全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 052470204
杨树 ISSR 反应体系的建立及正交设计优化
汪结明　项　艳　吴大强　孙志娟　蔡　诚
(安徽农业大学林学与园林学院 ,安徽 合肥　230036)
摘 　要 :采用正交设计的方法 ,对杨树 ISSR2PCR 反应中 5 个因素 ( Taq 酶、Mg2 + 、模板 DNA、dNTP 和引物)
在 4 个水平上进行优化试验。建立了适合杨树的既稳定又能扩出最多数量谱带的 ISSR2PCR 最佳反应
体系 ,即 25μl 的反应体系中含有 1 ×buffer ,0112mmol/ L dNTP ,014μmolΠL 引物 ,315 mmol/ L Mg2 + ,115U Taq
DNA 聚合酶和 40ng 模板 DNA。对杨树 ISSR2PCR 最佳反应体系的退火温度进行梯度试验 ,发现引物
W95142 的最适退火温度为 5611 ℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的 ISSR2PCR 反应体系的建
立为今后利用 ISSR 技术进行杨树种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。
关键词 :杨树 ; ISSR ;正交设计 ;反应体系 ;优化
ESTABLISHMENT OF AN ISSR REACTION SYSTEM FOR POPLAR AND
OPTIMIZATION USING ORTHOGONAL DESIGN
WANGJie2ming 　XIANG Yan 　WU Da2qiang 　SUN Zhi2juan 　CAI Cheng
( College of Forest and Garden , Anhui Agricultural University , Hefei , Anhui 　230036)
Abstract :Orthogonal design was applied for optimizing five factors ( Taq DNA polymerase ,Mg2 + ,DNA template , dNTP ,and
primer) in the ISSR2PCR amplification system on poplar respectively. As a result ,a satisfactory ISSR reaction system for poplar
with desirable repeatability and polymorphic bands was established. In a total volume of 25μl ISSR2PCR system ,it contained 1
×buffer ,0112mmolΠL dNTP ,014μmolΠL primer ,315 mmolΠL Mg2 + ,115U Taq DNA polymerase and 40ng template DNA. The
optimal annealing temperature of every prime for ISSR2PCR reaction was proposed by gradient PCR. It was found that different
primers had different annealing temperature. As far as concerned with primer W95142 , the optimal annealing temperature was
5611 ℃. This optimized ISSR reaction system would provide the basis for the analysis of diversity ,map construction and gene
localization of important traits of poplar with ISSR markers.
Key words :poplar ; ISSR ;orthogonal design ;reaction system ;optimization
收稿日期 :2006211227
基金资助 :安徽省科技厅自然基金 (03041109)
作者简介 :汪结明 (19772) ,男 ,安徽望江人 ,在读博士研究生 ,主要从事园林植物、作物遗传育种及生物技术方面的研究。Tel :055125786464 ; E2
mail :wjmmjw2000 @stu. ahau. edu. cn
通讯作者 :项艳 (19652) ,女 ,安徽桐城人 ,教授 ,博士 ,主要从事植物遗传育种与生物技术方面的研究。Tel :0551 - 5786522 ; E2mail :xiangyan @ahau.
