全 文 ：收稿日期 :2008209222 　接受日期 :2009201215
基金项目 :“十一五”国家科技支撑项目 (2006BAD01A6010) ,国家自然科学基金项目 (30640036) ,国家林业局项目 (200424)
作者简介 :姜金仲 (19582) ,男 ,河南上蔡人 ,高级讲师 ,研究方向为林木育种及生物技术。E2mail :jjz9911 @1631com
通讯作者 :李云 (19632) ,男 ,河北蔚县人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向为林木育种及生物技术。Tel :010262336094 ; E2mail :yunli63 @1631com
文章编号 :100028551 (2009) 032405208
刺槐同源四倍体种子胚变异及生活力分析
姜金仲1 　贺佳玉1 　李　云1 　楼　莎1 　严艳华2
(11 林木花卉遗传育种教育部重点实验室 ,北京林业大学生物科学与技术学院 ,北京　100083 ;
21 秦皇岛市海港园林局 ,河北 秦皇岛　066000)
摘 　要 :为了阐明刺槐同源四倍体种子胚变异状况及充分利用刺槐同源四倍体有性过程创造的变异资源
对四倍体刺槐进行遗传改良 ,研究了刺槐同源四倍体种子胚类型及其生活力特征 ,主要结论如下 :刺槐
同源四倍体种子胚按照子叶数量、颜色及饱满程度 ,可以划分出 5 个类型 : 黄二 ( YVT) 、黄三 ( YMT) 、黄
四 ( YRF) 、绿二 ( GNT)及白二 (WNT) ,所有类型种子胚混合平均单胚重量接近二倍体的 1Π2。流式细胞
仪检测证明 ,YVT、YMT、YRF 类型样本种子胚染色体数目仍然是四倍体。刺槐同源四倍体种子胚可溶
性蛋白含量、过氧化物酶活性明显低于二倍体相应指标 ,且 YVT、YMT、YRF 类型种子胚明显高于 GNT、
WNT类型。以刺槐同源四倍体种子胚愈伤组织诱导率作为种子胚生活力强弱的评定指标表明 :上述 2
种指标越高的种子胚 ,其生活力就越高 ,上述 2 种指标均小于二倍体相应指标的 30 %是刺槐同源四倍
体种子胚生活力丧失的临界指标 ;而 YVT、YMT、YRF 类型种子胚均高于二倍体相应指标的 30 % ,组织
培养时均有一定的愈伤组织诱导率 ,具一定的生活力 ,其中 YVT类种子胚的愈伤组织诱导率最高 (平均
5718 %) 、生活力最强 ,已培育出此 3 类胚的实生苗 ; GNT、WNT类型种子胚上述 2 种指标均低于二倍体
相应指标的 30 % ,组织培养时愈伤组织诱导率为 0 ,胚细胞均失去了生命力。较好的种子胚愈伤组织诱
导培养基综合条件为 : MS 基本培养基附加 2 ,42D 210mgΠL 和 62BA 015mgΠL。
关键词 :刺槐 ;同源四倍体 ;种子胚变异 ;流式细胞仪 ; 胚培养
VARIATION AND VITALITY OF SEED EMBRYOS FROM TETRAPLOID Robinia pseudoacacia
J IANGJin2zhong1 　HE Jia2yu1 　LI Yun1 　LOU Sha1 　YAN Yan2hua2
(11 Key Laboratory for Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants , Ministry of Education , College of
Biological Sciences and Biotechnology , Beijing Forestry University , Beijing 　100083 ;
21 Harbor Bureau of parks and woods , Qinhuangdao , Hebei , Qinhuangdao 　066000)
Abstract :In order to explain clearly the variation status of embryo from tetraploid Robinia pseudoacacia (TRP) and fully use
the variation resource initiated in the sexual reproduction of TRP in the further improvement of TRP , The classification and
