｂｅｌｏｗ ５０ ｗａｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｕｎｒｅｌｉａｂｌｅ．
图 ３　 白菜、甘蓝、油菜和拟南芥 ＬＥＣ２ 蛋白进化树
Ｆｉｇ． ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｏｆ ＢｎＬＥＣ２， ＢｒＬＥＣ２，
ＢｏＬＥＣ２ ａｎｄ ＡｔＬＥＣ２ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
注：利用 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测白菜 ＬＥＣ２ 同源基因植物发育不同组织中的
表达水平，图中数值为三个技术重复的平均值和标准差，内参为白菜
　 　 　 　 ＢｒＡＣＴＩＮ。
Ｎｏｔｅ： Ｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ．
Ｄａｔａ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｒｅ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｇｒａｐｈ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｗａｓ ＢｒＡＣＴＩＮ．
图 ４　 白菜 ＢｒＬＥＣ２ 表达谱
Ｆｉｇ． ４　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＢｒＬＥＣ２ ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｅ
ｏｒｇａｎｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｂ． ｒａｐａ．
达水平较低。 在甘蓝 ３ 个器官中，２ 个 ＢｏＬＥＣ２ 同源基
因在叶片和花蕾中表达水平均较低。 而白菜 ＢｒＬＥＣ２
直系同源基因表达模式不完全相同，叶片中白菜
ＢｏＬＥＣ２⁃１ 基因在叶片中高水平表达，而甘蓝 ２ 个
ＢｏＬＥＣ２ 同源基因均表达水平较低。 花蕾中白菜和甘
蓝 ＬＥＣ２ 同源基因均低水平表达。 甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 同源
９７１２
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
基因在角果发育 ７ｄ时就已开始表达，到 １４ｄ时表达开
始降低，而白菜仅在 ２１ｄ 才开始表达。 说明进化上尽
管白菜和甘蓝具有相同的祖先，但白菜与甘蓝 ＬＥＣ２
同源基因表达模式有差异，这种差异可能由白菜和甘
蓝物种形成后人工驯化所导致。
注：利用 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 同源基因植物发育不同器
官中的表达水平，图中数值为三个技术重复的平均值和标准
　 　 　 差，内参为甘蓝 ＢｏＡＣＴＩＮ。
Ｎｏｔｅ： Ｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｉｎ
ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ． Ｄａｔａ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｒｅ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒａｐｈ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ
　 　 　 ｃｏｎｔｒｏｌ ｗａｓ ＢｏＡＣＴＩＮ．
图 ５　 甘蓝 ＢｏＬＥＣ２ 表达谱
Ｆｉｇ． ５　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＢｏＬＥＣ２ ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｅ
ｏｒｇａｎｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ
ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测分析结果发现油菜 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 的
表达水平在不同器官部位表达模式与白菜和甘蓝不同
（图 ６）。 在所检测的油菜 ３ 个器官 ５ 个生长时期中，
油菜 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 仅在 ２１ｄ 角果期呈高水平表达，而
在叶片、花蕾、７ｄ角果、１４ｄ 角果和 ２１ｄ 角果均不表达
或表达水平较低。 尽管 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因在 ２１ｄ
角果中均表达，但是各自的表达水平差异明显。 其中
表达水平最高的是 ＢｎＬＥＣ２⁃４， ＢｎＬＥＣ２⁃３ 表达最低。
在蛋白进化分析结果中，ＢｎＬＥＣ２⁃３ 源于白菜 ＢｒＬＥＣ２⁃
２，在所检测分析的白菜器官中 ＢｒＬＥＣ２⁃２ 表达水平较
低，说明 ＢｒＬＥＣ２⁃２ 基因融入油菜基因组后，其表达模
式基本没有发生明显改变。 油菜 ＢｎＬＥＣ２⁃２ 源自甘蓝
ＢｏＬＥＣ２⁃１ 基因，ＢｏＬＥＣ２⁃１ 基因在甘蓝各器官的表达
水平均较低。 然而，在油菜中 ２１ｄ 的角果中表达水平
却较高。
上述结果表明，油菜、白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 同源基因
均能在种子发育时期表达，但是 ＬＥＣ２ 同源基因在这
三种芸薹属植物种子中的表达模式不同。 作为蔬菜作
