为了研究磷脂酶C基因的结构与功能,采用RT-PCR和RACE技术从盐藻中克隆出了一种磷脂酶C基因(GenBank Accession No.KF573428),命名为DsPLC,并对其进行了生物信息学分析和盐胁迫条件下的表达分析.结果表明,DsPLC的cDNA全长2 628 bp,开放阅读框1 782 bp,编码 593个氨基酸.该蛋白质为亲水性稳定蛋白,没有信号肽,也没有跨膜区域,是一种非跨膜蛋白,存在多个潜在的磷酸化位点,二级结构的主要元件为无规卷曲和α -螺旋.进一步的进化分析结果表明,盐藻与衣藻、团藻的亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果显示,正常情况下DsPLC的表达量很低,当受到高盐胁迫时表达量急剧升高,且在胁迫4 h时表达量达到最高,是对照组的10倍左右,差异极显著(P<0.01),表明DsPLC可能在盐藻抵御外界盐胁迫的过程中起重要作用.这些研究结果为进一步阐明DsPLC的功能及其作用机制奠定了分子基础.
全 文 ：!核 农 学 报!"#$%!"&"$## $$’’( )$’&#
!"#$%&’"()#*’+&$,-$.*#’/#$&’0*.+%*+1
收稿日期!"#$(*$$*".!接受日期!"#$%*#.*#$
基金项目!国家自然科学基金项目"(#A’""%#!($%’""H## !辽宁省教育厅科学技术研究项目 ""##&F#"(#
作者简介!韩冬梅!女!主要从事生物化学与分子生物学研究% /*0123$U:0&A#$".4$"H8;J0
通讯作者!柴晓杰!女!教授!主要从事海洋生物分子生物学研究% /*0123$;=6H(4$"H8;J0
文章编号!$###*&..$""#$%#$#*$’’(*#&
杜氏盐藻磷脂酶 I基因 L12A<的克隆及盐胁
迫下的表达分析
韩冬梅!柴晓杰!王逸云!刘世才!岳文静
"大连海洋大学T农业部北方海水增养殖重点实验室T辽宁省海洋生物资源恢复
与生境修复重点实验室!辽宁 大连!$$H#"(#
摘!要!为了研究磷脂酶 I基因的结构与功能!采用 WF*VIW和 W,I/技术从盐藻中克隆出了一种磷脂
酶 I基因"G95+15N ,;;9PP2J5 EJ8kD.’(%"&#!命名为 L12A条件下的表达分析’ 结果表明!L12A<的 ;-E,全长 " H"&
酸化位点!二级结构的主要元件为无规卷曲和 , @螺旋’ 进一步的进化分析结果表明!盐藻与衣藻$团
藻的亲缘关系最近’ 实时荧光定量 VIW结果显示!正常情况下 L12A<的表达量很低!当受到高盐胁迫
时表达量急剧升高!且在胁迫 % U 时表达量达到最高!是对照组的 $# 倍左右!差异极显著"2v#Q#$#!表
明 L12A<可能在盐藻抵御外界盐胁迫的过程中起重要作用’ 这些研究结果为进一步阐明 -PVBI的功
能及其作用机制奠定了分子基础’
关键词!杜氏盐藻&磷脂酶 I&全长 ;-E,&生物信息学分析&实时荧光定量 VIW
-SC$$#Q$$&HAT682PP58$##*&..$Q"#$%Q$#8$’’(
!!杜氏盐藻"L#%&’.+’& 1&’.%&!简称盐藻#是一种没
有细胞壁的单细胞真核绿藻!具有极强的耐盐能力!能
在含 #Q#. ).Q. 0J3)B@$ E1I3的培养液中生长!简单
的细胞结构和便利的培养条件使其成为研究植物耐盐
机制的重要模式生物 &$’ !也是寻找植物耐盐基因的理
想生物% 研究表明盐藻在高盐环境下受到渗透胁迫
时!体内的多种代谢途径会发生很大改变!短时间内通
过细胞体积的改变来调节渗透压平衡!之后再通过甘
油的合成与转化来恢复细胞的正常形态和体积 &"’ !但
其耐盐调控机制和信号转导途径目前还没有完全弄清
楚%
盐胁迫下参与调控植物耐盐生理响应的两大类主
要信号转导途径---I1" K依赖型信号转导通路和丝裂
原活化蛋白激酶"Z,Vk#级联反应途径 &(’ % 磷脂酶 I
"YUJPYUJ32Y1P9I!VBI#是植物磷脂信号系统的重要组
分 &%’ ! 能 水 解 磷 脂 酰 肌 醇 @ %! . @ 二 磷 酸
"YUJPYU1[2:M325JP2[J3@%!. @<2PYUJPYU1[9!VCV" #产生肌
醇 @$!%!. @三磷酸 "25JP2[J3@$!%!. @[X2YUJPYU1[9!
