全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062486204
水稻空间诱变的遗传变异及突变体的 AFLP 分子标记
蒲志刚1 　张志勇1 　郑家奎2 　向跃武1 　张志雄1 　蔡平钟1 　文春描1
(11 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 ,四川 成都　610066 ;21 四川省农业科学院水稻高粱研究所 ,四川 泸州　646000)
摘 　要 :搭载“神舟三号”航天飞船的水稻纯合种子在返回地面后 SP3 代种子出现颖壳、茎杆和叶片的主
脉变异为金黄色的突变体 ,其他性状无明显变异 ,经遗传分析 ,颜色变异属一对隐性基因控制的性状变
异。同时利用 AFLP 分子标记的方法 ,对航天诱变的水稻突变体进行基因组对比分析 ,通过聚丙烯酰胺
电泳寻找突变体 (黄金 1 号)多态性DNA 片段 ,经过一系列引物筛选 ,找到了 5 条多态性DNA 条带 ,对开
展突变体基因功能研究和杂交水稻聚合育种有十分重要的意义。
关键词 :空间诱变 ;突变体 ;颜色 ;AFLP ;分子标记
GENETIC VARIATION OF SPACE FLIGHT CARRIED RICE AND MUTANT
ANALYSIS BY AFLP MOLECULAR MARKER
PU Zhi2gang1 　ZHANG Zhi2yong1 　ZHENGJia2kui2 　XIANG Yue2wu1
ZHANG Zhi2xiong1 　CAI Ping2zhong1 　WEN Chun2miao1
(11 Institute of Biotechnology and Nuclear Technology , Sichuan Academy of Agricultural Sciences , Chengdu , Sichuan 　610066 ;
21 Rice and Sorghum Institute , Sichuan Academy of Agricultural Sciences , Luzhou , Sichuan 　646000)
Abstract :Rice seeds were carried by“Shenzhou No. 3”space shuttle , a mutant with golden chaff , stem and leaf was selected
and named Golden 1 after the seeds returned to the earth1 Except the golden color , other traits of Golden 1 are no obviously
different with its original material H9808. Genetic analysis identified that color variation was control by a pair of recessive
gene. The DNA fragments of the mutant were compared with its parent by AFLP molecular markers. Five specific bands were
found through a serial selections.
Key words :space2flight breeding ;mutant ; colour ;AFLP ;molecular marker
收稿日期 :2005212228
基金项目 :国家“863”计划 (2002AA2070002 ,2001AA2410112) ;四川省财政厅高新技术研究专项和四川省应用基础研究项目资助 (04J Y029200423) ;
四川省农业科学院青年基金
作者简介 :蒲志刚 (19772) ,男 ,四川南充人 ,在读博士 ,生物化学与分子生物学。张志勇为通讯作者 , Tel : 028 84504610 ; Email : zyzhang2004 @
hotmail . com
　　水稻是最重要的粮食作物之一 ,世界上有三分之
一以上的人口以稻米为主食。我国是世界水稻生产大
国 ,也是稻米消费大国 ,水稻栽培面积占粮食作物种植
面积的三分之一 ,产量占粮食总量的近一半。