物甘蓝，种子发育早期 ＢｏＬＥＣ２ 同源基因就开始高水
平表达，然后逐渐降低；而作为油料作物白菜和油菜
ＬＥＣ２ 同源基因在种子发育的早期基本不表达或低水
平表达，当种子发育到中期（角果发育到 ２１ 天）迅速
高水平表达，该时期为油菜种子开始合成储存物质阶
段［２２］。 因此， ＬＥＣ２ 基因表达模式的改变可能与
ＢｎＬＥＣ２ 调控油菜种子中油脂和蛋白质合成密切相
关。
注：利用 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测油菜 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因植物发育不同组
织中的表达水平，图中数值为三个技术重复的平均值和标准
　 　 　 差，内参为油菜 ＢｎＡＣＴＩＮ。
Ｎｏｔｅ： Ｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｉｎ
ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ． Ｄａｔａ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｒｅ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒａｐｈ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ
　 　 　 ｃｏｎｔｒｏｌ ｗａｓ ＢｎＡＣＴＩＮ．
图 ６　 油菜 ＢｎＬＥＣ２ 表达谱
Ｆｉｇ． ６　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＢｎＬＥＣ２ ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｅ
ｏｒｇａｎｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｂ． ｎａｐｕｓ．
３　 讨论
本研究克隆了油菜基因组中 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 同源基
因，利用生物信息软件对 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 基因及其双亲
ＬＥＣ２ 基因的进化关系，以及这些同源基因的时空表达
模式进化了分析。 发现进化保守的 ＬＥＣ２ 基因尽管在
进化中基因较为保守，但是在不同的物种中其表达模
式已随着物种的进化与驯化发生改变。
油菜与拟南芥是十字花科植物，由白菜和甘蓝基
因组融合加倍而成的油料作物。 白菜、甘蓝、油菜和拟
南芥由共同的十字花科祖先分化演变而成［１９ － ２０］。 鉴
于 ＬＥＣ２ 基因对胚胎发育起重要作用，尽管在十字花
科物种演变进化和驯化的过程中发生不同的变异，但
是整体上 ＬＥＣ２ 基因是相对保守的。 作为油菜的双亲
白菜和甘蓝 ＬＥＣ２ 基因与油菜中 ＢｎＬＥＣ２ 基因差异较
０８１２
　 １２ 期 油菜 ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２ （ＢｎＬＥＣ２）基因的克隆及表达分析
小，最低相似度达 ９７􀆰 ８５％ （图 ２）。 因此，在进化上
ＬＥＣ２ 较为保守，在功能上也相对保守。
在拟南芥中 ＡｔＬＥＣ２ 是调控种子胚胎发育和储存
物合成以及植物生长发育的关键转录因子。 ＡｔＬＥＣ２
编码含有 Ｂ３ 结构域的转录因子，能够与含有 ＲＹ⁃ｍｏｔｉｆ
的 ＤＮＡ序列结合，具有 ＲＹ⁃ｍｏｔｉｆ的基因主要是种子特
异表达相关的基因［１５］。 拟南芥 Ａｔｌｅｃ２ 突变体种子储
藏物质含量降低，特别是种子中的油脂含量急剧降
低［１５］。 本研究克隆的油菜 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因也
存在 Ｂ３ 结构域，尽管在 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 蛋白 Ｂ３ 结构域
存在个别氨基酸的改变，然而整体上未改变 Ｂ３ 结构
域构件。 因而，理论上 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 蛋白也能够与油
菜基因组中均含有 ＲＹ⁃ｍｏｔｉｆ的 ＤＮＡ序列结合，能调控
种子特异相关基因的表达。 也可能鉴于不同 ＢｎＬＥＣ２
蛋白 Ｂ３ 结构域氨基酸的差异，导致特异结合的下游
基因启动子 ＲＹ⁃ｍｏｔｉｆ 的 ＤＮＡ 序列有差别，使得
ＢｎＬＥＣ２ 基因调控具有差异性。
在模式植物拟南芥研究中，过表达 ＡｔＬＥＣ２ 使转基
因植物致死或种子畸形，种子含油量降低［２０］。 基于油
菜为白菜和甘蓝杂交形成的四倍体作物，在拟南芥基
因组中 ＡｔＬＥＣ２ 仅有 １ 个拷贝（ＡＴ１Ｇ２８３００）。 白菜和
甘蓝基因组中有 ２ 个 ＬＥＣ２ 基因，而油菜有 ４ 个
ＢｎＬＥＣ２ 基因。 如果油菜 ４ 个 ＢｎＬＥＣ２ 基因如拟南芥
一样均同时高水平表达，那么油菜各组织中 ＢｎＬＥＣ２
基因剂量是拟南芥的 ４ 倍，是白菜和甘蓝的两倍。 如
此高剂量的 ＢｎＬＥＣ２ 可能会影响油菜种子的生长发
育。 如果研究表明，多倍体植物通过调控部分同源基
表达水平的方式，从而控制组织中基因剂量［２３ － ２５］。 本
研究利用荧光定量 ＰＣＲ检测结果也发现，白菜和甘蓝
两个 ＬＥＣ２ 基因，在植物各器官中仅有一个同源基因
高水平表达，其余基因低水平表达或不表达。 ４ 个油
菜 ＢｎＬＥＣ２ 同源基因有 ３ 个同源基因在油菜角果发育
２１ｄ时能高水平表达，而另外一个则低水平表达。 说
明芸薹属植物基因组多倍化后的进化过程中，通过改
变 ＬＥＣ２ 同源基因的表达模式来维持 ＬＥＣ２ 在种子中
的基因剂量水平，从而保证油菜种子的正常生长发育。
除了改变表达模式控制种子中 ＬＥＣ２ 基因剂量
外，芸薹属植物在驯化的过程中，由于驯化的目的不一