CV(#和二酰甘油 " :21;M3L3M;9XJ3!-,G#!其中 CV( 可导
致细胞内 I1" K的释放% 由此看出 VBI处于 I1" K和
-,G这两个重要第二信使的上游 &.’ !研究它的生物学
特征及功能具有非常重要的意义% 正常情况下!VBI
的表达量很低!当植物处于逆境"干旱(低温(高盐(受
伤(病源侵染等#中时!植物 VBI会被激活并且表达量
急剧升高!一方面导致膜破坏!另一方面酶解产物可将
信号级联放大!从而引起植物全身的抗逆反应% 自
j101[J等从拟南芥中克隆了第一个植物 VBI&H’ 后!
VBI的结构和理化性质已经基本清楚 &’’ % 随后在大
豆 &&’ (马铃薯 &A’ (烟草 &$#’ (豇豆 &$$’等植物中都克隆出
了 VBI!对 VBI功能的研究也更加深入% IU1Y015 &$"’
研究证实 VBI在植物抵御逆境中起到重要作用!
]2X1M101等 &$(’的研究结果表明干旱或盐胁迫下 VBI
基因的表达量会急剧增加% 但相比动物!植物中 VBI
的功能有待于进一步研究!盐藻中目前还未见该方面
(’’$
核!农!学!报 "& 卷
的研究报道%
本文采用 WF*VIW和 W,I/技术从盐藻中克隆出
了 L12A<基因!进行生物信息学分析初步了解了其结
构与功能!然后通过实时荧光定量分析进一步确定
L12A<在盐藻耐盐机制中的作用!为以后深入探讨
-PVBI的功能及其作用机制奠定了基础%
!"材料与方法
!#!"藻种
盐藻由大连海洋大学水生生物学实验室提供!培
养液为经过高温高压灭菌的康威试液!培养条件为 ".
^!光照强度 $ ".# 3=!$" U 光照T$" U 黑暗交替静置培
养!每天摇晃 " )( 次以防止贴壁影响盐藻生长!平均
每隔两周将盐藻转接到新鲜的培养液中以保持其生命
力%
表 !">@V扩增中使用的引物序列
%&’()!">+3:)+/)X-)18)/-/);0,+>@V&:.(3038&23,1
引物名称
VX209X5109P
引物序列" .n@(n#
VX209XP9o795;9P
引物用途
,YY32;1[2J5
ZV$ ,IEG,EGFGF,jI,,G,j,FG 核心保守区上游引物
ZV" WFF?GIWFGWFFjFII,FGGF 核心保守区下游引物
ZV( jFFG,IW,,I,WGFIWFIIFF"其中 j_ITF*W_,TG*E_,TFTITG# 核心保守区下游引物
﹡ aVZBJ5L"#8% "0J3)B@$ # IF,,F,IG,IFI,IF,F,GGGI,,GI,GFGGF,FI,,IGI,G,GF (n!.n通用引物
﹡ aVZ?UJX["" "0J3)B@$ # IF,,F,IG,IFI,IF,F,GGG (n!.n通用引物
﹡ EaV ,,GI,GFGGF,FI,,IGI,G,GF (n!.n巢式引物
G?V$ GGI,I,,I,,IF,IIFG,GIGGI,,II (n端外侧引物
G?V" FGG,GI,GG,GI,II,,I,,G (n端内侧引物
G?V( GGFFI,G,IIGFGGGI,IFFFG (n端内侧引物
