全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 012010205
玉米未成熟胚胚性愈伤组织诱导率与
内源激素含量的关系
付凤玲　冯质雷　渠柏艳　李晚忱
(作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室Π四川农业大学玉米研究所 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :以胚性愈伤组织诱导率高低不同的 9 个玉米自交系未成熟胚为外植体 ,用改良 N6 培养基诱导培
养愈伤组织。酶联免疫法测定不同培养时间后未成熟胚 ,以及由此诱导的胚性和非胚性愈伤组织 ,内源
脱落酸 (ABA) 、吲哚乙酸 ( IAA) 、赤霉素 ( GA3 、GA4 ) 和细胞分裂素 (DHZR、IPA、ZR) 含量。结果发现 ,胚性
愈伤组织诱导率与未成熟胚 ABA 和 IAA 含量正相关 ,与胚性和非胚性愈伤组织 ABA 含量正相关 ,与胚
性愈伤组织 GA3 含量负相关。在胚性愈伤组织开始发生之际 ,外植体的ABA 和 IAA 含量出现峰值 ,GA3
含量出现低谷。因此认为 ,未成熟胚高水平的 ABA、IAA 含量和低水平的 GA3 含量 ,有利于胚性愈伤组
织的诱导。但是胚性愈伤组织的 ABA 含量却低于非胚性愈伤组织 ,且胚性愈伤组织诱导率与胚性愈伤
组织 IAA 含量负相关。由此看来 ,胚性愈伤组织的诱导和保持 ,可能还与各种激素的协同作用有关。
关键词 :玉米 ;未成熟胚 ;胚性愈伤组织 ;诱导率 ;内源激素
收稿日期 :2005203213
基金项目 :教育部长江学者和创新团队发展计划 ( IRT0453) ,国家自然科学基金项目 (30070476)
作者简介 :付凤玲 (19622) ,女 ,陕西蒲城人 ,教授 ,主要从事玉米遗传育种和生物技术研究与教学。Email :ffl @sicau. edu. cn。李晚忱为通讯作者 ,
Email : aumdyms @sicau. edu. cn
RELATIONSHIPS BETWEEN INDUCTION RATE OF EMBRYONIC CALLUS AND
ENDOGENOUS HORMONES CONTENT IN MAIZE
FU Feng2ling 　FENG Zhi2lei 　QU Bai2yan 　LI Wan2chen
( Key Laboratory of Crop Genetic Resources and ImprovementΠMinistry of Education , Maize Research Institute ,
Sichaun Agricultural University , Ya’an , Sichaun 　625014)
Abstract :Immature embryos of 9 maize inbred lines with different induction rate of embryonic callus were used as explants and
calli were induced and cultured on improved N6 medium. The methods of enzyme2linked immunosorbant assay were employed
to detect endogenous contents of abscisic acid (ABA) , indoleacetic acid ( IAA) , gibberellins ( GA3 , GA4 ) and cytokinins
(DHZR , IPA , ZR) of immature embryos , embryonic and non2embryonic calli during culture process. Positive correlation was
found between induction rate of embryonic calli and content of ABA and IAA in immature embryos , between induction rate of
embryonic calli and ABA content in embryonic and non2embryonic. Negative correlation was found between induction rate of
embryonic calli and GA3 content of embryonic calli . A peak value of ABA and IAA content and a low value of GA3 content in
explant were detected at the beginning of embryonic calli generation. It was thought that proper high level of ABA and IAA
content and low content of GA3 were benefit to induction of embryonic calli from immature embryos. It was found , however ,
that ABA content of embryonic calli was lower than non2embryonic calli , and induction rate of embryonic calli was correlated
negatively with IAA content of embryonic calli . By this token , induction and subculture of embryonic calli should be related
with cooperative effects among different hormones.