样［２６ － ２７］，在不同的物种中 ＬＥＣ２ 的时空模式是不一样
的。 甘蓝主要驯化为蔬菜作物，其 ＢｏＬＥＣ２ 的表达模
式明显与驯化作为油料作物的白菜和油菜 ＬＥＣ２ 的表
达模式不一致。 在白菜和油菜种子发育过程中，ＬＥＣ２
的表达时期主要在种子发育的中期高水平表达，在早
期表达水平较低；而甘蓝主要在种子发育的早期，然后
逐渐降低。 白菜和油菜 ＬＥＣ２ 的表达模式与种子油脂
合成的模式相一致［２２］，这个结果与模式植物拟南芥研
究的结果相似［１５］。
４　 结论
ＬＥＣ２ 作为种子发育的重要调控子控制种子储存
物质的合成，在进化上 ＬＥＣ２ 基因较为保守，芸薹植物
在进化和驯化的过程中，ＬＥＣ２ 的表达模式随着驯化发
生改变，在油料作物白菜型油菜和甘蓝型油菜中 ＬＥＣ２
主要在种子发育的中期开始表达，这些结果为进一步
研究 ＢｎＬＥＣ２ 调控油菜种子含油量奠定基础。
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ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｓ， ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｉｌ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ， ｗｈｉｌｅ
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Ｇｕａｎ Ｒ， Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｇ， Ｚｕｏ Ｊ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｅｄ ｏｉｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
１８１２
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
ｉｎ ｃａｎｏｌａ ｂｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＬＥＡＦＹ
ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ１ ａｎｄ ＬＥＣ１ － ＬＩＫＥ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｅｅｄｓ ［ Ｊ］ ． Ｐｌａｎｔ
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ｆｒｏｍ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９８， １６２
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ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｉｌ ａｎｄ ｓｅｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｅａｖｅｓ
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ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ２ ｔｏｗａｒｄｓ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ
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ｎａｐｕｓ Ｌ． ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ
［Ｊ］ ． ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１０， １０： ５４ － ６２
［２０］　 Ｗａｎｇ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｓｕｎ Ｒ， Ｗｕ Ｊ， Ｌｉｕ Ｓ， Ｂａｉ Ｙ， Ｍｕｎ ＪＨ，
Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ｉ， Ｃｈｅｎｇ Ｆ， Ｈｕａｎｇ Ｓ， Ｌｉ Ｘ， Ｈｕａ Ｗ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｘ，
Ｆｒｅｅｌｉｎｇ Ｍ， Ｐｉｒｅｓ ＪＣ， Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＡＨ， Ｃｈａｌｈｏｕｂ Ｂ， Ｗａｎｇ Ｂ，
Ｈａｙｗａｒｄ Ａ， Ｓｈａｒｐｅ ＡＧ， Ｐａｒｋ ＢＳ， Ｗｅｉｓｓｈａａｒ Ｂ， Ｌｉｕ Ｂ， Ｌｉ Ｂ， Ｌｉｕ
Ｂ， Ｔｏｎｇ Ｃ， Ｓｏｎｇ Ｃ， Ｄｕｒａｎ Ｃ， Ｐｅｎｇ Ｃ， Ｇｅｎｇ Ｃ， Ｋｏｈ Ｃ， Ｌｉｎ Ｃ，
Ｅｄｗａｒｄｓ Ｄ， Ｍｕ Ｄ， Ｓｈｅｎ Ｄ， Ｓｏｕｍｐｏｕｒｏｕ Ｅ， Ｌｉ Ｆ， Ｆｒａｓｅｒ Ｆ，
Ｃｏｎａｎｔ Ｇ， Ｌａｓｓａｌｌｅ Ｇ， Ｋｉｎｇ ＧＪ， Ｂｏｎｎｅｍａ Ｇ， Ｔａｎｇ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｈ，
Ｂｅｌｃｒａｍ Ｈ， Ｚｈｏｕ Ｈ， Ｈｉｒａｋａｗａ Ｈ， Ａｂｅ Ｈ， Ｇｕｏ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｊｉｎ
Ｈ， Ｐａｒｋｉｎ ＩＡ， Ｂａｔｌｅｙ Ｊ， Ｋｉｍ ＪＳ， Ｊｕｓｔ Ｊ， Ｌｉ Ｊ， Ｘｕ Ｊ， Ｄｅｎｇ Ｊ， Ｋｉｍ
