全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 052343204
60 Coγ射线诱变选育热凝胶多糖高产菌株的研究
李卫旗1 　何国庆2
(11 浙江大学生命科学学院 ,浙江 杭州　310012 ; 21 浙江大学农业工程与食品科学学院 ,浙江 杭州　310027)
摘 　要 :利用60 Coγ射线对产生热凝胶多糖 (Curdlan)出发菌株 GM224 的菌体细胞与原生质体分
别进行辐照处理 ,发现60 Coγ射线对 GM224 原生质体的诱变效应明显优于对其菌体细胞的作
用。对最终诱变筛选获得的 1 株高产稳定的 Curdlan 生产突变株 A81 研究表明 :与 GM224 相
比 ,其 Curdlan 产量提高了 5014 % ,发酵周期缩短了 18 % ,发酵终止后底物残糖由 1513gΠL 降至
714gΠL。糖的转化率从 3817 %提高至 5812 %。这说明在 Curdlan 生产菌株的筛选中60 Coγ辐照
是一种有效的方法。
关键词 :产碱杆菌 ;可德兰多糖 ;60 Coγ射线 ;发酵
STUDY ON SELECTION OF CURDLAN HIGH2YIELD STRAIN BY IRRADIATION
LI Wei2qi1 　HE Guo2qing2
(1. College of Life Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 　310012 ;
2. College of Agriculture Engineering and Food Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 　310027)
Abstract :The cells and protoplasts of Curdlan2yield strain GM224 were treated by 60 Coγ2rays respectively. It was
found that the positive mutation effects of protoplasts were better than that of cells. The best mutant strain A81 was
compared with the orginal strain GM224 ,and the results showed that the yield of Curdlan was increased by 5014 %
and the fermentation period time was reduced by 18 %. After the fermentation ,the residual sugar in the medium was
decreased from 1513gΠL to 714gΠL and the conversion rate of sugar was increased from 3817 % to 5812 %. The study
indicated that 60 Coγ irradiation was an effective method for gaining excellent Curdlan2yield mutant strains.
Key words : Alcaligenes f aecalis ; Curdlan ; 60 Coγ2irradiation ; fermentation
收稿日期 :2002208215
作者简介 :李卫旗 (1964～) ,男 ,副教授 ,从事微生物育种与发酵研究工作。
热凝胶多糖又称可德兰多糖 (Curdlan) ,是一种由产碱杆菌 ( Alcaligenes f aecalis var. Myxogenes) 以葡萄
糖为底物发酵产生的胞外β21 ,32D 葡聚糖。Curdlan 的水悬浮液经加热后能凝固形成凝胶 ,可作为食品
素材和营养物质的包载材料 ,并能提高食品的粘弹性与可口性 ,是一种高性能的天然食品添加剂。
Curdlan 还具有多种重要的药理性能。例如能提高 M<的数量与吞噬能力 ,诱导肿瘤坏死因子的生成和
T细胞的增殖 ,其硫酸化衍生物还具有显著的抗爱滋病功效。因此 ,Curdlan 是一种兼具食品添加剂与生
物医药性能的新型生物材料。Curdlan 的发酵生产在日本、美国已获得成功。在我国有关研究尚处于起
步阶段 ,Curdlan 的产品生产尚是空白。因此 ,目前我国所需的 Curdlan 产品均需进口。
填补 Curdlan 生产空白的关键是获得高性能的生产菌株。近年来 ,我们从稻田土壤中分离得到多株
产碱杆菌 ,经亚硝基胍与紫外线辐照交替诱变筛选后 ,获得一株有较强生产能力的产 Curdlan 菌株 GM2
24。为了进一步改善其生产性能 ,本研究以 GM224 为出发菌株 ,分别对其菌体细胞与原生质体进行60 Co
γ射线的辐照处理 ,以期获得遗传稳定性良好的高产突变株。
343　核 农 学 报　2003 ,17 (5) :343～346Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1 　材料和方法
