全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 042432203
三种辐照方式对黑松花粉萌发和花粉管生长的影响
李国平　杨鹭生　陈素英　黄志明　胡文英
(莆田学院环境与生命科学系 ,福建 莆田　351100)
摘 　要 :研究了低能氮离子束、紫外线与γ射线辐照对黑松花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明 ,低
能氮离子注入对黑松花粉的损伤效应与γ射线和紫外线照射的不同 ,主要表现在氮离子束剂量2萌发率
效应曲线呈“马鞍型”和氮离子束注入诱发花粉管顶端肿胀 ,这说明低能离子束的作用机制可能与γ射
线和紫外线的不同。认为花粉是研究离子注入生物学效应机制的理想模式系统。
关键词 :黑松 ;花粉 ;花粉管 ;离子注入 ;γ射线辐照 ;紫外线辐照
EFFECTS OF THREE IRRADIATION METHODS ON POLLEN GERMINATION
AND POLLEN TUBE GROWTH OF Pinus thunbegii
LI Guo2ping 　YANGLu2sheng 　CHEN Su2ying 　HUANG Zhi2ming 　HU Wen2ying
( Department of Environment and Life Science , Putian University , Putian , Fujian 351100)
Abstract :The effect of 30 keV nitrogen ion beams , UV andγ2rays irradiation on pollen germination and pollen tube growth of
Pinus thunbergii were investigated. Results showed that the biological effects induced by ion beam implantation were different
from those induced by UV andγ2rays irradiation. The dose response curve of ion implantation treatment presented a particular
‘saddle2like’pattern , and ion implantation also significantly induced pollen tube tip swelling. These results indicated that low
energy ion implantation might work in different way compared to UV andγ2rays irradiation. It was suggested that pollen could
be served as an excellent model system to study the underlying mechanisms responsible for biological effects of ion beam
irradiation at cellular level .
Key words : Pinus thunbergii Parl . ; pollen ; pollen tube ; ion implantation ;γ2rays irradiation ; ultraviolet irradiation
收稿日期 :2007209217 　接受日期 :2008202201
基金项目 :福建省自然科学基金项目 (B0610031) ;福建省莆田市科技项目 (2006N17)
作者简介 :李国平 (19662) ,男 ,福建莆田人 ,教授 ,博士 ,主要从事离子束植物生物技术研究。E2mail :ptlgp @sina. com　　1986 年余增亮首先将低能离子注入到水稻种子内 ,发现离子注入后的水稻生物体如同搭乘阿波罗飞船飞行的玉米一样 ,叶片上出现了黄色的条纹 ,从此人们将低能离子作为新诱变源用于植物的遗传改良[1～3 ] 。20 年来 ,离子束生物技术的应用研究取得丰硕成果 ,但低能离子诱发生物学效应的机理还不很清晰 ,特别是低能离子对生物体的直接损伤效应方面研究还较少。离子束生物技术是我国具有独立知识产权的现代生物技术 ,有必要深入地研究低能离子注入诱发生物学效应的特点和机理。有关离子束作用机理的研究大多以作物种子作为注入对象 ,至于低能离子对细胞水平的直接损伤效应 还知之甚少。花粉接近于单细胞 ,其结构简单 ,易于离体培养 ,是研究离子注入细胞学效应机制的理想材料。本研究选择黑松花粉作为辐照材料 ,比较了氮离子束、紫外线与γ射线对黑松花粉萌发和花粉管生长的影响 ,并对离子束作为新诱变源的作用特点和优势进行初步探讨。1 　材料和方法111 　花粉采集与保存2005 年 4 月中上旬 ,黑松花粉散发期采集刚开始散粉的雄球花 (采自河南郑州滨河公园内人工栽培的
234　 核 农 学 报　2008 ,22 (4) :432～434Journal of Nuclear Agricultural Sciences
成熟黑松树) ,室内自然干燥 ,使花粉散出。收集花粉
置 - 20 ℃冰箱保存。
112 　辐照处理
11211 　氮离子注入 　离子注入机为俄罗斯产 Titan 脉
冲式注入机 ,离子源是能量为 30keV 的氮离子 ,注入剂