ＪＡ， Ｌｉ Ｊ， Ｙｕ Ｊ， Ｍｅｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｍｉｎ Ｊ， Ｐｏｕｌａｉｎ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｊ，
Ｈａｔａｋｅｙａｍａ Ｋ， Ｗｕ Ｋ， Ｗａｎｇ Ｌ， Ｆａｎｇ Ｌ， Ｔｒｉｃｋ Ｍ， Ｌｉｎｋｓ ＭＧ，
Ｚｈａｏ Ｍ， Ｊｉｎ Ｍ， Ｒａｍｃｈｉａｒｙ Ｎ， Ｄｒｏｕ Ｎ， Ｂｅｒｋｍａｎ ＰＪ， Ｃａｉ Ｑ，
Ｈｕａｎｇ Ｑ， Ｌｉ Ｒ， Ｔａｂａｔａ Ｓ， Ｃｈｅｎｇ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｓ， Ｈｕａｎｇ Ｓ，
Ｓａｔｏ Ｓ， Ｓｕｎ Ｓ， Ｋｗｏｎ ＳＪ， Ｃｈｏｉ ＳＲ， Ｌｅｅ ＴＨ， Ｆａｎ Ｗ， Ｚｈａｏ Ｘ， Ｔａｎ
Ｘ， Ｘｕ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｑｉｕ Ｙ， Ｙｉｎ Ｙ， Ｌｉ Ｙ， Ｄｕ Ｙ， Ｌｉａｏ Ｙ， Ｌｉｍ Ｙ，
Ｎａｒｕｓａｋａ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｚ， Ｌｉ Ｚ， Ｗａｎｇ Ｚ， Ｘｉｏｎｇ Ｚ， Ｚｈａｎｇ Ｚ；
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｓｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｃｒｏｐ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ［ Ｊ ］ ． Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２０１１， ４３（１０）： １０３５ － １０３９
［２１］ 　 Ｙｕ Ｊ， Ｚｈａｏ Ｍ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｔｏｎｇ Ｃ， Ｈｕａｎｇ Ｓ， Ｔｅｈｒｉｍ Ｓ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｈｕａ
Ｗ， Ｌｉｕ Ｓ． Ｂｏｌｂａｓｅ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｏｌｅｒａｃｅａ ［Ｊ］ ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２０１３， １４： ６６４ － ６７０
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研究进展［Ｊ］ ． 中国农学通报， ２００６，（４）： ２５５ － ２５９
［２３］　 Ｃｈｅｎ Ｚ Ｊ． Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ
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［２４］　 Ｂｏｔｔｌｅｙ Ａ， Ｃｈａｐｍａｎ Ｎ Ｈ， Ｋｏｅｂｎｅｒ Ｒ Ｍ， Ｈｏｍｏｅｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｈｅａｔ ｃａｌｌｕｓ ［Ｊ］ ． ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００８，
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［２５］　 Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｓ， Ｃｈｅｎ Ｚ Ｊ． Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ
ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ ［Ｊ］ ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１０， １３（２）：
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（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ． ）的辐射效应［Ｊ］ ． 核农学报，１９９２，６（４）： １９９
－ ２０６
２８１２
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
２０１４，２８（１２）：２１７５ ～ ２１８３
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２
（ＢｎＬＥＣ２） ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
ＴＡＮ Ｈｅ⁃ｌｉｎ１ 　 ＷＡＮＧ Ｌｉ⁃ｈｕａｎ１ 　 ＬＩ Ｙｕｎ１ 　 ＬＡＮ Ｊｉｅ１ 　 ＴＡＮＧ Ｑｉａｎ⁃ｙｉｎｇ１ 　 ＹＥ ＷＥＮ⁃ｘｕｅ１ 　 ＸＩＡＮＧ Ｘｉａｏ⁃ｅ２
（ １Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ　 ２１００９５；２ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，
Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ　 ２１００９５）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ ２， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ Ｂ３ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ
ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ａｓ ａｌｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ ｏｉｌｓｅｅｄ ｐｌａｎｔ， Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
（ＡＡＣＣ， ２ｎ ＝ ３８） ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ （ＡＡ， ２ｎ ＝ ２０） ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ
（ＣＣ， ２ｎ ＝ １８ ） ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｇｅｎｅｓ． Ｈｅｒｅ， ｗｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｆｏｕｒ ＢｎＬＥＣ２ｓ， ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｔｈｅ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＡｔＬＥＣ２． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ＢｎＬＥＣ２ｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ
ｉｔｓ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｓ ｏｆ ＢｒＬＥＣ２ ａｎｄ ＢｏＬＥＣ２， ａｎｄ ｏｎｌｙ ｌｉｍｉｔｅｄ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｓ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ＢｎＬＥＣ２， ＢｒＬＥＣ２ ａｎｄ ＢｏＬＥＣ２．
Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ＢｎＬＥＣ２ｓ ｗｅｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｏｒ Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｏｌｅｒａｃｅａ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｐａｒｔｉａｌ ＢｎＬＥＣ２ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｗｅｒｅ ｓｉｌｅｎｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢｎＬＥＣ２ ｗｅｒｅ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｔｏ ｉｔｓ ＢｏＬＥＣ２ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ａｎｄ ＢｒＬＥＣ２ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ
ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ， ａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｍａｉｎｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｉｌ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｂ． ｎａｐｕｓ． Ｔａｋｅｎ
ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｔｏｇｅｔｈｅｒ， ｗｅ ｓｐｅｃｕｌａｔｅｄ ｔｈａｔ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ＢｎＬＥＣ２ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓ ｏｆ ｏｉｌ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
ｓｅｅｄｓ ｖｉａ ｔｈｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ＢｎＬＥＣ２ ｈｏｍｏｌｏｇｓ． Ｏｕｒ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ＢｎＬＥＣ２ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｉｌ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｅｅｄｓ
ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ． ｎａｐｕｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ； ＢｎＬＥＣ２； Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅ； Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ； Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
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