edu. cn
　　杨树 ( Populus spp . ) 是人工造林和工业用材等方
面的重要树种 ,品种资源尤为丰富。利用分子标记进
行杨树资源鉴定和分类、构建分子遗传图谱和基因定
位已取得一定进展 ,但多为 RAPD、AFLP 和 SSR 标记的
利用 ,尚未见 ISSR 标记在杨树上应用的研究报道。
ISSR( Inter Simple Sequence Repeat , ISSR) 是以重复序列
的单 一 引 物 为 主 要 引 物 序 列 的 PCR 标 记 , 是
Zietkiewicz[1 ]等于 1994 年创建的 ,该技术由于具有多态
性水平高 ,可重复性好 ,DNA 用量少 ,成本低等优点 ,
近年来在品种鉴定、种质资源和遗传多样性研究中得
到了广泛的应用 ,并成为构建遗传图谱的工具。虽然
有诸多优点 ,但 ISSR 技术是基于 PCR 的一种分子标记
074　 核 农 学 报　2007 ,21 (5) :470～473Journal of Nuclear Agricultural Sciences
技术 ,其扩增结果易受 Mg2 + 、dNTPs、引物、Taq DNA 聚
合酶、模板 DNA 等因子的影响。因此建立一个适合于
杨树的 ISSR2PCR 反应体系 , 提高 ISSR 分析结果的可
靠性和重复性 ,将为杨树品种的分子鉴定和遗传关系
的分析等研究奠定重要的试验基础。
图 1 　PCR 产物电泳结果
Fig. 1 　Result of PCR products electrophoresis
M为标准分子量 DL2000。处理编号同表 1
M:DL2000 marker. The meaning of treatment No. s are same as in Table 1
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　试验材料及地点　以 2006 年 4 月份从安徽省
林业厅林业高科技中心采摘的南林 95 杨 ( Populus ×
euramericans. cv)的叶片为试验材料 ;同年 4 - 10 月在
安徽农业大学林学与园林学院生物技术实验室进行提
取杨树基因组和 ISSR 分子标记[1 ]试验。
11112 　设备和仪器 　高速冷冻离心机 (LCJ264201 ,日
立 SCR20BA) , PCR 扩增仪 ( Hema 4800) ,紫外分光光
度计 (Beckman UV2754) ,凝胶自动成像系统 ( Kodark) ,
电泳仪和电泳槽。高压灭菌锅 ,超净工作台 ,恒温水浴
锅 ,手提式紫外检测仪 ,连续可调微量移液器以及其他
分子生物学常用设备。
11113 　试剂 　十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) ,引物
(46μgΠ OD , 稀释为 10μmolΠL 备用 ) Taq 酶 ( 5UΠμl ) 、
dNTPs(10mmolΠL each) 、MgCl2 (25mmolΠL)等购自上海生
工生物工程公司。DL2000 (50ngΠμl ) 、λ2 Hind Ⅲ digest
(50ngΠμl) 、Agarose Regular 等购自宝生物工程 (大连) 有
限公司 ,其他试剂均为国产分析纯产品。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　优化的杨树基因组 DNA 提纯方法及其检测　
利用优化的适合杨树的 CTAB 法提纯杨树基因组
DNA[2 ] ,用 017 %琼脂糖凝胶电泳定性检测是否有主带
和其有无降解 ,分光光度法定量测定浓度及纯度 ,并将
其稀释至 20ngΠμl 备用。
11212 　PCR 正交试验设计与分析 　为摸索出影响
ISSR2PCR 反应的 5 个主要因素 ( Tag 酶 ,Mg2 + ,模板
DNA ,dNTP ,引物) 的最佳组合 ,选用正交设计 L16 (45 )
正交表 (表 1) ,共有 l6 个处理 ,表 1 中编号即为正交表
中 16 个处理的编号 ,按表中各处理的数据加样 ,每处
理设 2 个重复 ,共 32 管。在 PCR 扩增仪上进行扩增 ,
反应体系为 25μl ,除表中所列因素外 ,每管还有 1 ×
PCR Buffer。反应程序为 :94 ℃预变性 5min ,94 ℃变性
45s ,退火 1min (温度因引物而异) ,35 个循环 72 ℃延伸
1150min ,72 ℃终延伸 10min , 4 ℃保存。PCR 产物用
210 %琼脂糖凝胶 (含 EB 015μgΠm1)于 3VΠcm 电压下电
泳 ,电泳结果用凝胶自动成像系统 ( Kodark) 拍照 ,记录
结果 ,用统计软件 DPS 进行分析。得到杨树 ISSR2PCR
反应各因素的最佳水平。
表 1 　PCR 扩增体系各成分因素一水平正交设计表(L1645 )
Table 1 　1SSR2PCR orthogonal desig (L16 45 )
编号
No.