Key words :maize ;immature embryo ;embryonic callus ;induction rate ;endogenous hormone
01　 核 农 学 报　2006 ,20 (1) :10～14Journal of Nuclear Agricultural Sciences
　　建立遗传性稳定、转化效率高、易于再生的受体系
统 ,是转基因研究的关键技术之一。迄今为止 ,建立玉
米转基因受体系统最为有效的方法是用未成熟胚诱导
培养胚性愈伤组织。与水稻、小麦等禾本科作物相比 ,
玉米胚性愈伤组织的诱导、继代和分化再生更为困难 ,
严重依赖于“A188”、“B73”等少数几个自交系及其衍
生系。然而 ,这些自交系的综合农艺性状不能满足生
产需要 ,建立受体系统进行转基因研究 ,获得的转基因
植株经过较长时间的回交转育 ,才能育成实用品种。
而现行推广杂交种的优良亲本自交系 ,胚性愈伤组织
的诱导率又不高 ,难以为转基因研究提供足够的受
体[1～6 ] 。
根据水稻、小麦、大豆等作物的研究 ,不同基因型
间未成熟胚胚性愈伤组织诱导率的差异 ,与外植体内
源激素含量以及不同激素之间的含量配比有关[7～11 ] 。
张东向等发现 ,自玉米植株基部向上 ,叶片的胚性愈伤
组织诱导能力显著降低。气相色谱分析表明 ,叶片内
源脱落酸 (ABA)和吲哚乙酸 ( IAA)的含量 ,也是自基部
向上逐渐降低的 ,特别以 ABA 的差异更为明显。而
且 ,在胚性愈伤组织发生时 ,外植体内还伴随有高水平
ABA 和 IAA 峰值出现[12 ] 。但是 ,现在玉米胚性愈伤组
织的诱导主要以未成熟胚作外植体 ,有关这一过程中
内源激素含量变化及其与诱导率的关系 ,仅见 Vain 等
关于乙烯的报道。他们认为 ,玉米胚性愈伤组织诱导
率低 ,与其内源乙烯含量高有关。在培养基中添加乙
烯合成抑制剂可提高诱导率 ,而添加乙烯合成前体则
有降低诱导率的趋势[13 ] 。本研究拟测定胚性愈伤组
织诱导率不同的自交系未成熟胚 ,以及由此诱导产生
的胚性与非胚性愈伤组织的主要内源激素 ,通过比较
其含量的差异 ,分析其与胚性愈伤组织诱导率的关系 ,
为提高未成熟胚胚性愈伤组织诱导率提供参考。
1 　材料和方法
111 　材料
试验材料为 182599W、C501、182599R、R09、综 31、
先早 17、S37、A318 和 R15 共 9 个玉米自交系 ,这些自
交系的胚性愈伤组织诱导率有差异。
112 　愈伤组织的诱导与培养
在上述 9 个玉米自交系授粉后 13d 左右 ,取长 115
～215mm 的未成熟胚接种于改良 N6 培养基[6 ] 。每个
自交系接种 14 支试管 ,每试管 10 个未成熟胚。27 ℃
暗培养并及时切去幼芽及根状体。形成愈伤组织后 ,
按 Armstrong 介绍的标准[1 ] ,鉴别愈伤组织的胚性并统
计胚性愈伤的诱导率 ,将胚性与非胚性愈伤分别转入
N6 继代培养基 ,14 ℃暗培养 ,每 21d 转接继代 1 次。
113 　取样与激素提取
本试验所有样品在激素测定前均在 - 70 ℃保存。
各自交系所测样品有未成熟胚 10 个 ;诱导培养基上分
别培养 3、6、9、12、15、18、21d 时取 10 个未成熟胚 (1 支
试管) ;第 3 次继代培养的未成熟胚上发生的胚性和非
胚性愈伤组织。测量时各样品精确称量 110000g ,用内
含 1mmolΠL 二叔丁基对甲苯酚的 80 %甲醇提取液
2ml ,冰浴下将样品磨成匀浆 ,转入离心管中 ,再用 2ml
提取液分次冲洗研钵 ,一并转入离心管中 ,4 ℃下提取
4h ,离心取上清 ,沉淀用 1 ml 提取液再提取一次 ,合并
上清液。把含有内源激素的上清液过 C18 固相萃取柱
纯化样品。过柱后的样品真空冷冻干燥 ,除去甲醇 ,用
含 Tween220 的磷酸盐缓冲液溶解样品 (一般 1g 鲜重样
品加 115ml 缓冲液溶解) 。
114 　内源激素的酶联免疫测定
用张军介绍的方法 [14 ] ,在 10mL Na2 CO32NaHCO3
(pH916)包被缓冲液中加入一定量的包被抗原 ,混匀
后加入酶标板小孔 ,37 ℃包被 3h。包被好的酶标板用
磷酸缓冲液洗板 3 次 ,甩干。分别加入脱落酸 (ABA) 、