G?V% GFFIIIIFGIFFI,I,GIIIIIG,IFI .n端外侧引物
G?V. FGFFGFGIIIGIFGIF,,FG,,G .n端内侧引物
SV$ ,I,,I,IGI,,FG,,G,,I,,GI SWD克隆上游引物
SV" I,,III,G,GFGIIF,,,IG,FG SWD克隆下游引物
c@P95P9 I,,II,IIFII,GFFFI,,FG 目的基因上游引物
c@15[2P95P9 IFII,IFGFIFIFIIFFFIFI 目的基因下游引物
$&? @P95P9 FFGGGF,GFIGGGIFGGFI 内参基因上游引物
$&? @15[2P95P9 IGIFGIGFXIFXI,FIGFF 内参基因下游引物
!!注$﹡aVZ(EaV由 ?Z,WFFZ W,I/试剂盒提供%
EJ[9$﹡aVZ15: EaVYXJ\2:9:
大肠杆菌"E1*;+$.*;.& *"’.#-].,菌株由本实验室
保存!质粒 YZ-$& @F\9;[JX购自日本 F1k1W1公司%
!#F"主要试剂#盒$
-/VI(WE,2PJFZ V37P( F1o 酶( 限 制 性 内 切 酶
"8&6]#(I.%: %#(-E,Z1XN9X分子量标准 -B@"
###(CVFG(i*L13(W9\9XP9FX15P;X2Y[1P9Z*ZBO"WE1P9
]@#(VX209?;X2Y[WFX91L95[k2[V9Xf9;[W913F209(
?j+WVX902=/=F1oFZCC"V9Xf9;[W913F209#均购自日
本 F1k1W1公 司! ?Z,WF9XFZ W,I/ ;-E, ,0Y32*
f2;1[2J5 k2[购自中国 I3J5[9;U 公司!?15VX9Y 柱式 -E,
胶回收试剂盒(?15VX9Y 柱式质粒 -E,小量抽提试剂
盒购自生工生物工程"上海#有限公司!其他试剂均为
国产分析纯%
!#K"引物序列
试验中所有引物序列见表 $!由生工生物工程"上
海#有限公司合成%
!#P";*!<=全长 8RET的克隆
$Q.Q$!盐藻总 WE,的提取!如 $Q$ 所述!将盐藻培
养 . )’:!使其处于对数生长后期!取 "# 0B藻液于室
温下 & ### L离心 " 025!用 $ 0BWE,2PJFZV37P裂解藻
细胞以提取总 WE,% 所得 WE,的质量通过非变性琼
脂糖凝胶电泳检测"$R 琼脂糖凝胶!H. O!(. 025#%
$Q.Q"!L12A<中间片段的扩增!本实验室之前的研
%’’$
!$# 期 杜氏盐藻磷脂酶 I基因 L12A<的克隆及盐胁迫下的表达分析
究结果表明!盐藻的基因 "L10B2Q&$%’ (L1G,2Q&$.’ (
序列利用 I37P[13d进行多序列比对!根据其保守区域
的序列设计一对简并引物$ZV$ 和 ZV"% 将盐藻总
WE,利用 W9\9XP9FX15P;X2Y[1P9Z*ZBO "WE1P9]@#
试剂盒反转录得到 ;-E,!以之为模板!ZV$ 和 ZV" 为
引物进行 VIW扩增!扩增条件如下$A% ^预变性 .
025*A% ^变性 (# P!.& ^退火 (# P!’" ^延伸 (# P!(.