Taq 酶
(UΠ25μl) Mg2 +(mmolΠL) 模板 DNA(ngΠ25μl) dNTP(mmolΠL) 引物(μmol/ L)
1 015 115 40 0104 0108
2 015 215 60 0108 0124
3 015 315 80 0112 0140
4 015 415 100 0116 0156
5 110 115 60 0112 0156
6 110 215 40 0116 0140
7 110 315 100 0104 0124
8 110 415 80 0108 0108
9 115 115 80 0116 0124
10 115 215 100 0112 0108
11 115 315 40 0108 0156
12 115 415 60 0104 0140
13 210 115 100 0108 0140
14 210 215 80 0104 0156
15 210 315 60 0116 0108
16 210 415 40 0112 0124
11213 　退火温度梯度试验 　根据多次利用不同引物
进行 PCR 扩增的初步试验经验 ,利用所得最佳因素水
平组合的扩增体系 ,采用退火温度梯度试验 ,逐一确定
每个引物的退火温度。为摸索引物 AW95142 ( 5’
AGAGAGAGAGAGAGAGC3’) 的最适退火温度 ,在 PCR
扩增仪上将退火温度设置为 12 个梯度 , 最小为
4810 ℃,最大为 6010 ℃,PCR 产物进行电泳检测。
174　5 期 杨树 ISSR 反应体系的建立及正交设计优化
2 　结果与分析
211 　正交设计试验结果的直观分析评分
21111 　电泳结果评分　按表 1 设计的 16 个处理进行
PCR 反应后 ,将得到的产物进行电泳 ,参照何正文等[3 ]
的正交设计直观分析方法 ,图 1 为 16 个处理的第 1 个
重复 PCR 产物电泳结果 ,依扩增出的谱带特异性与敏
感性即谱带多少、亮度的强弱和杂带的有无评分 ,谱带
越多、亮度越强、又无杂带则评分越高。最好的处理定
为 16 分 ,最差的处理定为 1 分 ,以这两个处理的结果
为比较标准 ,再将其他处理的谱带结果与这两个标准
比较依次评分 ,依照这一评分标准图 1 中各处理的记
分结果依次为 :3、515、12、2、6、6、1015、1、9、11、16、615、
8、7、1115、4 ;重复的电泳结果与第 1 个电泳结果有较
强的一致性 ,其记分依次为 4、5、11、1、515、5、12、3、10、
10、16、6、815、715、1015、4。
21112 　各因素对 PCR 反应影响的差异分析 　将上述
处理和评分结果用统计软件 DPS 进行方差分析 ,结果
见表 2 ,由 F 值可知 ,Taq 酶、Mg2 + 的量对反应结果影响
较大 ,均达到了极显著 ;引物 ,dNTP 的影响也达到了显
著水平 ;模板 DNA 浓度的影响最小 ,其各水平之间影
响都不显著。再利用 Tukey 法对达到显著水平的 4 个
因素进一步进行因素内多重比较分析。
21113 　因素内各水平对 PCR 结果的影响
2111311 　Taq 酶浓度的影响 　对 Taq 酶用量进行因素
内多重比较 ,结果表明 ,25μl 反应体系中 , Taq 酶不同
的反应梯度只有 015U 与 110U 之间差异不显著 ,P 值
为 012394 ,其余梯度之间差异均达到了极显著。从图
2 反应结果均值与酶量的关系图中也可以看出 ,酶量
在 015U 至 115U 之间时 ,均值随酶量的增加而增加 ,在
115U 时 ,达到最高。继续增加酶量 ,均值下降 ,故选择
115UΠ25μl 作为杨树 ISSR2PCR 反应体系中酶的最佳浓
度。
2111312 　Mg2 + 浓度的影响 　Mg2 + 的均值极差分析结
果为 910 ,是 5 个影响因子中极差值最大的 ,说明 Mg2 +
浓度是影响 ISSR2PCR 的最重要因素。对 Mg2 + 进行因
素内多重比较 ,结果表明 ,25μl 反应体系中 ,Mg2 + 的反
应梯度只有 115 mmolΠL 和 215 mmolΠL 之间对结果的影
响不显著 ,而其他各梯度之间差异都极显著。图 3 也