吲哚乙酸 ( IAA) 、赤霉素 ( GA3 和 GA4 ) 和双氢玉米素核
苷 (DHZR) 、异戊烯基核苷 ( IPA) 、玉米素核苷 ( ZR) 3 种
细胞分裂素标准物 ,再加入待测样和抗体 ,37 ℃竞争反
应 30min。洗板后加酶标羊抗兔抗体 ,37 ℃反应 30min。
洗板 5 次后加底物显色 ,显色适当时加入 2molΠL 硫酸
终止反应。吹干酶标板底后 ,在 EL ×800UV 型酶标仪
上检测。每处理重复 4 次。
2 　结果与分析
211 　不同自交系的胚性愈伤组织诱导率
授粉 13d 的玉米幼胚接种两周左右 ,外植体上陆
续长出愈伤组织。不同自交系的胚性愈伤组织诱导率
差异明显 ,方差分析达极显著水平 ( F = 361333 ) (表 1) 。
其中 ,182599W、C501 和 182599R 的胚性愈伤组织诱导
率较高 ,都在 50 %以上 ;R09、先早 17 和综 31 居中 ,诱
导率在 30 %至 40 %之间 ;S37、A318 和 R15 基本上不能
诱导出胚性愈伤组织。这些自交系胚性愈伤组织诱导
率分级在其它研究中也得到了验证[15 ] 。
11　1 期 玉米未成熟胚胚性愈伤组织诱导率与内源激素含量的关系
表 1 　不同自交系的胚性愈伤组织诱导率
Table 1 　Induction rate of embryonic callus among different inbred lines
自交系
inbred lines
接种未成熟胚数
No. of inoculated
immature embryo
发生胚性愈伤组织的胚数
No. of embryo that embryonic
callus induced
胚性愈伤组织诱导率
induction rate of embryonic
callus( %)
182599W 560 381 6810
C501 560 336 6012
182599R 560 314 5615
R09 420 168 4013
综 31 Zong31 280 90 3211
先早 17 Xianzao17 280 84 3013
S37 460 2 014
A318 560 0 010
R15 560 0 010
212 　未成熟胚内源激素含量与胚性愈伤组织诱导率
的关系
表 2 给出了不同自交系胚性愈伤诱导率和未成熟
胚中几种激素含量。经过对诱导率和几种内源激素的
线性相关分析表明 ,胚愈诱导率与胚中 ABA 和 IAA 含
量具有极显著相关性 (相关系数分别为 0195233 和 0193033 ) ,这说明 ,未成熟胚中适当高的 ABA 和 IAA 含量 ,有利于胚性愈伤组织的形成和诱导率的提高。而赤霉素和细胞分裂素含量变化规律无常 ,与胚愈诱导率相关不显著 ,这可能意味着未成熟胚中赤霉素和细胞分裂素含量对胚性愈伤诱导率没有明显影响。
表 2 　不同自交系未成熟胚中内源激素含量
Table 2 　Endogenous hormone activity of immature embryos among different inbred lines (ngΠg)
自交系
inbred lines
诱导率
induction rate of
embryonic callus( %)
脱落酸
ABA
吲哚乙酸
IAA
赤霉素 gibberellin 细胞分裂素 cytokinin
GA3 GA4 DHZR IPA ZR
182599W 6810 4210 4017 9411 2017 3411 8612 4010
C501 6012 3710 2616 2310 1117 13217 3517 5314
182599R 5615 3416 2511 9915 5716 4613 4211 3417
R09 4013 2114 1819 5611 3219 8710 4514 6217
综 31 Zong31 3211 1516 1811 3412 3016 7511 3515 6311
先早 17 Xianzao17 3013 1414 1712 7210 6712 9117 4711 7017
S37 014 718 519 2416 2311 7019 2917 6315