个循环*’" ^延伸 $# 025% 采用 $Q.R的非变性琼脂
糖凝胶电泳分离 VIW扩增产物!切胶并使用 ?15VX9Y
柱式 -E,胶回收试剂盒回收目的片段% 然后采取 F*
,克隆的方法将目的片段连接到 YZ-3& @F\9;[JX上
"$H ^!连接过夜#!再转化到大肠杆菌 -].,的感受
态细胞中!将转化细菌涂布在带有 CVFG(i*G13和
,0Y K抗性的 B+平板上!(’ ^过夜培养!挑取白斑即
阳性单克隆% 经质粒 VIW和双酶切 "8&6]#(I.%:
%#鉴定!由生工生物工程"上海#有限公司完成测序!
使用 +2J/:2[软件进行序列分析%
$Q.Q(!L12A<的 (n@W,I/扩增!根据得到的中间
段核苷酸序列!用 VX209XVX9029X.Q# 软件设计 $ 对巢
式引物 G?V$ 和 G?V"*参考 $Q.Q" 中的 I37P[13d比对
结果!根据下游区域的保守序列设计 $ 条简并引物
ZV(% 按照 ?Z,WF9XFZ W,I/;-E,,0Y32f2;1[2J5 k2[
反转录得到 ;-E,!以之为模板!G?V$ 和 aVZ为引物
进行第一轮 VIW扩增!扩增条件$A% ^预变性 . 025*
A% ^变性 (# P!’" ^延伸 ( 025!. 个循环*A% ^变性
(# P!’# ^退火 (# P!’" ^延伸 ( 025!. 个循环*A% ^
变性 (# P!H. ^退火 (# P!’" ^延伸 ( 025!(# 个循环*
’" ^延伸 ’ 025% 以适度稀释的第 $ 轮 VIW扩增产物
为模板!G?V" 和 ZV( 为引物进行第 " 轮扩增!扩增条
件$A% ^预变性 . 025*A% ^变性 (# P!.H ^退火 (# P!
’" ^延伸 $ 025 (# P!(. 个循环*’" ^延伸 & 025 (#
P% 该目的片段的回收(检测(测序以及序列分析等同
$Q.Q"%
将测得的序列与中间段核苷酸序列进行拼接!根
据拼接结果利用 VX209XVX9029X.Q# 软件设计一对巢
式引物 G?V$ 和 G?V(% 以上述第 $ 轮 VIW产物为模
板!G?V( 和 EaV为引物进行第 " 轮扩增!扩增条件如
下$A% ^预变性 . 025*A% ^变性 (# P!H" ^退火 (# P!
’" ^延伸 " 025!(. 个循环*’" ^延伸 & 025% 该目的
片段的回收(检测(测序以及序列分析等同 $Q.Q"%
$Q.Q%!L12A<的 .n@W,I/扩增!将测得的 (n@
W,I/序列和中间段核苷酸序列进行拼接!根据拼接
结果利用 VX209XVX9029X.Q# 软件设计一对巢式引物
G?V% 和 G?V.% 按 照 ?Z,WF 9XFZ W,I/ ;-E,
,0Y32f2;1[2J5 k2[反转录得到 ;-E,!以之为模板!G?V%
和 aVZ为引物进行第 $ 轮 VIW扩增!扩增条件同
$Q.Q( 中的第一轮% 以适度稀释的第 $ 轮 VIW产物为
模板!G?V. 和 EaV为引物进行第 " 轮扩增!扩增条件
如下$A% ^预变性 . 025*A% ^变性 (# P!H$ ^退火 (#
P!’" ^延伸 $ 025!(. 个循环*’" ^延伸 $# 025% 该
目的片段的回收(检测(测序以及序列分析等同
$Q.Q"%
$Q.Q.!L12A<开放阅读框的扩增!根据拼接得到的
基因全长核苷酸序列!对其开放阅读框"SWD#预测分
析后!在其 SWD两端利用 VX209XVX9029X.Q# 软件设计
一对特异性引物 SV$ 和 SV"% 按照方法 $Q.Q" 获取模
板 ;-E,!SV$ 和 SV" 为引物进行 VIW扩增!扩增条
件$A% ^预变性 . 025*A% ^变性 (# P!.. ^退火 (# P!