vitalities of seed embryos from tetraploid Robinia pseudoacacia (TRP) were studied. According to the cotyledon number , color
and plumpness , the seed embryos of TRP could be divided into 5 types : YVT (yellow , very replete ,2 cotyledons) , YMT(
yellow , more replete ,3 cotyledons ) , YRF ( yellow , replete ,4 cotyledons ) , GNT ( green , no2replete , 2 cotyledons ) and
WNT ( white , no2replete , 2 cotyledons ) . The average individual embryo weight of 5 types was close to half of seed embryo
weight of diploid Robinia pseudoacacia (DRP) . The results of flow cytometry(FCM) show that YVT , YMT and YRF sampled
embryos were still tetraploid. The content of soluble protein (SP) and activity of peroxidase (AFP) of TPR seed embryos were
remarkably lower than DRP seed embryos but higher than GNT and WNT type seed embryos. By the evaluation index of seed
embryo vitality based on the rate of callus induction of TPR embryos , the higher the SP and AFP of seed embryo were the
504　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :405～412Journal of Nuclear Agricultural Sciences
higher their vitality. While both SP and AFP of TRP seed embryos were lower than 30 %of corresponding index of DRP seed
embryos , the seed embryos of TRP would lose their vitality and therefore’lower than 30 % was critical index for seed embryo of
TRP to keep living. For both SP and AFP of YVT , YMT and YRF embryo were higher than 30 %of corresponding index of
DRP seed embryos , callus was induced from all of them when they were cultured on medium ; and thereby they were living.
Among them the callus2induce2rate of YVT seed embryo was the highest (average :5718 %) , as a result , its vitality was the
most vigorous. And so far seedlings from the three types of seed embryo had been raised. In contrast , for both SP and AFP of