空间诱变育种 (Space2flight mutation breeding) 是利
用返回式卫星或航天器将农作物种子带上高空 ,在微
重力、高真空、强辐射和交变磁场等条件下使其产生遗
传变异 ,进而经地面选育出农作物新品种的育种新技
术[1 ,2 ] 。与常规育种方法相比 ,空间诱变育种表现出部
分品种的变异频率高 ,变异幅度大 ,有益变异增多 ,大
多数变异性状稳定较快 ,育种周期缩短等特点 ;另外 ,
通过空间诱变育种还可出现一些地面上其他理化因素
诱变难于获得的特殊突变体 ,是基因功能研究的重要
材料。
DNA 标记是基因组分子水平上遗传多态性的直
接反映 ,它具有无表型效应、不受环境限制等优点。
AFLP 分子标记是植物基因组 DNA 经限制性内切酶双
酶切后 ,形成分子量大小不等的随机限制性片段 ,将特
定双链接头 (adapter) 连接在这些 DNA 片段的两端 ,形
成一个带接头的特异片段 ,作为 DNA 扩增的模板[3 ] 。
684　 核 农 学 报　2006 ,20 (6) :486～489Journal of Nuclear Agricultural Sciences
PCR引物 3′末端含有的选择核苷酸延伸到酶切片段
区 ,这样就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的
限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳分离检测。AFLP 标记具有简便、稳定、产
率高的特点 ,已广泛用于种质资源的研究、遗传图谱的
构建及基因定位[4 ] 。本文将遗传分析与 AFLP 标记结
合应用于航天水稻突变体黄金 1 号研究的初步结果报
道如下。
1 　材料和方法
111 　材料
供试突变体材料黄金 1 号水稻种子及其原始材料
H9808 及 H9808Π黄金 1 号的 F1 和 F2 由四川省农业科
学院生物技术核技术所提供。本试验中未搭载自交的
H9808 子代用作对照 ,对照的种子颖壳、茎秆、叶脉均
为浅黄色。
112 　方法
11211 　材料的田间种植 　原始亲本 H9808、搭载过
“神舟三号”航天飞船的突变体自交后产生的子代 ———
黄金 1 号 (暂定名)及它们的杂交 F1 和 F2 种植于四川
省农业科学院郫县现代化农业高新技术示范园 ,原始
亲本 H9808、突变体黄金 1 号及杂交 F1 代各种植 50
株 ,F2 代种植 1000 株 ,田间分别记载生育期、株型、叶
型、粒型、粒色、杆色等性状表现 ,收获时 F2 代取 200
株 ,其余材料各取 10 株 ,室内考查株高、有效穗、穗长、
结实率、千粒重、单株重等经济性状。
11212 　水稻幼苗总 DNA 提取 　水稻幼苗 015～1g 用
液氮磨成粉末 (随时加入液氮) , 转入 10ml 离心管中 ,
加入 65 ℃预热的 2 % CTAB 3ml (含 2 %巯基乙醇、4 %
PVP)水浴 90min ;冷却至室温 ,加 415ml 氯仿∶异戊醇
(24∶1) 混匀 ;15 ℃、4000rpm 离心 10min. ;取上清于另
一离心管中 ,加入 610ml、- 20 ℃异戊醇混匀直至絮状
沉淀出现 ;钩出絮状沉淀放于 5ml 离心管中 ,加 75 %乙
醇洗涤 2 次后倒置风干 ,加 400μl TE 4 ℃过夜溶解 ;然
后加 10μl 10mgΠml RNA 酶 37 ℃水浴 30min ,室温冷却
2min 后加入 500μl 苯酚 (pH715) ∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶
1)混匀 , 4 ℃、12000rpm 离心 10min ;取上清加入 500μl
氯仿∶异戊醇 (24∶1) 混匀 , 4 ℃、12000rpm 离心 10min ,
取上清加 1Π10 体积 3molΠL NaAc , 2 倍体积无水乙醇
(
- 20 ℃混匀 , - 20 ℃保存 30min 离心弃上清 ,加入
75 %乙醇洗涤 ;用 100 %乙醇清洗后风干 ;加入适量 TE
过夜溶解[5 ] 。
11213 　DNA 浓度测定 　用 018 %的琼脂糖凝胶检测
样品 ,根据标样调整样品 DNA 浓度为 100ngΠμl。
11214 　基因组 DNA 的酶切反应体系　每个 DNA 样品