量依次为 1、3、5、7、9 和 11 ×1015 ionsΠcm2 。
11212 　γ射线辐照 　辐射源由河南省科学院辐照中
心提供 ,辐照剂量分别为 10、30、50、100、200 和 500Gy ,
剂量率 9Gy/ min。
11213 　紫外线辐照 　采用 30W 紫外灯 ,照射距离
30cm ,照射时间分别为 2、4、6、8、10、15、20min。
以上各处理均以不经任何辐照处理黑松花粉为对
照 ,各处理 3 次重复。
113 　花粉培养与观察
于含 0101 %硼酸 + 0101 %氯化钙 + 0125 %蔗糖的
液体培养基中、28 ℃振荡下进行花粉培养。72h 后过
滤去除培养基 ,以 4 %戊二醛固定 2h ,用 011molΠL 磷酸
缓冲液 (pH 710) 洗涤后检查花粉萌发率、测量花粉管
的长度和宽度。检查花粉萌发率时 ,每处理至少观察
5 个以上视野 ,统计花粉总数不少于 300 个。花粉管
长度大于花粉粒体高的被视为萌发花粉。花粉管中部
直径作为花粉管宽度 ,每处理至少随机测量 25 个萌发
花粉。吸取经上述固定和洗涤处理后的萌发花粉于载
玻 片 上 , 滴 加 10μgΠml DAPI ( 4′, 62diamidino222
phenylindole ,Sigma 产品) 染色 30min ,用 Leica TCS2SP2
型激光扫描共聚焦显微镜 ( laser scanning confocal
microscope , LSCM)观察花粉与花粉管形态结构。
2 　结果与分析
黑松花粉经氮离子束、紫外线与γ射线处理后花
粉萌发和花粉管生长的结果见表 1。经 t2检验 ( P <
0105) ,氮离子束 (剂量 ≥3 ×1015 ionsΠcm2 ) 、紫外线各处
理与γ射线各处理显著抑制花粉萌发。由图 1、图 2、
图 3 可以看出 ,3 种辐照处理的剂量2花粉萌发率效应
曲线走向不同 ,离子注入的为“马鞍型”,即呈下降、上
升、再下降的趋势 ;γ射线的呈 S 型 ,剂量较低时 ,曲线
直线下降 ,随着剂量的增大 ,又趋于平缓 ,当剂量增大
到一定程度时 ,曲线又直线下降 ;紫外线辐照的呈 L
型 ,在剂量较低时曲线就急剧下降 ,几乎成一条直线 ,
随着剂量的增大曲线又趋于平缓。
如图版所示 (见封三) ,3 种辐照处理对花粉管的
生长和形态亦表现出不同程度的影响。由图版21 可看
出 ,氮离子注入剂量≥3 ×1015 ionsΠcm2 时 ,花粉管生长受
到抑制 ,花粉管显著变短 ,直径显著增大 ,特别是花粉管
顶端明显肿胀 (图版22) 。另外 ,氮离子注入对花粉的细
胞壁损伤较重 ,致使在花粉萌发时花粉外壁破裂 ,花粉
管细胞质“溢出”(图版23 ,24) 。黑松花粉对紫外线照射
较为敏感 ,各处理剂量均显著抑制花粉管生长 ,花粉管
较短 (图版25) ;紫外线处理 6min 以上 ,花粉管较对照组
显著变宽 (图版26) ;但紫外线处理组中均未见花粉管顶
端肿胀的现象。花粉受γ射线照射后 ,剂量≥50Gy 时花
粉管直径显著增大 ,剂量 ≥100Gy 时显著抑制花粉管伸
长 ,但γ射线也诱发花粉管形态异常 ,但未见花粉管顶
端肿胀现象 (图版27 ,28) 。
表 1 　氮离子束、紫外线与γ射线辐照
对黑松花粉萌发和花粉管生长的影响
Table 1 　Effects of ion implantation , UV andγ2rays
irradiation on pollen germination and pollen tube growth
辐照处理
irradiation treatment
花粉管长
pollen tube length
(μm)
花粉管宽
pollen tube width
(μm)
对照 control 154100 ±29. 65 19104 ±3. 48
氮离子束 1 ×1015 134116 ±29. 14 18157 ±2. 61
ion implantation 3 ×1015 62175 ±11. 70 3 24136 ±3. 49 3
(ionsΠcm2) 5 ×1015 71100 ±10. 49 3 22170 ±2. 43 3
7 ×1015 88134 ±13. 6 3 27118 ±2. 99 3
9 ×1015 55121 ±6. 46 3 26106 ±3. 12 3
11 ×1015 — —
γ射线 10 13210 ±10. 35 2018 ±2. 70
γ2rays( Gy) 30 12815 ±6. 96 2115 ±2. 62
50 13518 ±9. 34 2213 ±2. 87 3
100 11312 ±7. 92 3 2218 ±1. 89 3
200 6913 ±3. 98 3 2317 ±2. 49 3
500 5019 ±3. 94 3 2817 ±4. 85 3
紫外线 UV(min) 2 7616 ±4. 28 3 2113 ±2. 31
4 6813 ±5. 56 3 2115 ±2. 08
6 5519 ±4. 34 3 2111 ±1. 69
8 5419 ±3. 57 3 2213 ±2. 36 3
10 5317 ±4. 22 3 2416 ±3. 04 3
15 5019 ±3. 12 3 4111 ±4. 51 3
20 5010 ±3. 55 3 4417 ±5. 47 3
注 : 3 表示与对照组比较有显著差异 ( P < 0105) 。
Note : 3 Means the data are significan difference compared to control ( P < 0105) .
