全 文 ：,‘ ‘ “ 丹之口
应用二抗技术建立灵敏检测奶中
孕酮含量的酶联免疫分析法
曾宪垠 郭大智
四 川农业大学原子能农业应用研究室 雅安
石 兴文
四 川农业大学奶牛场 雅安
本研 究应 用 二杭技术建立 了灵敏检 奶 中孕酮含童的晦联 免疫分析 法 。
徽 量滴定板首先 包被二杭 羊杭兔 , ℃解育过夜 免疫反应溶液 中包括 川 的
扔样 用分析缓冲液稀释至 川 , 川 畴标孕酮和 川抗体 。 标准 曲线的 试 范围
为 一 孑匕 , 相 当于 一 , 最小 可 沮‘ 量 孑匕 , 结合率对
应的孕明浓度是 孔 样品 浏定 的平均批 内与批 间变异 来数分别是 和
。 样品 浏定的回 收 率为 士 应用该方法 , 定全奶样品所得结果
与应 用 浏定结果 高度相 关 一 , , 。 结果表 明 该方法的灵
敏度是本室 的 倍 , 与直接 包被 孕酮抗体的 相 比较 , 可 以 节约珍贵的杭孕
酮杭体和晦标孕酮 。
关键词 奶 孕酮 晦联免疫分析 二杭
目 舀
鉴于应用放射免疫分析测定孕酮需 昂贵仪器设备和存在放射性污染之不足 , 近年来用酶
联免疫分析法 测定奶 中孕酮含量多见报道 一 ’〕 然而 , 大多数孕酮微量滴定板 的第
次包被采用抗孕酮抗体 , 因包被而造成的误差是影响灵敏度不可忽略的因素 。 为克服这一间
题 , 和 报道了一种应用二抗技术检测乳孕酮的 , 该方法首先将微量滴定
板包被过量的二抗 羊抗兔 , 以与兔孕酮抗体结合 , 从而可使因直接包被抗孕酮抗体所造
成的误差显著减小 。 迄今为止 , 国内在应用二抗 检测乳中孕酮方面尚未见报道 , 本研究的
目的在于应用二抗技术建立一种既能准确测定 、又有较高灵敏度的检测孕酮的 。
材 料 与 方 法
试验材料 聚苯 乙稀微量滴定板 上海科华公 司购买 。 磷酸缓冲液 缓
冲液 , , 包被缓冲液 碳酸氢钠缓 冲液 , , 分析缓冲液 含 的 溶
液 , 底物液 含四甲基联苯胺 , 洗液 含 一 的双蒸水 , 终止液 ‘ 。
此文于 年 月 日收到 。
核 农 学 报 卷
全乳样品的采集以配种当天为 。天 , 采集四川农业大学乳牛场乳牛配种后 。 天乳样 ,
均采集第 夭乳 , 所采集的样品按每 含 的硫柳汞进行分装 , 置于 一 ℃待测 。
免疫试剂 辣根过氧化物酶 一孕酮和羊抗兔 四川农业大学原子能农业应用研究室制
备 孕酮标准品 美国 公司 。 酶免疫测定仪 英国 公司生产 。
试验方法 孕酮的放射免疫测定 采用本室建立的放射免疫分析法测定川 。
酶联免疫分析程序 第 次包被是将微量滴定板包被羊抗兔 , 每孔 川 每孔含
拼 羊抗兔 , ℃孵育过夜 , 持续摇动 。 第 次包被是将板甩干 , 每孔加入 川 分析缓
冲液 , 室温孵育 , 持续摇动 。 用洗液洗板 次 免疫反应 每孔加入 川 酶标孕酮 ,
川 孕酮标准或待测样品 川奶样用分析缓冲液稀释至 川 和 川 抗孕酮抗体 ℃暗处
孵育 , 然后 ℃孵育过夜 , 孵育期间持续摇动 。 洗板 次 , 每孔加入 川底物液 , 室温暗
处孵育 , 持续摇动 每孔加入 川终止液 测定 处的光密度值
结 果
一 酶标孕酮与抗孕酮抗体最佳浓度的选择
利用二维滴度试验 , 选出酶 标孕酮和抗孕酮抗体的最佳工作浓度 , 分别 为 , 。和
。
二 特异性
本研究所使用的抗孕酮抗体由菏兰 博士赠送 , 抗体与孕酮结构类似物 的交
叉反应率 孕酮为 , 雌二醇 、 二氢皋酮和 一轻基孕酮均小于 。 阵‘。〕。
三 灵敏度
随机选取试验 中所得到的 条标准曲线 , 各剂量点平均值建立的标准 曲线即是本研究建
立方法 的标准曲线 。 与 孕酮标准曲线相 比较 图 可知 , 结合率所对应的孕酮
浓度在 和 标准曲线中分别为 和 , 根据此标准 曲线 , 用二倍标准差法
求得 的最小检测量为 孔 。 的灵敏度为 的 倍 。
图
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、
︸引六口月弓︹次巴﹄民团哥如场
孕拐标准品 明。 。
孕酮 标准 曲线与 标准 曲线的比
较
气
四 准确度
用 回收率表示 , 将 已知量的孕酮 高 、 中 、低 加入无孕酮奶中 , 用 进行测定 , 将测定的
孕酮值与实际加入的孕酮量相 比较 , 算出其回收率 表 。
应用二抗技术建立灵 敏检测奶 中孕酮 含童的酶联免疫分析法