DNT and WNT embryo were lower than 30 %of corresponding index of DRP seed embryos , no callus was induced from all of
them ; and this means that their cell vitality had been lost overall . The better callus2induce medium for seed embryos was MS
complemented with 2 ,42D 210mgΠL and 62BA 015mgΠL.
Key words : Robinia pseudoacacia ; autotetraploid ; seed embryo variation ; flow cytometry ; embryo culture
　　刺槐同源四倍体 (4X) 是由二倍体 (2X) 刺槐
( Robinia pseudoacacia)体细胞人工诱导加倍而育成的[1 ] ,
是特别适用于饲料栽培的刺槐优良无性系[2 ] 。近些年
来 ,关于刺槐同源四倍体的研究主要集中在其推广栽培
及枝叶的加工利用上 ,而关于其种子胚变异的研究相对
较少。研究刺槐同源四倍体种子胚的变异对于利用其
实生苗进行遗传改良及阐明植物同源四倍体种子胚变
异规律具有重要意义。由同源四倍体遗传理论可知 ,植
物同源四倍体有 4 套同源染色体组 ,减数分裂中期同源
染色体不能稳定有序地分离 ,进而形成大量变异雌雄配
子。Tel2zur N 等[3 ] 在葡萄同源四倍体减数分裂过程中
观察到同源染色体配对成多价体及落后染色体等现象 ;
姜金仲等[4 ] 、代西梅等[5 ]分别在刺槐同源四倍体和水稻
中观察到大量畸形雄配子 ,Ramsey J [6 ] 在蓍草同源四倍
体中观察到了大量的未减数雄配子 ;郭海滨等[7 ] 、代西
梅等[8 ] 、张华华等[9 ]在水稻雌配子形成过程中也观察到
了大量异常现象。这些变异的雌雄配子结合理应形成
各种变异的种子胚 ,但实际上是否形成了变异种子胚及
种子胚命运如何很少有报道。
以种子胚为材料研究木本植物同源四倍体生殖过
程中产生的变异资源较以其实生苗为材料有所不同。
以实生苗为材料时 ,变异严重的种子胚在萌发过程中
会大量死去 ,从而失去一部分有价值的变异资源。而
以种子胚作为材料时 ,可以利用现代生物技术 (如组织
培养等)对发生严重变异的种子胚进行挽救 ,从而较大
程度地保留植物同源四倍体生殖过程中创造的变异资
源 ,为遗传育种提供丰富物质基础的同时也可为建立
植物同源多倍体性状遗传理论积累资料。本文对刺槐
同源四倍体的种子进行了解剖分析 ,根据种子胚的形
态划分出了若干种子胚类型 ,探讨了不同类型种子胚
之间生活力方面的差异 ,以阐明刺槐同源四倍体种子
胚变异状况 ,进而为利用四倍体刺槐种子胚变异对四
倍体刺槐进行遗传改良奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料
试验材料采自北京林业大学 6 年生饲料型刺槐同
源四倍体试验林 ,于 2005 年冬季种子充分成熟后将豆
荚采回 ,手工将种子从豆荚中分离出 ,干燥贮藏备用 ,
于 2006 年春季实施了本研究全过程。
112 　方法
11211 　种子胚可溶性蛋白、过氧化物酶活性及生活力
测定
1121111 　可溶性蛋白测定[10 ] 　从每类型胚 (胚类型的
详细情况见 211)中分别随机抽取 5 个作为该类型胚的
待测样本 ,分别从每个样本胚上切取少许子叶 ,并尽可
能地使每个胚贡献相近重量的子叶 ,5 个胚的子叶重
量累计达到 0105g ;将得到的 0105g 胚样本放入 2ml
pH710 磷酸缓冲液研磨成匀浆 ,再加入巯基乙醇 6ml
浸提 20min , 6000rΠmin 离心 10min ,取上清液于波长
260nm、280nm 处分别读取吸光度。用样品提取液作为
空白对照。蛋白质含量 (μgΠg) = (1145A280 - 0174A260 )
×nΠm ,式中 A280 、A260为蛋白分别在 280nm、260nm 处的
吸光度 ,n 为稀释倍数 ,m 为样品重。
