全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052388204
利用青花菜单倍体茎尖筛选耐热变异体
陆瑞菊　王亦菲　孙月芳　周润梅　黄剑华
(上海市农业科学院生物技术研究所Π上海市农业遗传育种重点实验室 ,上海　201106)
摘 　要 :用平阳霉素对青花菜“上海 4 号”和“东村交配”的单倍体茎尖进行诱变处理 ,以高温作为选择压
力 ,获得一批耐热性明显比原始品种提高的单倍体变异体。经过染色体加倍后 ,通过热胁迫条件下电导
率的测定 ,筛选出 9 份细胞膜热稳定性比原始品种明显提高的变异体材料。
关键词 :青花菜 ;单倍体茎尖 ;平阳霉素 ;热胁迫 ;电导率 ;耐热变异体
SELECTION OF BROCCOLI VARIANTS TOLERANT TO HIGHER TEMPERATURE
USING HAPLOID STEM APEXES in vitro
LU Rui2ju 　WANG Yi2fei 　SUN Yue2fang 　ZHOU Run2mei 　HUANGJian2hua
( Biotech Research Institute , Shanghai Academy of Agricultural SciencesΠ
Shanghai Key Lab of Agricultural Genetics and Breeding , Shanghai ,201106)
Abstract :Using“Shanghai No. 4”and“Dongcun Jiaopei”as donor materials , variants with improved heat tolerance were
obtained through treating haploid stem apexes with pingyangmycin and then culturing survived stem apexes with stress of higher
temperature. After chromosome doubling and electric conductivity measuring , 9 variants with higher stability of cell membrane
to heat stress than the original varieties were selected.
Key words :broccoli ; haploid stem apexes ; pingyangmycin ; heat stress ; electric conductivity ; heat tolerance variants
收稿日期 :2005211202
基金项目 :上海市科委基础研究项目 (02DJ14055)
作者简介 :陆瑞菊 (19622) ,女 ,上海人 ,硕士 ,研究员 ,主要从事作物花药Π小孢子培养研究。黄剑华为通讯作者 ,Tel :021 62201032 ; Email : sw1 @
saas. sh. cn
　　青花菜颜色鲜艳 ,味道清新 ,是一种营养价值很高
的蔬菜 ,因含有抗癌物质而备受世人瞩目。青花菜的
耐热性是影响其品质和产量的关键因子。利用变异手
段创造新种质已获得巨大成功 ,并育成了一大批品
种[1 ] 。细胞水平 ,特别是单倍体细胞水平的诱变易产
生变异。离体培养条件下的筛选 ,更易控制选择压力 ,
提高选择效率[2 ,3 ] 。利用加倍单倍体技术 ,可以迅速获
得变异性状稳定遗传的种质材料。平阳霉素是一种新
型的诱变剂 ,已在多种植物上证明了其诱变效果[4～6 ] 。
青花菜耐高温变异体的离体诱导及筛选尚未见报道。
我们用平阳霉素对青花菜的单倍体茎尖进行诱变处
理 ,以高温热胁迫作为筛选压力 ,获得了耐热性提高的
变异体。
1 　材料和方法
111 　材料
以青花菜“上海 4 号”和“东村交配”游离小孢子培
养获得的单倍体试管苗茎尖作为供试材料。“上海 4
号”的单倍体再生植株离体培养后形成单倍体植株群
体 ,用于变异体诱导及筛选的预备试验。
112 　方法
11211 　将茎尖浸泡于浓度为 40 和 80mgΠL 的平阳霉
素溶液中分别处理 15、30、45min ,用无菌水冲洗 2～3
次 ,接种于空白的 MS 培养基上 ,培养 14d 后统计存活
率 ,以确定适宜的平阳霉素处理浓度及处理时间组合。
平阳霉素诱变后存活的茎尖 ,接种于空白的 MS 培养基
883　 核 农 学 报　2006 ,20 (5) :388～391Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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上 ,置于培养室培养 7～10d 后 ,再置于 35 ℃、40 ℃、45 ℃
高温分别培养 1、2、3h。同时 ,以未作处理的单倍体茎尖