’" ^延伸 ( 025!(. 个循环*’" ^延伸 $# 025% 该目
的片段的回收(检测(测序以及序列分析等同 $Q.Q"%
!#G"生物信息学分析
利用 +2J/:2[软件查找 L12A<的开放阅读框!并
将其翻译成氨基酸*利用 /=Y1PM软件包中的 VXJ[V1X10
工具分析其基本理化性质*利用其他在线工具或相关
软件对 -PVBI进行更多方面的预测分析!包括信号肽
预测(跨膜区域预测(亚细胞定位分析(功能位点预测(
磷酸化位点预测(蛋白质的二级结构预测!并且通过蛋
白质同源建模数据库预测其三维结构!所使用的模板
为 $:6=+""Q(# ,#% 将 -PVBI在 EI+C数据库中进行
+31P[分析!获取相似性在 H#R以上的 $% 个物种的蛋
白序列!将所有序列一起利用 I37P[13d软件进行相似
性比对!然后使用 Z/G,. 软件对其进行聚类分析并
构建系统进化树"VJ2PPJ5 模型!自展检验 $### 次#%
!#]"实时荧光定量 >@V
将在正常条件"培养液含 $Q. 0J3)B@$E1I3#下生
长的盐藻培养至对数生长期!然后向培养液中加入
E1I3至其最终盐浓度为 ( 0J3)B@$!分别离心收集胁
迫 #"未胁迫#("(%(H($" 和 "% U 的盐藻细胞!提取其
总 WE,% 所得 WE,的质量均通过琼脂糖凝胶电泳检
测"同 $Q.Q$#!并使用紫外分光光度法测定其纯度与
浓度% 将质量符合实验要求的 WE,利用 VX209?;X2Y[
WFX91L95[k2[V9Xf9;[W913F209试剂盒方法反转录得
到模板 ;-E,%
根据获得的 L12A<基因序列!利用 VX209XVX9029X
.Q# 软件设计目的基因实时荧光定量 VIW引物 c*
P95P9和 c*15[2P95P9!目的扩增产物的长度为 ""’
核!农!学!报 "& 卷
$&? 内参基因 &$’’ 的实时荧光定量 VIW引物为 $&?*
P95P9和 $&?*15[2P95P9% 根据 ?j+WVX902=/=F1oFZ CC
"V9Xf9;[W913F209#试剂盒实时荧光定量 VIW的方法
在 ,+C’(## 荧光定量 VIW 仪上 进 行 反 应! 采 用
" @"" I[法计算 L12A<的相对表达量 &$&’ %
$"结果与分析
$#!"盐藻 ;*!<=全长 8RET的获得
"Q$Q$!盐藻 L12A<中间片段的获得!以盐藻总 WE,
反转录得到的 ;-E,为模板!按方法 $Q.Q" 进行 VIW
扩增!VIW产物电泳结果见图 $*,!显示在 ".# ).##
进行相似性搜索!结果显示该片段与衣藻磷脂酶 I基
因"iVp##$HAH.#"Q$#的相似性为 A&R!初步确定该序
列是盐藻的一种磷脂酶 I基因的片段!在此基础上进
行下一步试验%
注$,中间片段的扩增*+(I(n@W,I/第一次(第二次的扩增*-.n@W,I/的扩增*/开放阅读框的扩增
Z$-E,分子量标准 -B@" ###*$$VIW产物%
EJ[9$ ,10Y32f2;1[2J5 Jf02::39fX1L095[+(I(n@W,I/10Y32f2;1[2J5 -.n@W,I/10Y32f2;1[2J5 /SWD10Y32f2;1[2J5
Z$-E,01XN9X-B@" ###*$$ VIWYXJ:7;[8
图 !"盐藻 ;*!<=基因 >@V产物的琼脂糖凝胶电泳分析
4356!"T5&+,/)5)()()82+,.9,+)/3/,0;*!<=>@V.+,;-82/
"Q$Q"!盐藻 L12A<全长 ;-E,序列的获得!按方法
$Q.Q( 进行 (n@W,I/扩增!VIW产物电泳结果分别
见图 $*+和 $*I% 图 $*+显示在 $ ### )" ###
$Q.Q% 进行 .n@W,I/扩增!VIW产物电泳结果见图
$*-!显示在 ".#
段序列进行拼接!得到一条长为 " H"&
果见图 $*/!经测序!获得一条长为 $ A(.