111 　材料
11111 　出发菌种 　从稻田土壤中分离 ,经亚硝基胍与紫外线辐照交替诱变筛选获得 ,菌株代号为 GM2
24 ,由本教研室保存。
11112 　培养基 　(1)平板与斜面培养基 :葡萄糖 310g ,牛肉膏 610g ,蛋白胨 510g ,酵母粉 510g ,NaCl 510g ,
琼脂 2010g , pH 自然 ,加水配至 1000ml ; ( 2) 种子培养基 : 葡萄糖 3010g ,酵母粉 910g , KH2 PO4310g ,
(NH4 ) 2 HPO4 018g ,Na2 SO4 013g ,柠檬酸钾 013g , FeCl3 0102g ,MgSO4 0103g ,pH 自然 ,加水配至 1000ml ;
(3)发酵培养基 :葡萄糖 5010g ,酵母粉 810g ,K2 HPO4 011g , (NH4 ) 2 HPO4 018g ,MgSO4 0103g ,柠檬酸钾 013 ,
FeCl3 01025g ,pH自然 ,加水配至 1000ml。
112 　方法
11211 　诱变前菌体材料的制备 　(1)菌体悬液的制备 :CM224 的斜面试管内注入无菌生理盐水 ,振
荡后经脱脂棉过滤 ,制成浓度为 106 个Πml 的菌体悬液 ; (2) 原生质体的制备 :从斜面取 1 薄环菌苔接入
种子培养液中 ,振荡培养 24h 到对数期 ,将上述菌液适量吸入至 5ml 含 015 %纤维素酶、2 %溶菌酶的
017 % NaCl 稳定液中 ,30 ℃静止作用 4～5h 使之形成原生质体 ,3000rΠmin 离心 15min ,将原生质体沉淀以
017 % NaCl 稳定液洗涤两次后离心 ,并接入新鲜的种子培养液内 ,制成 106 个Πml 浓度的原生质体悬液。
11212 　诱变 　选用不同剂量的60 Coγ射线 (见“结果与讨论 211”) ,于浙江大学核能所进行。
11213 　辐射致死率的计算 　经辐照处理后的菌悬液涂平皿 ,每皿 1ml 菌悬液 ,培养一定时间后统计菌
落数 D ,未经辐射的相同菌悬液样本在相同条件下涂平皿培养 ,统计菌落数 C ,致死率 R 值的计算为 :R
= (C - D)ΠC。
图 1 　60 Coγ射线对 GM224 的菌体细胞与原生质体
的致死效应
Fig. 1 　Effects of 60 Coγ2rays on cells and
protoplasts of GM22411214 　突变株的筛选 　(1)初筛 :经诱变处理后的菌悬液与原生质体悬液分别稀释后涂布平板 ,28 ℃培养 2～3d ,观察菌落生长并统计菌落数。与出发菌株相比 ,菌落直径大、周边呈稠厚状者为生长与产多糖性能较优良的菌株 ,将其挑取划斜面分离纯化。菌落明显偏小、表面及周边较干燥单薄者为性能低下的菌株 ,作为负突变株予以淘汰。(2) 复筛 :将初筛所获菌株进行摇瓶发酵 ,旋转摇床 220rΠmin、28 ℃培养 3d ,测多糖产量 ,多糖产量超出 GM224 者为正突变株。11215 　发酵指标的测定 　(1) Curdlan 产量的测定 :发酵液以 2000rΠmin 转速离心 10min ,分离上清液与菌体沉淀 ,上清液中加入 2～3 倍体积的 95 %乙醇充分振荡混合后 2000rΠmin 离心 15min ,去除上清液 ,对沉淀加 95 %丙酮、乙醇各洗 1 次 ,真空干燥至恒重 ,称量。(2)菌体生物量的测定 :将前述的菌体沉淀经95 %乙醇清洗 ,真空干燥至恒重 ,称量。(3) 底物残糖的测定 :蒽酮2硫酸法。2 　结果和讨论211 　辐射剂量与菌体致死率之间的关系图 1 为60 Coγ辐射剂量与菌体致死率之间关系的致死曲线 ,两条曲线的差异充分反映了出发菌株GM224 的菌体细胞与原生质体对60 Coγ辐射耐受力的不同。按照辐射诱变剂量选择的一般原则 ,我们根据图 1 的致死曲线 ,在诱变时选用60 Coγ射线对两
种形态细胞致死量的大约 50 %及 90 %剂量。因此 ,
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根据图 1 结果 ,使用的辐射诱变剂量如下 :菌体细胞为 200 与 500Gy ,原生质体为 100 与 300Gy。
212 　辐射诱变结果
已知出发菌株 GM224 的 Curdlan 产量为 19135gΠL (发酵液) ,所筛选菌株的产多糖能力均与该值作对
照。两种形态的细胞体经诱变后所得结果见表 1。由表 1 可以看出 ,无论是用 50 %或 90 %致死量的60 Co
γ射线对 GM224 进行诱变处理 ,原生质体产生正突变株的比例、最高水平单株产量的提高率均明显高于
菌体细胞。
表 1 　GM224 经60 Coγ射线辐照后的诱变结果
Table 1 　Effect of 60 Coγ irradiation on GM224 strains
GM224 出发态
original state of