1121112 　过氧化物酶活性测定[11 ] 　样本胚取样方法
同上 ,各类样本胚吸胀 3d 后 ,称取种胚 0105g ,加入预
冷的磷酸缓冲液 ( PBS ,011molΠL ,含 1 %PVP ,pH710) ,
冰浴条件下充分研磨 , 过滤液离心 ( 10000rΠmin ,
20min) ,上清液作为 POD 活性测定的粗提液 ,置于冰
浴中保存备用。反应体系含 219ml PBS ( 011molΠL ,
pH710) ,110ml 愈创木酚 (25mmolΠL) ,110ml 2 %H2O2 及
011ml 酶液 ,混合液在 37 ℃水浴中保湿 5min ,加入
011ml Put (10mmolΠL)启动反应 ,并用 UV 紫外分光光度
仪连续测定波长 470nm 处光密度值的变化。
POD 活性 (UΠg) = (ΔOD470Πmin)Π(W ×0101) ,式中
604 核　农　学　报 23 卷
ΔOD470Πmin 为 1min 内波长 470nm 处光密度值的变化 ,
W为鲜重。
1121113 　生活力测定[12 ] 　将种子放入 90 ℃水中 (室
温自然冷却) 浸泡 3d ,使种子充分吸胀后去皮得到种
胚 ,样本胚取样方法同上。称取各类样本胚各 0105g
装入干燥试管 ,然后加入 014 %TTC 溶液 10ml ,封口 ,
于恒温箱 (30 ℃～35 ℃)中保温 60min。染色结束后 ,倒
出 TTC残液 ,用清水冲洗 2～3 次 ,用吸水纸吸干种胚
表面水分 ,加入少量石英砂于干燥研钵中研磨。加少
量乙酸乙酯进行多次提取 ,至胚变成白色为止。用
25ml 容量瓶定容 ,在 520nm 波长下测光密度值。根据
标准曲线及回归方程 (TPF = - 01009 + 01017 ×光密度
值) ,计算生成的 TPF 量作为种胚的生活力指标。
11212 　胚染色体倍性鉴定　将种子放入 90 ℃水中 (室
温自然冷却) 浸泡 3d ,使种子充分吸胀后去皮得到种
胚 ,每类型胚随机挑选 5 个作为待测样本。从每类型
胚的 5 个待测样本胚子叶上裁取组织少许、充分混合
后作为该类型胚染色体倍性分析的组织样本 ;然后 ,组
织样本放入 015ml 的 Partec HR2A 溶液中 ,用剃须刀片
切碎 , 放置 2 ～ 5min , 将样品通过 30μm 的 Partec
CelltricsTM 微孔膜 ,过滤到测试管中 ,加 2ml Partec HR2
B 于样品中 ,将样品上样于 Partec 倍性 (德国 Yartec 公
司)分析仪 ,测定样品单个细胞核的 DNA 总量 , 每一
类型胚测定 10000 个细胞[13 ] 。DNA 含量的分布曲线
由倍性分析仪自动测定。
11213 　种子胚细胞生命力组织培养测定方法　将种
子经 70 %酒精灭菌 30s、升汞灭菌 10min 后 ,在无菌条
件下剥出胚 ,将其分类后分离 ,垂直于胚轴切割后接种
于含不同浓度 2 ,42D 和 62BA 的愈伤组织诱导培养基
上 (表 1) ,以 MS 培养基添加 NAA015mgΠL、3 %蔗糖、
016 %琼脂 ,pH 518 为基本培养基 ,每类培养基接种 6
皿 ,5 粒Π皿。20d 后调查愈伤组织诱导率 ,以筛选适宜
的植物生长调节剂种类及浓度。
表 1 　诱导培养基的植物生长调节剂种类及浓度
Table 1 　Plant growth regulators and the concentration
added in 6 inducement medium (mgΠL)
植物生长调节剂
plant growth regulators
1 2 3 4 5 6
2 ,42D 2 4 6 2 4 6
62BA 0. 1 0. 1 0. 1 0. 5 0. 5 0. 5
愈伤组织诱导率 ( %) = (诱导出的愈伤组织数Π接
种外植体的总数) ×100 %。
愈伤组织质量观测设 4 个评价指标 :褐化率、质
地、颜色及生长速度 ,每个指标按优劣分为 5 个级
别[14 ,15 ] ,以每重复为 1 个观测和质量分数计算单位。
11214 　数据处理 　所有数据的统计分析处理均由
SPSS1210 软件完成。
2 　结果与分析
211 　刺槐同源四倍体种子胚类型及其形态特征
从采集的种子中随机抽取种子 50 粒 ,在自来水中