"Q"Q$!基本理化性质分析!经 +2J/:2[软件分析得
知!从盐藻中克隆得到一条长度为 " H"&
的分子式为 I"A$H]%.H% E&$&S&A( ?".! 共有 A "$H 个原子!
相对分子质量为 H H$’#Q’ -1!有 H& 个正电荷残基
",XLKBMP#!H’ 个负电荷残基",PY KG37#% 理论等电
点为 ’Q.A!不稳定性系数为 (AQ’#!将其归类为稳定性
蛋白质% 脂肪系数为 ’"Q#’!亲水性评估分值为 @
#Q.(H!可判断其为亲水性蛋白质%
亚细胞定位预测结果显示 -PVBI中没有信号肽(
线粒体转运肽(叶绿体转运肽和跨膜区域!表明该蛋白
是一种非跨膜蛋白!而且最有可能定位于细胞质基质%
功能区域预测结果显示!($ )$’. 位的氨基酸构成其
i结构域!其中 %H 位和 A( 位的 ]2P是其活性位点"图
( 中箭头所指#*((’ )%"’ 位的氨基酸构成其 j结构
域% 磷酸化位点预测结果显示!-PVBI有潜在的 ’ 个
丝氨酸磷酸化位点(" 个苏氨酸磷酸化位点和 . 个酪
氨酸磷酸化位点% VWSD法预测结果显示 -PVBI的二
级结构中有 "’QHHR的 ,@螺旋("$Q".R的伸展片段
H’’$
!$# 期 杜氏盐藻磷脂酶 I基因 L12A<的克隆及盐胁迫下的表达分析
图 $";*!<=基因的全长序列以及翻译出的氨基酸序列
4356$"4-(I()1529,08RET&1;;);-8);&:31, &83;/)X-)18)/,0;*!<=
和 .$Q$#R的无规卷曲% -PVBI三级结构的预测结果
如图 ( 所示!VM0J3作图所选视角主要为了突出显示
其活性空腔%
"Q"Q"!盐藻 -PVBI的进化分析!由图 % 可知!盐藻
与 衣 藻 " <;’&65="6"%&1$+.%;&$=/.#( 团 藻 "T"’>"7
*&$/+$.(?%&-&$.+%1.1#聚为一支!表明盐藻与二者的亲
缘关系最近%
$#F"盐藻 ;*!<=在高盐胁迫条件下的表达分析
分别制作 L12A<和 $&1$@),的标准曲线!得到其
标准曲线的 W" 值分别为 #QAA# 和 #QAA.!表明线性关
系良好!且扩增效率 "/fR#均接近 $##R*熔解曲线
均为单一锐利峰形!没有其他峰值产生!提示二者熔解
温度均一!扩增产物特异性好!没有产生非特异的双链
-E,产物或引物二聚体!可以采用 ?j+WGX995 C法进
行相对定量分析 &$A’ %
利用实时荧光定量 VIW方法研究高盐胁迫条件
下 L12A<基因表达量的变化"图 .#$正常生长条件下
"# U 未胁迫时#!L12A<的表达量很低!当受到高盐
’’’$
核!农!学!报 "& 卷
注$红色标注 ,-螺旋!黄色标注伸展片段!绿色标注无规卷曲%
EJ[9$,@U932=9Pe9X901XN9: e2[U X9:!P[X15: e9X901XN9:
e2[U M93Je!X15:J0;J23e9X901XN9: e2[U LX9958
图 F"7<3//ID,;)(预测 R/>?@的三维结构图
4356F"%9+))I;3:)1/3,1&(8,1/232-23,1,0R/>?@
.+);382);’N 7<3//ID,;)(
"(Q# 0J3)B@$ E1I3#胁迫时! L12A<的表达量明显升
图 K"R/>?@的进化树
4356K">9N(,5)1)2382+)),0R/>?@
高!胁迫 % U 时表达量达到最高!是正常表达量的 $#
倍左右!差异达到极显著水平"4v#Q#$#!H U 时表达
EJ[9$ ##4v#Q#$* # Y v#Q#.?