酶切的混合液包括 :ddH2O 11μl ,Y+ ΠTANGOTMBuffer 2μl
(使用前振荡 ) , 10mmolΠL ATP1μl , 10uΠμl Mse Ⅰ1μl ,
EcoR I 1μl ;100ngΠμl DNA 模板 4μl。混合液于 37 ℃、2h ,
65 ℃、2h ,85 ℃,15min 进行酶切反应。
11215 　DNA 片段接头的连接反应体系 　在 11213 的
酶切反应液中加入 :ddH2O 419μl ,Buffer 210μl ,5ρmolΠμl
EcoR Ⅰ接 头 110μl , 50ρmolΠμl Mse Ⅰ接 头 110μl ,
10mmolΠL ATP 110μl , 10UΠμl T2ligase 011μl。于 22 ℃连
接 10h ,用 115 %琼脂糖电泳。检测时紫外光下可见弥
散条带 ,表明酶切、连接成功。
11216 　DNA 片段的预扩增与选择性扩增反应体系　
取酶切连接产物 5μl ,PCR mix 25μl ,ddH2O 17μl ,50ngΠμl
Mse Ⅰ引物 (M00 ) 115μl ,50ngΠul EcoR I 引物 ( E00 ) 115μl ;
在 PCR 程序 :94 ℃,30s ;56 ℃,30s ;72 ℃,1min ,扩增 30
个循环 ;4 ℃保存 ;取 8μl 预扩增产物 ,在 115 %琼脂糖
胶中检测扩增效果[6 ] 。
将预扩增样品用 011 倍 TE稀释 20 倍后取 5μl ,加
入 ddH2O 414μl ,50ngΠμl EcoR Ⅰ引物 011μl ,50ngΠμl Mse
Ⅰ引物 015μl , PCR mix 10μl ,在 PCR 扩增程序 : 94 ℃,
30s ;65 ℃,30s ( - 017 ℃Π循环) ;72 ℃,1min ;11 个循环 ;
94 ℃,30s ; 56 ℃, 30s ; 72 ℃, 1min ; 22 循环进行扩增 ,
115 %琼脂糖胶中检测扩增效果[7 ] 。
11217 　选择性扩增引物组合 　本试验所用选择性扩
增引物由北京华大基因公司合成 ,分为 M 和 E 两组引
物 ,其选择序列见表 1。
表 1 　所用 AFLP选择扩增引物序列
Table 1 　The sequence of sel2amplification
M1
CAA
M2
CAC
M3
CAG
M4
CAT
M5
CTA
M6
CTC
M7
CTG
M8
CTT
M9
CCA
M10
CCC
M11
CGC
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12
AAC AAG ACA ACT ACC ACG AGC AGG AAT AGA AGT ATC
11218 　聚丙烯酰胺变性凝胶电泳、银染　用 6 %的变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,银染显影后观察记录[8 ] 。
2 　结果与分析
211 　突变体黄金 1 号的特征特性
黄金 1 号全生育期 130d 左右 ,株高 110cm ,苗期长
势中等 ,分蘖力较强 ,叶片浅绿色 ,从主茎第 6 叶起新
出叶片主脉金黄色 ,主茎叶片数 16 叶 ,剑叶较长、直
784　6 期 水稻空间诱变的遗传变异及突变体的 AFLP 分子标记
立 ,茎秆较粗壮 ,茎颜色金黄 ,节间底部桔红色。穗长
23cm ,每穗着粒 130 粒左右 ,千粒重 30g ,粒长 918mm ,
粒宽 217mm ,颖壳金黄色 ,稻米透明度好 ,垩白率极低 ,
有香味。
212 　突变体黄金 1 号的遗传变异分析
图 3 　黄金 1 号的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Fig. 3 　The urea- PAGE result of Golden 1 sel-amplification
1 ,2 : E7M1 ; 3 ,4 : E7M2 ; 5 ,6 : E7M3 ; 7 ,8 : E7M4 ; 9 ,10 : E7M5 ; 11 ,12 : E7M6 ; 13 ,14 : E7M7 ;
15 ,16 : E7M8 ; 17 ,18 : E7M9 ; 19 ,20 : E7M10 ; 21 ,22 : E7M11 ; 单数为黄金稻 ;双数为对照。