浸泡至完全吸胀 ,在解剖镜下去皮解剖 ,观察种胚的颜
色、饱满程度和子叶瓣数 ;根据这 3 个指标 ,刺槐同源
四倍体种子胚可以划分出 5 种类型 : YVT、YMT、YRF、
GNT和 WNT(图 1、表 2) 。除以上 5 类型种子胚外 ,还
有大量子叶形状极不规则及形态特征难以描述的畸形
胚 (图 12F) 。
图 1 　不同类型种子胚形态特征
Fig. 1 Morphology of embryo types
种胚形态描述见表 2 ;F :畸形胚
the morphological description of seed embryo is listed in the table 2 ;abnormal embryo
704　3 期 刺槐同源四倍体种子胚变异及生活力分析
表 2 　种子胚类型的形态特征
Table 2 　The morphology of seed embryo types
种子胚类型 seed embryo type 种胚形态描述 morphological description of seed embryo
黄二 ( YVT)
黄三 ( YMT)
黄四 ( YRF)
绿二 ( GNT)
白二 (WNT)
黄色 ,很饱满 ,子叶 2 片 yellow ,very replete ,2 cotyledons
黄色 ,较饱满 ,子叶 3 片 yellow ,more replete ,3 cotyledons
黄色 ,较饱满 ,子叶 4 片 yellow ,very replete ,4 cotyledons
绿色 ,不饱满 ,子叶 2 (或 3、4)片 green , no2replete , 2 (or 3 ,or 4) cotyledons
白色 ,不饱满 ,子叶 2 片 white , no2replete , 2 cotyledons
　　各种类型胚的形态特征见表 2。种子胚按颜色分
为 3 类 :黄、绿、白 ;按子叶数量分为 3 类 :2 片、3 片、4
片 ;按饱满程度分为 3 类 :很饱满、较饱满、不饱满。
212 　种子胚的重量及解剖特征
各种类型种子胚的单胚平均重量见表 3。从表 3
可以看出 ,刺槐同源四倍体的种子胚平均单胚重量仅
相当于二倍体刺槐的 1Π2 ,各类型种子胚平均单胚重量
的顺序为 :2X > YMT = YRF > YVT > WNT > 4X (总平
均) > GNT;其中黄色多瓣的种子胚较重 ,白色与绿色
的种子胚较轻 ,而且胚轴干瘪萎蔫 ,石蜡切片表现为中
空 (见图 2) ,而其他较正常的种子胚胚轴则为实心 ,这
种中空的胚轴可能会影响到胚根和子叶之间的水分和
养分运输 ,从而影响该类种子胚的萌发能力。
表 3 　各类型种子胚平均单胚重量
Table 3 　Average weight per seed embryo
种子胚类型
embryo types
种子胚均重
embryo average weight (g)
2X种子胚 (对照) 2X embryo (CK) 01021
4X种子胚 (平均) 4X embryo (average) 01010
YVT 01015
YMT 01016
YRF 01016
GNT 01007
WNT 01011
213 　不同类型种子胚的染色体倍性特征
由于刺槐同源四倍体减数分裂的不稳定性 (植物
　　
图 2 　实心胚轴 (A)和空心胚轴 (B)
Fig. 2 　Solid radicel (A) and hollow radicel (B)
同源多倍体共有的遗传特性) ,其种子胚的染色体倍性
理论上应该有所差异 ,因此 ,有必要对这些种子胚的染
色体倍性加以鉴定。
将种子胚进行流式细胞仪 DNA 含量检测与分析 ,
采用 1DA0n
-
DSF 模式判定细胞的染色体倍性 ,结果如
图 3 所示。图中只有 2X、YVT、YMT 、YRF 的分布图 ,
剩余的 2 类种子胚因未能分离出可供鉴定利用的单体
细胞 ,所以无法进行流式细胞仪 DNA 含量检测。
由图 3 可知 ,尽管 YVT、YMT 及 YRF 类型种子胚
在表现型上具有明显的差异 (见图 1) ,但它们样本的
细胞 DNA 含量通道值 (DNA 含量分布峰值所在位置在
图 3 　用流式细胞仪测定的单细胞 DNA 含量