A318 010 712 717 2914 2111 6510 3513 5114
R15 010 715 618 2710 2212 6811 3215 5713
213 　愈伤组织激素含量与胚性愈伤组织诱导率的关
系
为了解胚性愈伤和非胚性愈伤在内源激素含量上
的差异及其与诱导率的关系 ,对第 3 次继代的胚性和
非胚性愈伤分别进行取样和激素含量测定 ,结果见图
1。胚性愈伤和非胚性愈伤组织中 ABA 的含量随着自
交系胚性愈伤诱导率的提高而提高 ,二者趋势相同。
而 IAA 与 ABA 含量表现不同 ,在胚性愈伤组织中的含
量随诱导率的升高而降低 ,非胚性愈伤中表现无规律
性。GA3 含量随自交系诱导率提高而降低 ,且非胚性
愈伤中 GA3 含量远高于胚性愈伤。愈伤组织中细胞
分裂素和 GA4 含量与诱导率相关不显著。以上结果
说明 ,愈伤组织中 ABA 含量较高 , GA3 含量较低对胚
性愈伤组织诱导率的提高是有利的 ,就愈伤组织的胚
性而言 ,胚性愈伤较非胚怀愈伤含有较高的 IAA 和较
低的 GA3 ,而 ABA 含量差异不甚明显。这意味着适当
高水平的 IAA 含量和低水平的 GA3 含量 ,对胚性愈伤
组织诱导和胚性愈伤的继代保持是有利的。
214 　幼胚培养过程中内源激素含量的变化
3 个高诱导率自交系 182599W、C501、182599R 的未
成熟胚在培养过程中 ,内源 ABA、IAA 和 GA3 含量的变
化趋势如图 2 所示。内源 ABA 含量 ,从外植体接种的
第 9 天开始升高 ,两周左右达到峰值。IAA 从第 12 天
开始升高 ,第 15 天达到峰值。而 GA3 含量在第 15 天
时降到最低。未成熟胚在接种培养第 15 天左右 ,正是
胚性愈伤组织开始发生的时期。由此推测 ,外植体较
高含量的 ABA 和 IAA 以及低含量的 GA3 ,有利于胚性
愈伤组织的发生。
21 核　农　学　报 20 卷
图 1 　激素含量与胚性愈伤组织诱导率的关系
Fig. 1 　Relationship between hormone contents and induction rate of embryonic calli
EC表示胚性愈伤 ,NEC表示非胚性愈伤
EC means embryonic calli and NEC means non2embryonic calli
图 2 　培养过程中内源激素含量的变化
Fig. 2 　Change of endogenous hormone contents during culture process
31　1 期 玉米未成熟胚胚性愈伤组织诱导率与内源激素含量的关系
3 　讨论
311 　胚性愈伤组织诱导和保持对激素含量的要求
本研究发现 ,胚性愈伤组织诱导率与未成熟胚
ABA和 IAA 含量正相关 ,与愈伤组织 ABA 含量正相
关 ,与胚性愈伤组织 IAA 和 GA3 含量负相关 ,这与张
东向等用玉米叶片作外植体的研究结论相似[12 ] 。但
是 ,胚性愈伤组织的 ABA 含量却低于非胚性愈伤组
织 ,而且胚性愈伤诱导率与胚性愈伤组织 IAA 含量负
相关。可能是胚性愈伤组织发生前后所需的 ABA 和
IAA 含量不同所致。胚性愈伤组织的发生 ,需要高水
平 ABA 和 IAA 含量的诱导 ,但愈伤组织胚性的保持则
不再需要高水平的 ABA 和 IAA 含量 ,本研究测定的内
源激素含量在培养过程中的变化趋势也支持这一分
析。本试验室曾给愈伤组织诱导培养基添加植物生长
调节剂唏效唑 ,结果提高了胚性愈伤组织的诱导率 ,而
唏效唑是 GA3 的拮抗剂 ,这也间接证明高水平的 GA3
含量不利于胚性愈伤组织的诱导和保持。
312 　外源激素添加调节内源激素含量的可能性
研究未成熟胚胚性愈伤组织诱导率与内源激素的
关系 ,目的在于改进培养基配方 ,添加适当的外源激
素 ,调节外植体内源激素含量 ,使其有利于胚性愈伤组
织的发生和保持。张智奇[16 ] 、李雪梅和刘熔山[7 ] 、张
东向等[12 ] 、付凤玲等[6 ]都曾有添加 2 ,42D 提高水稻、小
麦、玉米胚性愈伤组织诱导率的报道 ,但有关内源激素
的定量研究较少。本研究虽然做了一些探索 ,但由于
不同基因型间的差异 ,以及各种激素相互之间协同作