显示 ,Mg2 + 浓度在 115 mmolΠL 至 315mmolΠL 之间时 ,结
果均值随着 Mg2 + 浓度的增加而递增 ,在 315mmolΠL 时
达到最高。故在 25μl 反应体系中选择 315mmolΠL 作为
杨树 ISSR2PCR 反应中 Mg2 + 的最佳浓度。
2111313 　dNTP 浓度的影响 　dNTP 是 ISSR 反应的“原
料”,其过低或过高都会影响扩增结果的准确性[4 ] 。通
过因素内多重比较可以看出只有梯度 0112 和
0116mmolΠL 之间差异显著 ,P 值达到了 010359 ,而其他
各梯度之间差异不显著。图 4 也表明 dNTP 浓度在 0104
至 0112mmolΠL 之间反应结果均值随着 dNTP 浓度的增
加而递增 ,在 0112mmolΠL 时最大 ,当继续增大浓度时 ,结
果均值递减 ,因此在 25μl 反应体系中选择 0112mmolΠL
作为杨树 ISSR2PCR 反应中 dNTP 的最佳浓度。
表 2 　方差分析表
Table 2 　The variance analysis
source SS DF MS F P
Taq 12411875 3 41139583 91135632 0100000
Mg2 + 33215625 3 11018542 24416437 0100000
Template DNA 310625 3 1102083 2125287 0112153
dNTP 711875 3 2139583 5128736 0101003
Primer 51625 3 11875 4113793 0102382
Error 7125 16 0145313
Total 4791875 31
图 2 　Taq 酶量与结果均值关系图
Fig. 2 　Relationship between quantity of
Taq DNA polymerase and the mean of result
图 3 　Mg2 + 浓度与结果均值关系图
Fig. 3 　Relationship between concentration
of Mg2 + and the mean of result
274 核　农　学　报 21 卷
2111314 　引物浓度的影响 　ISSR 扩增条带数与引物
浓度密切相关 ,浓度过低可能会无扩增带 ;而浓度过高
则会出现非特异性扩增 ,产生模糊小片断和引物二聚
体[5 ] 。本试验的 4 个梯度通过因素内多重比较发现 ,
只有 0108 与 0124μmol/ L 两个梯度之间差异达到显著
水平 ,而其他各梯度之间差异不显著。由图 5 可以看
出 ,在引物浓度为 014μmol/ L 时 ,反应结果均值达最高
71875 ,故 25μl 反应体系中选择 014μmol/ L 作为杨树
ISSR2PCR 反应中引物的最佳浓度。
2111315 　模板 DNA 浓度的影响 　表 2 的方差分析结
果显示 ,模板 DNA 浓度在本试验所选的梯度范围内对
PCR结果的影响没有显著变化 ,这与姜静等研究结
　　　　
图 4 　dNTP浓度与结果均值关系图
Fig. 4 　Relationship between dNTP concentration
and the mean of result
果[4 ]相似。因此本试验模板 DNA 量在 40～100ng 范围
内均可 ,但从节约基因组的角度考虑 ,在 25μl 的杨树
ISSR2PCR 反应体系中 ,采用 40ng 作为模板 DNA 的浓
度。
图 5 　引物浓度与结果均埴关系图
Fig. 5 　Relationship between primer concentration
and the mean of result
2. 2 　最适退火温度的确定
退火温度的高低直接影响到引物与模板 DNA 的特
异性结合 ,是 ISSR2PCR 能否扩增出理想谱带最为关键
的因素之一[6 ] 。采用不同的退火温度进行 PCR 扩增 ,扩
增产物进行电泳检测 ,结果 (图 6)表明 ,退火温度过低时
扩增特异性差 ,背景深 ;退火温度过高时引物与模板结
合差 ,PCR 产物丰度低 ,电泳条带亮度弱 ,通过试验最终
确立引物 W95142 最适退火温度为 5611 ℃。