作对照 ,观察原始材料与变异体的耐热差异。7d 后统计
存活率 ,确定适宜的高温筛选的温度及时间组合。
11212 　培养基及培养条件　快繁培养基以 MS 为基本
培养基 ,添加 015mgΠL 62BA、0101mgΠL NAA、蔗糖 30gΠ
L、琼脂粉 515gΠL ,pH518 ,121 ℃高温高压灭菌。除高温
处理外 ,培养温度 25 ℃、光照强度 150μmol. m - 2 1s - 1作
为培养条件。
11213 　染色体加倍 　参照 Mathias R 等[7 ] 的方法进
行。
11214 　电导率的测定　参照罗少波等[8 ] 的方法进行。
每份材料用 3 种类型的苗进行测定 ,常温苗是 25 ℃下
生长的苗 ,胁迫苗为 45 ℃、3h 处理的苗 ,恢复苗为
45 ℃、3h 处理后在 25 ℃、150μmol. m - 2 1s - 1光照培养条
件下生长 5d 的苗。
2 　结果与分析
211 　平阳霉素的浓度及处理时间
表 1 　平阳霉素处理浓度及时间对青花菜
单倍体茎尖存活率的影响
Table 1 　Survival percentage of the haploid stem apexes
after different pingyangmycin concentration and
time treatment
处理时间
treating
time
(min)
平阳霉素浓度 concentration of pingyangmycin (mgΠL)
40 80
接种数
number of
explants
存活数
surviving
explants
存活率
percent of
surviving
explants
( %)
接种数
number of
explants
存活数
surviving
explants
存活率
percent of
surviving
explants( %)
15 50 34 6810 50 23 4610
30 50 20 4010 50 12 2410
45 50 9 1810 50 0 010
单倍体茎尖经平阳霉素处理后 2 - 3d 开始死亡 ,
叶片的枯黄从老叶开始 ,慢慢向新叶扩展。从表 1 可
以看出 ,平阳霉素对青花菜的茎尖损伤较大 ,青花菜茎
尖的存活率随着平阳霉素处理浓度和处理时间的增加
而下降。在平阳霉素浓度为 40mgΠL 时 ,茎尖在处理
15min 后存活率为 6810 % ;处理 30min 后存活率下降为
4010 % ;处理 45min 后存活率只有 1810 %。当平阳霉
素浓度上升为 80mgΠL 时 ,茎尖存活率在处理 15min 后
为 4610 % ;处理 30min 后就只有 2410 % ;处理 45min
后 ,其存活率为 0。由此可见 ,以平阳霉素作为诱变剂
对青花菜单倍体茎尖进行诱变时 , 40mgΠL、30min 和
80mgΠL、15min 是较为适宜的处理。从试验中还观察
到 ,存活下来的茎尖生长迟缓、植株矮小 ,往往需要 1
～2 代的继代培养才能恢复正常生长。
212 　离体筛选的适宜温度及时间
在高温胁迫下茎尖的生长受到抑制 ,未经平阳霉
素处理的对照茎尖在 35 ℃处理时就出现热害症状 ,处
理 3h 后热害症状明显 ,老叶首先呈现开水灼伤状 ,在
热胁迫结束的 1 - 2d 后 ,叶片褪绿黄化 ,植株慢慢枯
死。从表 2 可以看出 ,茎尖存活率随温度的增加、处理
时间的延长而降低 ;将平阳霉素 80mgΠL、15min 处理后
存活的诱变茎尖及对照用不同温度、时间胁迫处理后 ,
诱变茎尖与对照茎尖相比 ,除 35 ℃、1h 处理外 ,在同一
温度及处理时间上 ,诱变茎尖群体的存活率均比对照
高 ;35 ℃、3h 的处理后 , 对照的存活率已下降为
5813 % ,而诱变茎尖的存活率仍为 10010 % ;40 ℃、3h 的
处理后 ,对照的存活率已为 0 ,而诱变茎尖的存活率为
4617 %。从表 2 还可以看出 ,高温胁迫温度达到 45 ℃、
处理 3h 时 ,诱变茎尖还有 1313 %的存活率。确定以
40 ℃、3h 作为适宜的高温筛选处理。推测诱变处理的
单倍体茎尖群体耐热性的提高 ,可能包括 2 个原因 ,一
是部分植株经平阳霉素处理后在基因水平上发生了变
异 ;二是耐热性的提高仅仅是一种生理上的驯化。
213 　耐热变异体的离体诱导及筛选
以青花菜“上海 4 号”和“东村交配”的单倍体茎
尖为材料 ,以平阳霉素 80mgΠL、15min 作为诱变剂处理
茎尖 ,存活的茎尖用 40 ℃、3h 高温筛选 ,结果见表 3。
品系“上海 4 号”165 个、“东村交配”108 个单倍体茎尖
经平阳霉素诱变和高温胁迫筛选后 ,存活的株数为 35
和 27 ,其中的 15 株和 13 株加倍成功 ,快繁后分别有 10
个和 4 个株系用于电导率的测定及植株水平耐热性的
初步鉴定。
214 　耐热变异体与原始品种在热胁迫处理下的相对
电导率
比较了原始材料“上海 4 号”和“东村交配”(对照)
