全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 052356204
用γ射线和叠氮化钠诱变的玉米愈伤组织筛选
耐旱和雄性不育材料
付凤玲 李晚忱 荣廷昭 潘光堂 谭登峰
(四川农业大学玉米研究所 ,四川 雅安 625014)
摘 要 :用60 Coγ射线和叠氮化钠 (NaN3 )处理玉米愈伤组织 ,在含 110 %NaCl 的高渗培养基上筛
选 ,对再生植株株系进行耐旱性鉴定。结果表明 ,20 Gy 的辐射和 1 mmolΠL NaN3 是较为适合玉
米愈伤组织诱变的处理组配。22 个再生植株株系中 ,有 5 个诱变株系的耐旱性高于未诱变对
照 ,其中 1 个株系的耐旱性与耐旱自交系“81565”接近。此外 ,从 M1 代株系中发现了 1 个雄性
不育株 ,鉴定为细胞核隐性单基因控制的孢子体雄性不育。
关键词 :玉米 ;γ射线 ;叠氮化钠 ;愈伤组织 ;诱变 ;耐旱 ;雄性不育
DROUGHT TOLERANT AND MALE STERILE MATERIAL SCREENING FROM
MAIZE CALLUS MUTATED BYγ2RAY AND SODIUM AZIDE
FU Feng2ling LI Wan2chen RONG Ting2zhao PAN Guang2tang TAN Deng2feng
( Maize Research Institute , Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan , 625014)
Abstract :Maize callus was mutated by 60 Coγ2ray and sodium azide (NaN3 ) , and screened on high osmotic medium
with 110 % NaCl. The lines of the regenerated plants were identified for their drought tolerance. The result
indicated that γ2ray absorption dose of 20 Gy and NaN3 concentration of 1 mmolΠL were suitable treatment
combination to mutate maize callus. From 22 lines of regenerated plants , 5 lines were identified to be more tolerant
to drought than control , and one of them had almost the same tolerance with drought tolerant inbred line‘81565’.
Moreover , 1 M1 plant was found to be male sterile and identified as spore male sterility controlled by one karyon
recessive gene.
Key words :maize ;γ2ray ;sodium azide ;callus ;mutagenesis ;drought tolerance ;male sterility
收稿日期 :2004210210
基金项目 :四川省教育厅重点科学研究项目
作者简介 :付凤玲 (1962 - ) ,女 ,陕西蒲城人 ,副研究员 ,主要从事玉米生物技术研究。Email :ffl @sicau. edu. cn。潘光堂为通讯作者。
物理化学诱变可创造新型突变 ,丰富作物种质资源的遗传多样性[1～3 ] 。在玉米诱变育种研究中 ,一
般多以种子为诱变对象 ,存在着诱变频率低、有益突变稀少等缺点[4～10 ] 。高明尉、陈秋方等分别用60 Coγ
射线处理小麦和水稻的愈伤组织 ,除引起各种不同的染色体倍性突变外 ,还获得了早熟、矮杆等有益变
异 ,从再生植株群体中选育出具有高产、早熟、抗病等优良性状的新品种[11～12 ] 。高明尉、Gao 和 Chen 研