用的复杂性 ,要提出外源激素添加调节内源激素含量
的具体方案 ,还需要进一步深入研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　Armstrong C L , Green C E. Establishment and maintenance of friable ,
embryogenic maize callus and the involvement of L2proline. Planta ,
1985 ,164 :207～214
[ 2 ] 　Duncan D R , Williams M E , Zehr B R , et al . The production of callus
capable of plant regeneration from immature embryos of numerous Zea
mays genotypes. Planta , 1985 , 165 :322～332
[ 3 ] 　Kamo K K, Hodges T K. Establishment and characterization of long2term
embryogenic maize callus and cell suspension cultures. Plant Science ,
1986 , 45 :111～117
[ 4 ] 　Hodges T K, Kamo K K, Imbrie C W , et al . Genotypes specificity of
somatic embryogenesis and regeneration in maize. Biological Technology ,
1986 ,4 :219～223
[ 5 ] 　杨　会 ,王国英 ,戴景瑞. 玉米优良自交系综 3、综 31 的转化研
究. 农业生物技术学报 ,2001 ,9 (4) :334～337
[ 6 ] 　付凤玲 ,李晚忱 ,荣廷昭 ,潘光堂. 提高 N6 培养基钙浓度对玉米
幼胚培养的影响. 西北农林科技大学学报 ,2003 ,31 (1) :81～84
[ 7 ] 　李雪梅 ,刘熔山. 小麦幼穗胚性愈伤组织诱导及分化过程中内源
激素的作用. 植物生理学通讯 ,1994 ,30 (4) :255～260
[ 8 ] 　郭子彪 ,盖钧镒. 内源激素 IAA ,ABA 对大豆萌发子叶胚性愈伤
组织诱导及其分化的调控. 大豆科学 ,1997 ,16 (3) ,194～198
[ 9 ] 　叶兴国 ,王连铮. 大豆花药愈伤组织的分化及其内源激素分析.
作物学报 ,1991 ,23 (5) :555～561
[10 ] 　罗琼 ,胡延玉 ,周开达. 内源激素对水稻成熟胚培养力的影响. 中
国水稻科学 ,1998 ,12 (4) :238～240
[11 ] 　陈以峰 ,周 　燮 ,汤日圣. 水稻体细胞培养中胚性细胞出现与
IAA 的关系. 植物学报 ,1998 ,40 (5) : 474～477
[12 ] 　张东向 ,张崇浩 ,李杰芬. 玉米叶片胚性愈伤组织诱导及其与内
源 IAA 和 ABA 关系的初步研究. 作物学报 ,2000 ,26 (2) :195～
199
[13 ] 　Vain P , Flament P , Soundain P. Role of ethylene in embryogenic callus
initiation and regeneration in Zea mays L. J Plant Physiol , 1989 , 135 :
537
[14 ] 　张　军. 植物激素酶联免疫测定试剂盒的使用. 大学科技 ,1992 ,
(2) :20～22
[15 ] 　母贵琴 ,潘光堂 ,刘玉珍 ,夏燕莉. 玉米基因型与幼胚培养胚性愈
伤组织发生能力的初步研究. 四川农业大学学报 ,2003 ,21 (1) :13
～17
[16 ] 　张智奇. 蔗糖浓度、激素配比及不同培养方式对水稻胚性愈伤组
织的诱导效应. 上海农业学报 ,1991 ,7 (3) :19～22
41 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (1) :10～14