GM224 辐射剂量irradiation dose( Gy) 菌落数number of colonies 正突变株数positive mutants 正突变率positive mutant rate( %) 最高单株产量highest yield(gΠL) 提高率increased rate( %)
原生质体 100 354 58 1614 2512 3012
potoplast 300 181 28 1515 2911 5014
菌体细胞 200 245 16 615 2215 1517
cell 500 107 9 814 2316 2119
213 　正突变株产 Curdlan 的遗传稳定性
在前述两种形态的细胞体诱变后获得的正突变株中 ,各选出 10 株 Curdlan 产量幅度提高最显著的
菌株作为分析对象 ,对第 1 代突变株进行摇瓶发酵试验 ,测定其产多糖能力。此后 ,将各菌株连续翻接
培养至第 5 代 ,再进行摇瓶发酵 ,测定其产多糖能力 ,并与第 1 代突变株进行比较 ,以观察其遗传稳定
性。结果见表 2 和表 3。由表 2 和表 3 结果可知 ,对原生质体、菌体细胞诱变后产生的正突变株 ,经 5 代
转接后 ,进行第 1 代与第 5 代菌株发酵产量之间的比较 ,保持稳定的 Curdlan 生产性能的菌株分别占
60 %和 30 %。可见 ,来自原生质体的正突变株产 Curdlan 性能较稳定。这可能是因为原生质体比具有完
整细胞壁结构的菌体细胞对γ射线有更强的敏感性 ,可在较小剂量下产生突变 ,从而避免了染色体的严
重损伤 ,增加了突变体性能的稳定性。
表 2 　原生质体突变株生产 Curdlan 性能的遗传稳定性
Table 2 　Curdlan2yield genetic stability of protoplast mutants
菌株代号
strain code A6 All A34 A38 A42 A49 A54 A60 A63 A66
第 1 代产量
yield of the first generation (gΠL) 2411 2317 2215 2911 2513 2216 2613 2713 2819 2211
第 5 代产量
yield of the fifth generation (gΠL) 1512 2319 911 2817 2411 2219 1116 2616 2212 2314
表 3 　菌体细胞突变株生产 Curdlan 性能的遗传稳定性
Table 3 　Curdlan2yield genetic stability of cell mutants
菌株号
strain code
B3 B9 B12 B23 B29 B30 B35 B39 B41 B44
第 1 代产量
yield of the first generation (gΠL) 2518 2314 2416 2817 2614 2416 2114 2711 2610 2211
第 5 代产量
yield of the fifth generation (gΠL) 1611 2311 1211 1512 813 2511 1414 1513 1418 2214
　　按照筛选与稳定性分析的结果 ,我们选定了代号 A38 的筛选株为最佳突变株。以下将 A38 与出发
菌株 GM224 的动力学特性进行比较 ,结果见图 2 和图 3。
从图 2 和图 3 可知 ,与出发菌株 GM224 相比 ,突变株 A38 生产 Curdlan 的各个性能指标均有了明显
提高 :多糖终产量从 GM224 的 19135gΠL (发酵液)提高到 2911gΠL (发酵液) ,提高率为 5014 % ; GM224 在发
543　5 期 60Coγ射线诱变选育热凝胶多糖高产菌株的研究
酵时间为 66h 后多糖产量达到最高 ,而 A38 则在 54h 后多糖产量已接近最大值 ,这使发酵周期缩短了
18 % ;发酵终止后 ,底物中的残糖由 1513gΠL (发酵液)降至 714gΠL (发酵液) ;糖的转化率从 3817 %提高至
5812 %。
图 2 　出发菌株 GM224 的发酵动力学曲线
Fig. 2 　Fermentation dynamics curves of strain GM224 图 3 　突变株 A38 的发酵动力学曲线Fig. 3 　Fermenatation dynamics curves of strain A38
　　本实验的出发菌株 GM224 是经过对天然的产碱杆菌进行亚硝基胍与紫外线辐照多次交替诱变筛
选获得的 ,如继续重复使用这些相同的诱变手段 ,菌株的正突变率很难进一步提高。只有采用其它诱变
方式 ,才有可能激发菌株另一些方面的潜在突变机制 ,从而显著改善菌株的生产性能。以上研究结果表
明 ,适当剂量的60 Coγ辐照对产 Curdlan 诱发菌株 GM224 的菌体细胞与原生质体均有较好的正突变诱变
作用 ,而其中对原生质体的诱变效果尤其明显 ,这反映在 GM224 的原生质体经60 Coγ辐照后 ,其正突变
率、最佳突变株的产量以及正突变株遗传性能的稳定性都优于菌体细胞。可见 ,在 Curdlan 生产菌株的
筛选改良中60 Coγ辐射是一种有效的方法。
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