Fig. 3 　The DNA content of single cell measured by flow cytometry
804 核　农　学　报 23 卷
横轴上的截距)相互接近 ,且均接近二倍体刺槐通道值
的 2 倍 ; YVT、YMT及 YRF 通道值相互接近 ,说明它们
的倍性是相近的 ,接近二倍体刺槐的 2 倍说明它们的
大多数细胞 DNA 含量接近二倍体刺槐的 2 倍。因此 ,
从细胞 DNA 含量可以初步判断刺槐同源四倍体 YVT、
YMT 及 YRF 类型样本种子胚的倍性仍然接近四
倍体。　　
214 　不同类型种子胚的生理生化及生活力特征
为了比较不同类型种子胚生命活动特征及生活力
方面的差异 ,对不同类型种子胚的可溶性蛋白含量、过
氧化物酶的活性及生活力指标进行了测定 ,并将测定
结果同二倍体刺槐种子胚相应指标加以比较 ,结果如
图 4 所示。
由图 4 可知 ,二倍体刺槐种子胚和刺槐同源四倍
图 4 　各类型胚生理生化及生活力指标测定 (以二倍体刺槐的相应指标为 100 %绘出)
Fig. 4 　Physiological , biochemical index and vitality of embryo types(drawn
with the corresponding index of diploid treated as 100 %)
体种子胚的 2 种生理生化指标及生活力指标从 2X 到
GNT呈下降趋势 ,当过氧化物酶和可溶性蛋白含量 2
种指标均低于二倍体相应指标的 30 %时 ,四倍体种子
胚的生活力明显下降 ,进一步的组织培养试验说明 ,
WNT及 GNT类型胚均不具愈伤组织诱导能力 ,所以 ,2
种指标均低于二倍体相应指标的 30 %是刺槐同源四
倍体种子胚细胞生命力丧失的临界指标。
215 　不同类型种子胚细胞生命力的组织培养测定
在无菌条件下 ,将刺槐同源四倍体不同类型种子
胚接种到含不同浓度 2 ,42D 和 62BA 的愈伤组织诱导
培养基上 ,形成了黄绿色、结构疏松的愈伤组织 (图
5) ,诱导率和愈伤组织质量统计结果见表 4 和表 5。
表 4 　不同种子胚类型、不同浓度植物生长调节剂组合培养基的愈伤组织诱导率( %)及差异显著性
Table 4 　Callus inducing rates ( %) and the variation among them for seed types and plant growth regulators sorts
种子胚类型
embryo types
培养基组合编号
No. of medium
6 3 1 2 4 5
组平均差异显著性
group mean variations
　YVT 34. 1 30. 0 71. 1 76. 2 65. 4 70. 0 57. 8 ±8. 28 a
　YMT 33. 3 35. 7 51. 7 59. 0 66. 7 75. 5 53. 6 ±6. 87ab
　YRF 28. 0 39. 1 40. 0 53. 8 60. 0 63. 3 47. 4 ±5. 63b
　2X 33. 1 46. 7 75. 8 63. 5 86. 5 62. 3 61. 31 ±7. 87c
平均数 mean 32. 1 ±1. 4 37. 9 ±3. 5 59. 7 ±8. 4 63. 1 ±4. 8 69. 7 ±5. 8 67. 8 ±3. 1
差异显著性
variation
significance
a a b bc bc bc
注 :培养基添加植物生长调节剂浓度组合同表 1 ;方差分析时进行了平方根转换 ,显著性指标 : P < 0105 ; GNT、WNT两类胚的数据均为 0 ,故没有加入
分析。表 5 同。
Note :The plant growth regulators added in medium were the same as in table 1 ; the data in table were square2roottransformed before variance analysis , significance
indicator : P < 0105 ; the data for GNT and WNT embryos were zero and not analyzed. the same as in the table 5.