通过对原始亲本、突变体及它们的杂交 F1 、F2 和
回交 F1 的田间调查与室内考种的数据分析 ,突变体除
颖壳颜色、茎秆颜色和新出叶的主脉颜色变为金黄色
外 ,其余外观表型性状与原始亲本完全一致。F1 与原
始亲本的外观性状也表现一致 ,表明突变体的颜色变
异属隐性基因控制。对 F2 代田间调查 876 株 ,其中颖
壳、茎秆、叶脉的颜色都发生变异的单株 185 株 ,表现
为原始亲本特征特性的单株 691 株 ,未发现仅颖壳或
茎秆或叶脉的颜色发生变异的单株 ,经χ2 检测 ,符合
3∶1 的分离规律 ,同样 F1 与突变体的回交一代 ,后代
表现为 1∶1 的分离 ,由此说明 ,突变体的颖壳、茎秆、叶
脉的金黄色特性由同一对隐性基因控制。在 F2 代的
株高、熟期、株型、叶型、粒型及穗部经济性状中 ,单株
之间的变幅较小 ,差异不显著 ,表明控制这些性状的基
因未发生突变。
213 　预扩产物与选择性产物琼脂糖凝胶电泳检测
图 1 中预扩产物的琼脂糖电泳结果表明有多条
DNA 片段被扩增 ,且 DNA 片段都大致在 500bp 左右 ,
呈现一定的连续条带 ,说明酶切时间合理、连接成功。
图 1 　预扩产物琼脂糖凝胶电泳
Fig. 1 　The pre-amplification results of AFLP
1 :黄金 1 号 Golden 1 ; 2 : CK
图 2 　选择性扩增产物琼脂糖电泳
Fig. 2 　The sel2amplification result on agarose
1 ,3 : 黄金 1 号 ; 2 ,4 :对照 ;
1 ,2 : E1M1 引物扩增 ; 3 ,4 : E1M2 引物扩增
1 ,3 : Golden 1 ; 2 ,4 : CK 1 ,2 : primer of E1M1 ;
3 ,4 : primer of E1M2
图 2 中选择性扩增产物的琼脂糖电泳结果经凝胶
成像系统显示两条亮度很高的条带 ,但彼此之间的差
884 核　农　学　报 20 卷
距很不明显 ,需要用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行
分析。
214 　聚丙烯酰胺电泳
图 3 中每两个条带为一组 ,每一组左为诱变种黄
金 1 号 ,右为对照新 H9808 ,从箭头标记可以看出在引
物 E7M4、E7M7、E7M8 中扩增出了多态性 DNA 片段 ,
表明突变体黄金 1 号与原种基因组上确实存在 DNA
水平上的变异 ,但这种基因组变异与表型变异之间是
否存在相关性 ,以及对水稻杂交育种具有重要作用的
表型变异的一些相关基因的分离、克隆还在进一步研
究中。
3 　讨论与结论
空间诱变技术能显著创造水稻的遗传变异[8 ,9 ] 。
作者近几年从神舟三号、神舟四号和返回式卫星搭载
的水稻纯合体种子和杂合体种子中 ,都能发现获得遗
传变异的材料 ,不同材料之间变异差异较大 ,有的只有
单个性状发生变异 ,有的多个性状发生变异 ,主要在株
高、熟期、株叶型和穗粒结构方面的突变较多 ,亲本血
缘较远的材料突变频率大于血缘很近的材料 ,因此在
选定原始材料时应考虑亲本的血缘组成。
空间诱变技术能创造单一性状的变异 ,尤其是隐
性基因控制的性状 ,它为基因的标记与克隆提供了创
造有用材料的手段[10～12 ] 。本研究通过神舟三号搭载
水稻种子 ,创制了一个由隐性基因控制的颜色为金黄
色的水稻种质资源 ,经 AFLP 分子标记的初步检测 ,已
证明为基因突变 ,其基因的定位、测序和克隆正在进行
中。
本试验利用分子标记手段来研究水稻航天诱变突
变体 ,试图通过分子标记方法对壳色变异和茎杆颜色
变异进行基因定位 ,找出其相关基因连锁关系。对水
稻杂交制种的杂交种在早期通过茎杆颜色和壳色就能
区分真假杂种 ,提高种子生产安全性 ,并且通过水稻稻
壳颜色进行种子机械色选 ,为杂交水稻制种机械化奠
定重要基础。针对航天诱变后水稻种子后代表现型性
状中产生的变异 ,从分子水平上研究相关性状的变异
基因 ,将分子标记紧密连锁的目标基因定位到染色体
上 ,并通过分子标记分离克隆一些目的基因 ,为杂交水
稻育种创造新材料奠定基础。同时 ,通过分子标记辅
助选择培育出带壳色和茎杆颜色变异双标记性状的不
育系材料将具有十分重要的意义。
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