图 6 　PCR 梯度退火电泳结果
Fig. 6 　The effect of annealing temperature on ISSR amplification
1～12 :依次为 6010 ℃、5917 ℃、5819 ℃、5716 ℃、5611 ℃、
5417 ℃、5313 ℃、5118 ℃、5014 ℃、4911 ℃、4813 ℃、4810 ℃; M:标准分子量 DL2000
Lane l～12 corresponding to 6010 ℃,5917 ℃,5819 ℃,5716 ℃,5611 ℃,5417 ℃,
5313 ℃,5118 ℃,5014 ℃,4911 ℃,4813 ℃,4810 ℃,respectively ;M:Marker DL2000
3 　结论与讨论
有关 PCR 反应体系优化的报道很多 ,但大多是采
用简单的梯度试验方法对每个因素的最佳水平进行摸
索 ,需要进行多次梯度试验 ,过程繁琐 ,且不能兼顾到各
因素间的交互作用 ,对试验结果的判断缺少量化 ,缺乏
一定的标准[7 ] 。就遗传多态性分析而言 ,其结果具有一
定的不稳定性[8 ] ,这可能与 PCR 反应的不稳定相关。
本研究以南林 95 杨的 DNA 为模板 ,采用正交设
计的方法 ,对杨树 ISSR2PCR 反应中 5 个因素 ( Taq 酶 ,
Mg2 + ,模板 DNA ,dNTP 和引物) 在 4 个水平上进行优
化试验 ,结合图表分析了试验中各因素间及因素内水
　　　　　 (下转第 513 页)
374Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (5) :470～473
kgDM组中的血浆 Cl - 高于 200mEqΠkg DM 组。Tucker
等[11 ]研究认为 0 与 2 %碳酸氢钠日粮间血浆 Cl - 没有
差异。Jackson 和 Hemken 研究表明[5 ] ,血液中 Cl - 随日
粮 Ca2 + 增加而线性降低 ,血液中磷含量不随 DCAB 改
变而变化 ,但随日粮 Ca2 + 增加而增加。Beighle 等报
道[15 ] ,饲喂阴离子日粮降低了血清磷浓度。
在本试验中 ,泌乳奶牛日粮中添加 DCAB ,各处理
组尿液 pH值与对照组相比有了明显提高 , 说明试验
中的 DCAB 有利于动物生产。在不同的 DCAB 研究
中 ,血和尿液里钙磷间存在差异 ,钾、钠、氯等也存在差
异。研究者用盐配制不同 DCAB 的日粮 , 即使相同的
DCAB ,可能是通过不同的盐调配出来的 ,当然其中的
钾、钠、氯等就会不同。Wildman 等[12 ] 研究表明 , 血浆
尿素和钾浓度随日粮 K∶Na 比例增加而提高 ;尿中钾
随 K∶Na 增加而线性增加 ,而 Na 线性降低 ;DCAB 和 K
∶Na 比例对尿中钾具有互作效应。
在本研究 DCAB (87～500mEqΠkg DM) 范围内 ,综
合各项分析指标 ,DCAB 400mEqΠkg DM 是泌乳期奶牛
适合添加的量。
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(上接第 473 页)
平间的相关性 ,建立了重复性好、分辨率高的 ISSR2
PCR 反应体系。即 25μl 的反应体系中含有 1 ×buffer ,
0112mmol/ L dNTP ,014μmolΠL 引物 ,315 mmol/ L Mg2 + ,
115U Taq DNA 聚合酶和 40ng 模板 DNA。就反应程序
而言 ,变性、退火、延伸的时间和温度对反应结果有一
定的影响 ,特别是退火温度的影响更大。故本研究对
杨树 ISSR2PCR 最佳反应体系的退火温度进行梯度试
验 ,发现引物 W95142 的最适退火温度为 5611 ℃,且最
适退火温度因引物而异 ,这是 ISSR 分子标记区别于其
他分子标记的重要因子。这一优化的杨树 ISSR2PCR
反应体系为进一步利用 ISSR 分子标记技术对杨树的
资源鉴定、分类和分子遗传图谱的构建及基因定位奠
定了良好的试验基础。
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