904　3 期 刺槐同源四倍体种子胚变异及生活力分析
图 5 　YVT种子胚的愈伤组织
Fig. 5 　The callus of YVT seed embryo
左 :接种 10d 后 ;中 :接种 15d 后 ;右 :接种 26d 后
left :10d after inoculation ; middle :15d after inoculation ; right :26d after inoculation
　　由表 4 可知 , YVT、YMT、YRF 型种子胚的愈伤组
织诱导率有显著性差异 , 其中以 YVT 最高 (平均
5718 %) ,显著高于 YRF ;3 种类型种子胚的最适培养
基不同 ,YVT 为 2 号 , YMT 和 YRF 为 5 号。不同植物
生长调节剂浓度组合之间 :2、4、5 号组合的愈伤组织
诱导率明显高于 6、3、1 号 ,但前三者之间没有显著性
差异 ,其中以 4 号最高 ,平均为 6917 %。YMT 与 YRF
产生愈伤组织速度较快 ,后期继代过程中相对于 YVT
产生的愈伤组织褐化程度较轻。GNT、WNT 型种子胚
没有诱导出愈伤组织。
由表 5 可以看出 , YVT、YMT、YRF 种子胚的愈伤
组织质量评分比较接近 ,无显著性差异 ,其中以 YVT
型种子胚最高 (平均 314) ;不同植物生长调节剂浓度 组合之间愈伤组织质量评分差异较大 ,1 号和 4 号组合的质量分数明显高于其他组合号 ,其中以 4 号组合质量分数最高 (平均 412) ,但 1 号和 4 号组合间无显著性差异。综合分析愈伤组织诱导率和质量分数的结果可以看出 :在划分的 5 类种子胚中 ,以 YVT 型细胞生命力最强 ,YMT和 YRF 的细胞生命力接近 ,剩下 2 类种子胚的细胞均无生命力。有生命力的种子胚类型间的愈伤组织诱导率及最适培养基有所差异 ,这种现象从一个方面说明了刺槐同源四倍体种子胚间遗传基础有着明显的不同。综合愈伤组织诱导率和愈伤组织质量分数的分析结果 ,种子胚培养较好的培养基为 4 号 ,即MS 基本培养基附加 210mgΠL 2 ,42D 和 015mgΠL 62BA。
表 5 　不同胚类型、不同植物生长调节剂浓度组合培养基中的愈伤组织质量评分
Table 5 　The callus quality grade for embryo types and plant growth regulators concentrations
胚类型
embryo types
培养基编号 No. of medium
3 6 2 5 1 4
平均
mean
　YVT 215 311 314 317 319 410 314 ±0156
　YMT 218 217 218 310 319 412 312 ±0165
　YRF 214 310 218 314 317 411 312 ±0162
平均 mean 216 ±0112 219 ±0112 310 ±012 314 ±012 318 ±0107 411 ±0106
差异显著性
variation
significance
a a a a b b
216 　种子胚综合性状聚类分析
将各类种子胚的颜色、饱满程度、子叶数、生理生
化指标及愈伤组织诱导率等性状观测值利用 DPS2000
进行 Q 型系统聚类分析 ,结果表明 (图 6) :这些种子胚
类型可聚为三大类 ,即不育类 (WNT、GNT) 、类二倍体
类 ( YMT、YVT)和 4 子叶类 ( YRF) 。从遗传改良的角度
考虑 ,不育类种子胚利用价值较小。
经过一系列的种子促萌技术措施研究[16 ] ,已利用
52氮杂胞苷浸种结合容器育苗成功培育出后两类胚的
实生苗 (图 7) ,但未得到 WNT和 GNT型胚的苗木。
3 　小结与讨论
311 　按照子叶数量、颜色及饱满程度 ,刺槐同源四倍
体种子胚可以划分为 5 种类型 : YVT、YMT、YRF 、
GNT、WNT;相对于二倍体刺槐 , YVT 是表型相对正常
014 核　农　学　报 23 卷
图 6 　种子胚聚类分析结果
Fig. 6 　Cluster analysis of seed embryo
图 7 　HS、BM、HD 型胚实生苗
Fig. 7 　The seedlings from HS ,BM ,HD types of embryo