图 P"盐藻 ;*!<=基因在不同盐胁迫时间下的表达分析
4356P"%9))O.+)//3,1&1&(N/3/,0;*!<=-1;)+/&(2/2+)//
量仍然很高!差异极显著 "4v#Q#$#% 随着胁迫时间
的延长表达量有所下降!但仍高于正常情况下的表达
量!差异显著"4v#Q#.#!表明 L12A<为盐胁迫上调基
因!可能在盐藻应答高盐胁迫的生理过程中起重要作
用%
&’’$
!$# 期 杜氏盐藻磷脂酶 I基因 L12A<的克隆及盐胁迫下的表达分析
F"讨论
磷脂酶 I是植物磷脂信号系统的重要组成部分%
当植物受到不同的刺激!如病原菌侵染(渗透胁迫(高
盐胁迫等!VBI介导的信号转导途径会发挥重要作用%
本研究成功克隆了盐藻 L12A<基因!并对其进行生物
信息学分析% 结果表明!盐藻 -PVBI具有植物磷脂酶
I的典型结构$高度保守的 i和 j催化结构域!与
I1" K结合相关的 I" 结构域% i区和 j区共同组成其
水解位点!其中 i区的 ]2P@%H 和 ]2P@A( 作为其活
性位点!对酶活具有极为重要的作用% 研究表明!这两
个位点的突变不会改变酶的三维结构!但分别将酶活
降低$ ###倍和 $# 倍 &"#’ % 亚细胞定位分析预测-PVBI
位于细胞质基质!有研究表明 VBI正常情况下位于细
胞质基质!激活后 VBI可以结合到细胞膜上!从而完
成其功能 &"$’ %
]2X1M101等 &$(’从拟南芥中克隆得到磷脂酶 I基
因 ,/2A<$0!在正常条件下表达量很低!当遇到干旱(
盐胁迫或低温胁迫等逆境时表达量会急剧升高!本试
验研究结果与之相符$未胁迫时 L12A<表达量很低!
受到盐胁迫时表达量急剧升高!% U 时达到最大值!差
异达到极显著水平 "4v#Q#$#!H U 时表达量仍然很
高!差异极显著"4v#Q#$#!表明 L12A<在盐藻应答高
盐胁迫的生理过程中具有重要作用!为深入探讨盐藻
磷脂酶 I的功能及作用机制提供了参考%
K"结论
本研究采用 WF*VIW和 W,I/技术获得了盐藻
L12A<基因!并首次公布在 EI+C上!G95+15N 登录号
为 kD.’(%"&% 通过生物信息学分析!预测了其结构域
和功能域!包括作为催化结构域的 i区和 j区!与
I1" K结合相关的 I" 结构域!以及 i区的两个关键催
化位点$]2P@%H 和 ]2P@A(*同时还预测了其二级结
构!成功构建三维结构模型!初步了解了其结构% 进化
分析进一步验证了盐藻与衣藻(团藻的亲缘关系最近%
通过实时荧光定量 VIW的方法研究高盐胁迫下
L12A<表达量的变化!结果表明盐胁迫能够促进该基
因的表达!且胁迫 % U 时的表达量达到最高!与对照组
的差异达到极显著水平% 这证明 L12A<在盐藻应答
高盐胁迫的反应中起重要作用!为下一步将其转入其
它植物!研究其能否提高其它高等植物的耐盐性奠定
了基础%
参考文献!
& $ ’!冯书营!刘红涛!李杰!薛乐勋8杜氏盐藻基因工程研究现状及应
用前景&>’8中国生物工程杂志!"##’!"’""# $$#& @$$"
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