图 1 　离子注入对黑松花粉萌发的影响
Fig. 1 　Effect of ion implantation on pollen
germination of Pinus thunbergii
334　4 期 三种辐照方式对黑松花粉萌发和花粉管生长的影响
图 2 　γ射线对黑松花粉萌发的影响
Fig. 2 　Effects ofγ2rays irradiation on pollen
germination of Pinus thunbergii
图 3 　紫外线辐照对黑松花粉萌发的影响
Fig. 3 　Effects of UV irradiation on pollen
germination of Pinus thunbergii
3 　讨论
从研究结果可以看出 ,低能氮离子注入对黑松花
粉萌发和花粉管生长的影响与γ射线和紫外线照射不
同 ,主要表现在 2 个方面 ,即氮离子束剂量 - 萌发率曲
线呈“马鞍型”和氮离子束注入诱发花粉管顶端肿胀。
一些类似的研究报道也证实氮离子束注入能诱发独特
的生物学效应。吴健等[4 ] 比较了低能离子、紫外线和
γ射线对绛红小单孢菌的剂量存活效应和诱变效果 ,
发现离子注入的存活曲线呈复杂下降、上升、再下降的
趋势 ,而紫外线、γ射线照射绛红小单孢菌的剂量存活
曲线均是指数曲线 ,而且 3 种辐照在诱变效应上也有
很大的差异。杜海彪等[5 ] 用 agarose 电泳和图象处理
技术比较了γ射线、UV 及低能 N +离子处理对 pUC19
DNA 超螺旋结构的损伤效应 ,结果表明离子注入比γ
射线和紫外线对 DNA 超螺旋的损伤更强烈。杜严华
等[6 ] 、张根发等[7 ] 、石小明等[8 ] 的研究也表明 ,N + 注入
的剂量2效应关系呈特有的“马鞍型”,γ射线辐照的剂
量2效应关系呈“直线型”。
目前 ,人们对于离子束注入特有的“马鞍型”剂量
效应曲线还不能科学合理地予以解释[9 ] 。达到共识的
是低能离子束具有一些独特的物理学特性 ,它对生物
体的损伤效应和诱变效应与离子束的物理学特性有
关。离子束具较高的LET 值 ,能量沉积有 Bragg 峰 ,相
对生物学效应 (RBE)高 , 修复效率低 , 氧增比小 ,而且
可精确控制其入射深度和部位。余增亮等[10 ,11 ]提出的
离子束生物效应机制被普遍认可 ,他认为离子束生物
学效应是能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷交换 4
个方面联合作用的结果。
为了说明离子注入的特殊性和更有效地证明离子
注入与一般辐照诱变的机理差异 ,需要从多种角度提
出试验证据 ,而对不同处理方法的比较研究是证明离
子注入和一般辐照诱变机理差异的有效科学方法。同
时 ,要阐明低能离子束的作用特点和机制 ,需要找到一
个良好的试验模式系统。细胞是生物体的结构和功能
单位 ,离子束作用于生物体的有效部位也是细胞。保
留功能的突变细胞继续生长和分裂 ,才会有后续的生
物学效应出现。若以裸露的 DNA 分子作为研究对象 ,
其研究结果不能用于说明细胞内的真实变化。以种子
作为注入对象 ,研究结果也只能在个体水平描述离子
束诱发的生物学效应 ,而不能说明离子束作用的细胞
学机制。细胞学效应是辐照生物学效应中最显著的效
应之一 ,只有在细胞水平研究离子束与细胞的直接相
互作用 ,描述离子束的细胞学效应 ,才能在真正意义上
阐明离子束生物学效应机理。
花粉萌发过程其实是花粉管细胞生长的过程。花
粉受到辐照后 ,可以直接从花粉的萌发和花粉管生长
这 2 个指标上研究辐照的细胞学效应。本研究结果说
明 ,花粉和花粉管可以作为一个模式系统 ,在细胞水平
研究离子束注入和其他辐照对细胞的直接损伤效应机
制。但本研究只涉及表观现象 ,有关离子束与花粉相
互作用的诸多问题还有待进一步探讨。
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(下转第 409 页)
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2008 ,22 (4) :432～434
合适的上样量在双向电泳中也是非常重要的 ,而
蛋白质上样量 , 不仅与 IPG胶条的长度、pH 值范围有
关 ,同时也与蛋白质染色方法有关。本研究采用一种
新的蛋白质染色方法2胶体考马斯亮蓝染色法 ,结合了
传统的考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色法的优点 ,其
检测灵敏度高 ,上样量小 ,同时能很好地与质谱兼容 ,
在选用 17cm、pH 4～7 IPG胶条 ,采用该种蛋白质染色
方法后 ,通过分析比较 ,在蛋白上样量为 800μg 时 ,就
能获得很好的 22DE 图谱效果 ,22DE 胶背景干净。因
蛋白质斑点清晰 ,背景浅 ,故易脱色 ,不需脱色液仅用
去离子水便能获得很好的脱色效果 ,该方法已被广泛
采用[17 ,18 ] 。
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