以及经过诱变、热胁迫筛选后获得的扩繁过的加倍单
倍体株系在 25 ℃(常温)培养、45 ℃、3h (热胁迫)培养和
热胁迫后置于 25 ℃、5d (恢复) 培养后的相对电导率及
其升幅。从表 4 可以看出 , (1)常温苗的相对电导率都
较低 ;热胁迫下供试材料的相对电导率迅速上升 ,但除
了来自“东村交配”的 2 个株系 (2202 和 2206) ,诱变株
系的相对电导率均低于对照 ;恢复培养后供试材料的
相对电导率迅速下降 ,除株系 2206 外 ,诱变株系的相
983　5 期 利用青花菜单倍体茎尖筛选耐热变异体
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　　　 表 2 　筛选温度及时间对青花菜茎尖存活率的影响
Table 1 　Effect of treating temperature and treating time on survival percentage of the haploid stem apexes
处理温度
treating
temperature ( ℃)
处理时间
treating
time (h)
材料 material
对照 haploid stem apexes without pingyangmycin treatment 变异体 haploid stem apexes treated with pingyangmycin
接种数
number of explants
存活数
surviving explants
存活率
percentage
of surviving( %)
接种数
number of explants
存活数
surviving explants
存活率
percentage of
surviving( %)
1 60 60 10010 60 60 10010
35 2 60 51 8510 60 60 10010
3 60 35 5813 60 60 10010
1 60 32 5313 60 57 9510
40 2 60 12 2010 60 37 6117
3 60 0 010 60 28 4617
1 60 0 010 60 25 4117
45 2 60 0 010 60 15 2510
3 60 0 010 60 8 1313
表 3 　耐热变异体的离体诱变及筛选
Table 3 　Induction and selection of variants with higher tolerance to heat
材料
materials
诱变处理的茎尖数
No. of stem apexes for
pingyangmycin treatment
高温筛选的茎尖数
No. of stem apexes for
temperature treatment
存活的茎尖数
No. of survival
stem apexes
加倍成功的植株数
No. of chromosome
doubled2plantlets 电导率测定的株系数No. of lines for electricconductivity testing
上海 4 号 Shanghai No. 4 165 76 35 15 10
东村交配 Dongcun Jiaopei 108 53 27 13 4
表 4 　热胁迫对供试材料叶片相对电导率的影响
Table 4 　Effect of heat stress on electric conductivity of leaves
材料
materials
相对电导率 relative conductivity
常温苗
plantlets culturing
at 25 ℃
胁迫苗
plantlets culturing
at 45 ℃for 3h
增幅
increase rate ( %)
恢复苗
plantlets culturing
at 25 ℃for 5d
after heat stress
增幅
increase rate ( %)
上海 4 号
Shanghai No. 4 44143 78154 76177 62197 41174
4 - 02 43107 51171 20106 23152 - 45139
4 - 12 37188 50158 33152 21156 - 43108
4 - 13 38172 71134 84121 42191 10181
4 - 22 49175 73134 47143 33182 - 32101
4 - 33 35163 45166 28115 20103 - 43178
4 - 34 30167 45128 47161 24100 - 21176
4 - 35 45184 65191 43178 30127 - 33197
4 - 41 21121 44100 107143 29184 40168
4 - 42 44191 61153 36199 25171 - 42176
4 - 46 23175 70101 194179 39190 67199