表 高
、
中
、
低孕酮含 测定的回 收率
加入孕酮 实际侧值 回收率
。
平均 士
五 精密度
用批 内和批间变异系数表示 严格配制孕酮含量 适中的溶液 , 每次取 个平
行样品 , 分 批进行测定 , 所得的批 内变异系数和批 间变异系数分别为 和 。
六 样品用量对灵敏度的影响
不同样品用量对 灵敏度的影响结果见图 。 从 图 可知 , 当加入 川 、 川 或 川 无孕
酮奶时 , 不影响分析的灵敏度 。 当加入 川 或 川 无孕酮奶时 , 灵敏度下降 。 因此 , 本研究中选
择使用 川 奶样
。
洲侧娜报
。
孕一标准品 欣 一 阳
图 孕酮在缓冲液和无孕酮奶 中的标准曲线
缓冲液 中标准曲线 。 一
” 无孕酮奶 中标准曲线 拜
拜 无孕酮奶 中标准曲线 拜
拜 无孕酮奶 中标准曲线 拜
七 测定样品与 测定样品的相关性
分别用 和 测定了相同的 个样 品 , 即两头奶牛 奶牛号 和 配种后 。
一 天的奶样 , 结果见图 与 个月后直肠触诊结果一致 , 奶牛 号 已受孕 , 奶牛 号未
配上 。 经相关分析 , 得到如下线性 回归方程式 一 ,
·
, ,
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一 一 工凡
一 目人
一 一 从工人
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口种后天盆 扔牛号 二动 伪 , 月《口 叫七“‘
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如奋段
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图 用 认 和 测定的两头奶牛奶 中孕酮含量
而
核 农 学 报 卷
一 测定值 , 一 测定值 。 表明 的测定结果与 测定结果显著相关 , 两者测定
样品结果反映出的乳孕酮变化趋势相似 。
结 论 与 讨 论
本研究采用 等 报道程序 , 用二抗进行第 次包被 , 这种包被形式 , 尽管也存在
包被误差 , 由于二抗包被量远大于结合待测孕酮与酶标孕酮的抗体总量 , 因此 , 与直接包被抗
孕酮抗体相比 , 其包被所造成的误差可显著减小
。 另外 , 与 等 报道的免疫反应每孔
加入 川抗孕酮抗体和 。如 酶标孕酮的 相比较 , 本研究所建立的 , 其免疫反应每
孔只加入抗孕酮抗体和酶标孕酮各 川 , 从而可节约珍贵的抗孕酮抗体和酶标孕酮 。
所建立的 , 其最 小检 测 量达到 孔 , 优于 等 孔 〔吕」、
等 孔 〕、 等 孔 ‘ , 〕、 等 孔 ‘ 、 等 孔 ‘ , 〕和
郭爱珍等 孔 ‘ , 〕所报道的值 , 其灵敏度为本室 的 倍
。 另外 , 样品测定的回收率
士 、批内变异系数 和批间变异系数 均达到要求 。
测定样品值与 测定样品值高度相关 一 , , 表明上述两种方法测
定结果相吻合 。 不难推断 , 应用该 检测乳中孕酮含量可用于母畜早孕诊断和发情检测 , 为
家畜适时配种提供依据 。
综上所述 , 可得 出如下结论 本研究应用二抗技术所建立的 与前人所报道的 相
比较 , 灵敏度更高 , 克服 了直接包被抗孕酮抗体 的不足 , 且大幅度地减少了珍贵试剂 抗
孕酮抗体和酶标孕酮 的用量 , 具有重要的推广应用价值
。
致谢 本研究得到德国慕尼黑技术大学生理研究所 , 博士的帮助
, 孕酮放免测定过程 中得
到本室刘显义研究员
、
陈发菊副研究员和宋雪华实验师的大力协助 , 在此一并致谢
。
参 考 文 献
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杨利 国 等 孕酮醉免疫测定试剂盒及其在家畜获殖上 的应用 南京农业大学学报 , , 一“
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,
刘显义等 毛孕酮的放射免疫分析法 核农学通报 , , “ ,
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,
郭爱珍等 奶牛情期乳汁孕酮的 侧定及在妊振诊断的应用 畜牧兽医杂志 , ,
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