的种子胚 ,其他类型的表型则发生了明显变异 ;刺槐同
源四倍体种子胚的平均重量接近于二倍体刺槐的 1Π2 ;
四倍体种子胚与二倍体种子胚以及四倍体不同类型种
子胚之间在可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性及种子
胚的活力方面存在明显差异 :四倍体明显低于二倍体
刺槐 ,YVT、YMT、YRF 类型种子胚明显高于 GNT、WNT
类型种子胚 ;生理生化指标均低于二倍体刺槐相应指
标的 30 %时 ,四倍体种子胚的生活力明显下降 ; YVT、
YMT、YRF 类型样本种子胚的倍性仍然接近四倍体。
一般认为 ,多倍体的器官较二倍体具有明显的巨
大性[17 ,18 ] ;但从刺槐同源四倍体种子胚与二倍体种子
胚重量的比较可以看出 ,四倍体种子胚不仅没有表现
出巨大性 ,反而比二倍体小许多 ,相比其他植物同源四
倍体 ,刺槐同源四倍体表现出了特异性。例如 :四倍体
板蓝根种子千粒重比二倍体的大[19 ] ;鲁梅克斯四倍体
种子千粒重为 41276g ,二倍体为 21978g[20] ;四倍体薄皮
甜瓜种子千粒重 6514g ,二倍体种子千粒重 5218g[21] ;四
倍体荞麦的千粒重比二倍体荞麦增重 50 %左右[22] 。这
种特异性产生的原因值得进一步研究。
从理论上讲 ,植物同源四倍体实生后代中会出现
多种染色体倍性个体 ,但本试验中仅发现了刺槐同源
四倍体的四倍体种子胚 ,其原因可能是其他倍性种子
胚在发育为成熟胚之前就已败育。进一步的种子萌发
试验表明 ,这些经检测认定的四倍体种子胚大部分也
不能萌发 ,由此可以看出 ,并不是所有染色体同源加倍
后的四倍体均具有生命力。
312 　YVT、YMT、YRF 类型种子胚的愈伤组织诱导率之
间存在显著性差异 ( P < 0105) ,其中以 YVT最高 (平均
5718 %) ,显著高于 YRF ,但它们的愈伤组织质量分数
比较接近 (无显著性差异) ;4 号培养基的愈伤组织诱
导率最高 ( 6917 %) , 愈伤组织质量分数也最高
(411 %) ;所以 ,较好的刺槐同源四倍体种子胚愈伤组
织诱导培养基综合条件应为 : MS 基本培养基附加
210mgΠL 2 ,42D 和 015mgΠL 62BA ; GNT、WNT 类型种子
胚均未诱导出愈伤组织 ; YVT、YMT、YRF 种子胚的最
适宜培养基综合条件不相同。
313 　用刺槐同源四倍体种子胚的愈伤组织诱导率作
为种子胚细胞生命力的一个衡量标准 ,与用种子胚可
溶性蛋白含量、过氧化物酶活性指标进行评定结果具
有一致性 ,生理生化指标越高的种子胚 ,其愈伤组织诱
导率就越高 ;生理生化指标均低于二倍体相应指标的
30 %是刺槐同源四倍体种子胚细胞生命力丧失的临界
指标 ; YVT、YMT、YRF 类型种子胚可溶性蛋白含量过
氧化物酶活性均高于二倍体相应指标的 30 % ,其细胞
具有一定的生命力 ,其中以 YVT类型种子胚愈伤组织
诱导率和相应的生理生化指标最高 ,所以 ,其细胞生命
力也最强。GNT、WNT 类型种子胚上述指标均低于二
倍体相应指标的 30 % ,组织培养时均未得到愈伤组
织 ,所以 ,其种子胚细胞完全丧失了生命力。
经进一步的育苗试验证明 ,如果种子胚不能诱导
出愈伤组织 ,那么该种子通过常规育苗就一定不会萌
发 ;不仅如此 ,有些种子胚即使能够诱导出愈伤组织 ,
如果该种子变异幅度过大 ,常规育苗条件下也不会萌
发 ,而这种严重变异的种子胚往往又比较有树木遗传
改良价值 ;由此可见 ,欲要这些种子胚转化为有遗传改
良价值的苗木 ,就只有借助组织培养等生物技术措施 ,
所以 ,进一步深入研究这类种子胚的组织培养促萌技
术就显得非常必要。
314 　已成功培育出 YVT、YMT、YRF类种子胚的实生苗。
315 　刺槐同源四倍体种子胚在形态、生理生化指标、
细胞生命力及最适宜培养基综合条件方面的差异 ,从
一个方面证实了植物同源四倍体遗传物质向后代传递
过程的不稳定性 ;这种不稳定性必然会引起其实生后
代发生相应的变异 ,研究如何有效利用这些变异培养
刺槐新品种具有重要意义。
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