东村交配
Dongcun Jiaopei 31170 58115 83142 45181 44150
2 - 01 25192 46162 79184 21192 - 15144
2 - 02 28120 60176 115143 29120 3152
2 - 05 36160 52177 44120 26158 - 27138
2 - 06 29144 80140 173106 54104 83152
093 核　农　学　报 20 卷
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对电导率都低于对照。(2)与对照相比 ,热胁迫下各诱
变株系的相对电导率增幅有高有低 ,但有几份株系的
增幅明显较低 ,如 4202 为 20106 % ,4233 为 28115 % ,42
12 为 33152 % ,4242 为 36199 % ,远远低于“上海 4 号”
76177 %的增幅。(3) 与对照相比 ,恢复培养后诱变株
系的相对电导率增幅也是有高有低 ,但大部分株系明
显较低 ,增幅为负值。归纳上述结果不难看出 :11 诱
变筛选出的株系在热胁迫下的相对电导率及其增幅均
存在较大的差异 ,结合相对电导率和其增幅 ,更易判断
供试材料热胁迫下的细胞膜稳定性 ; 21 经恢复培养
后 ,除了来自东村交配的 1 个株系 (2 - 06) 外 ,各株系
的相对电导率都比对照低 ,表明诱变筛选出的株系在细
胞膜透性上的恢复功能较好 ;31 经恢复培养后 ,除 5 个
株系外 ,诱变株系的相对电导率增幅出现负值 ,表明经
高温胁迫后 ,供试材料的细胞膜透性虽然有所上升 ,但
经恢复培养后 ,细胞膜透性大幅度下降 ,甚至比常温下
培养的更低 ,表明其细胞膜稳定性明显提高 ;41 供试材
料热胁迫下的相对电导率增幅与经过恢复培养后相对
电导率的升幅大致吻合 ;51 经诱变筛选出的少数株系 (4
- 46、2 - 06) ,其相对电导率及其增幅比对照更高 ,似乎
表明这些株系的耐热性在无性繁殖过程中被减弱了 ;或
者当初耐热性的提高仅仅是一种生理上的驯化。
215 　植株水平耐热性的初步评估
45 ℃、3h 的热胁迫处理对植株造成很大的伤害 ,
各株系间在形态上表现出很大的差异。热胁迫 5 - 7d
后 ,供试材料中 ,“上海 4 号”和株系 4241、4246、2206 植
株全部死亡 ;“东村交配”和株系 4213、2202 老叶全部枯
萎 ,只剩部分新叶还活着 ;株系 4202、4233、4212、4242 长
势较好 ,大部分植株保持正常形态。
结合供试材料在热胁迫下的表现 ,可以看出热胁
迫后相对电导率升幅小和恢复培养后相对电导率降幅
大的株系在热胁迫下的伤害反应较小 ,表明供试材料
叶片在热胁迫下的相对电导率升幅或恢复培养后相对
电导率的降幅 ,大致可以反映其植株水平的耐热性。
单倍体茎尖经过诱变、热胁迫筛选获得的耐热性 ,经过
染色体加倍可以保持。DH 植株经扩繁后 (无性繁
殖) ,大部分植株的耐热性可以遗传给后代。
216 　单倍体细胞诱变及耐热性筛选技术程序
3 　讨论
通过植物细胞变异体离体筛选已成功地筛选出耐
盐水稻[9 ] 和番茄[10 ] 、抗除草剂大豆[11 ] 、抗菌核病
油菜[12 ,13 ] 等一系列变异体 ,在改良作物抗逆性上发挥
大田种植的青花菜
小孢子培养
再生植株
染色体倍性鉴定
单倍体植株茎尖
平阳霉素 80mgΠL、15min 处理
存活茎尖
40 ℃、3h
存活茎尖
常温培养
小植株
染色体加倍
加倍单倍体植株
快繁
DH株系
相对电导率测定
耐热新种质
了重要的作用。利用离体筛选技术创造耐热变异体的
研究也有报道 ,黄剑华等[14 ] 利用两步法高温筛选 ,获
得了可通过无性繁殖传递的不结球白菜耐热变异体 ,
陈静娴等[15 ]通过耐热性定向选择获得了乌菜耐热再
生植株 ,何晓明等[16 ]获得了菜心耐热变异体。与传统
的耐热性选择方法相比 ,离体筛选方法具有不受季节
和气候条件的限制、变异范围广、可供选择的群体大等
特点 ,可显著提高选择效率。许多研究表明 ,高温首先
破坏细胞膜结构 ,导致细胞内溶物外渗 ,细胞膜的热稳
定性即高温胁迫下细胞的电导率直接反映植物的耐热
程度[17 ] 。我们认为以胁迫苗或恢复苗电导率的增幅
来判断变异体的耐热性较为合理。本研究建立了利用
青花菜单倍体茎尖经平阳霉素诱变、以高温作为选择
压 ,结合细胞膜透性测定 ,筛选耐热材料的新技术路
线。从本研究获得的加倍单倍体植株中 ,筛选到能耐
50 ℃高温 1 - 2h ,细胞膜的热稳定性要好于原始品种
的变异体。这些耐热变异体诱导生根后 ,有很高的田
间成活率 ,并且长势良好。鉴于本研究建立的技术路
线具有单倍体细胞遗传上的易变性和染色体加倍后变
异性状的遗传稳定性两大优势 ,相信通过进一步的选
育工作将能育成青花菜耐热新品种。
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