究认为 ,物理诱变剂与化学诱变剂的诱变机理不同 ,诱导的突变也不尽相同 ,结合运用可拓宽突变谱 ,从
中选育有益突变的频率更高[11 , 13 ] 。王彩莲等结合运用137 Csγ射线和叠氮化钠 (NaN3 ) 处理水稻种子 ,获
得了抽穗期、株高等方面的突变[14 ] 。本研究用60 Coγ射线和 NaN3 处理玉米自交系胚性愈伤组织 ,并在
高渗培养基上进行耐旱性筛选 ,从再生植株后代群体中分离选育出 1 个耐旱株系和 1 个细胞核雄性不
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育新材料。
1 材料与方法
111 愈伤组织的诱导与继代培养 以胚性愈伤组织诱导率和分化再生率高 ,并组配出“川单 13”、“川
单 16”、“川单 18”、“川单 20”等优良杂交种的亲本自交系“18 - 599”为材料 ,按照付凤玲等介绍的方法 ,
取授粉 13 d 左右、长 115～215 mm 的未成熟胚作外植体 ,在改良 N6 培养基上诱导愈伤组织[15 ,16 ] 。愈伤
组织发生后 ,按 Armstrong 介绍的鉴别标准[17 ] ,挑选胚性 ( Ⅱ型)愈伤组织 ,转入继代培养基 ,14 ℃暗培养 ,
继代繁殖。
112 γ射线诱变处理 继代培养 3 次 ,待愈伤组织的胚性基本稳定以后 ,用 0、10 、20、30 和 40 Gy 剂量
的60 Coγ射线处理愈伤组织。然后将愈伤组织转接继代培养基 ,27 ℃恢复培养 1 周。
113 Na N3 诱变处理 用 0、015、110、115 和 210 mmolΠL NaN3 (pH = 3)溶液浸泡后γ射线诱变处理 ,经恢
复培养愈伤组织 4 h ,然后用无菌水冲洗 ,无菌纸吸干表面水分 ,转接继代培养基 ,27 ℃恢复培养 2 周。
114 高渗培养基筛选 参考付凤玲等介绍的方法[16 ] ,将愈伤组织转接到含 1 % NaCl 的高渗培养基上 ,
27 ℃筛选培养 42 d ,第 21 天更换 1 次高渗培养基。筛选后再转入继代培养基 ,27 ℃恢复培养 2 周[18 ] 。
115 M0 代植株的再生 将愈伤组织转接到分化培养基上 ,在 2000 lx 光照和 27 ℃条件下分化培养。待
小芽长至 2～3 cm 时 ,转生根壮苗培养基 ,在相同光照和温度条件下培养发根。成苗后经温室内蛭石 +
珍珠岩 (3∶1)盆栽炼苗 ,待新根、新叶发出后 2～3 周移栽大田。精心管理再生苗 ,套袋自交或姊妹交 ,收
获 M1 代种子。
116 M1 代植株的观察和繁殖 因为 M1 代的群体太小 ,各株系种子数量多少不一 ,而且组织培养的生
理效应尚未完全消除 ,无法进行严格的田间比较试验 ,所以只进行一般的田间观察 ,扩大繁殖 M2 代种
子。
117 诱变株系的耐旱性鉴定 按付凤玲等介绍的方法[19 ] ,将 M2 代株系播种在四周通风、只遮挡降水
的塑料大棚下 ,随机区组设计 ,重复 3 次 ,单行区 ,每行 12 株。前期正常浅水 ,于抽雄前 15 d 左右开始干
旱处理 ,通过定量灌水 ,将土壤相对含水量调节保持在 55 %左右。以雌雄花期间隔 (anthesis and silk
interval , ASI)和平均单株籽粒产量为指标 ,比较诱变株系之间 ,及其与未诱变对照之间耐旱性的差异。
次年 ,按同样的试验设计和方法 ,扩大为 3 行区 ,并增加 3 个重复的正常灌水对照 ,将中选的耐旱性
株系与未诱变对照和耐旱自交系“81565”一起[19 ] ,做进一步的比较试验 ,以 ASI的耐旱系数 [ 12(干旱 ASI
- 灌水 ASI)Π灌水 ASI]和单株籽粒产量的耐旱系数 (干旱产量Π灌水产量) 为指标 ,再次鉴定诱变株系的
耐旱性。
118 雄性不育突变株的分离鉴定 对 M1 代发现的雄性不育株 ,用 I22KI 溶液 (012 % I2 + 210 % KI) 染
色 ,观察花粉育性 ,用同株系可育株花粉授粉保持 ,并调查其后代的育性分离比率。
2 结果与分析
211 γ射线和 NaN3 复合处理玉米愈伤组织的适宜诱变剂量
在转接高渗培养基时 ,调查愈伤组织相对生长量 [ (恢复培养后重量 - 处理前重量)Π处理前重量 ] ,
分析γ射线和 NaN3 复合诱变处理对愈伤组织生长的影响。经γ射线和 NaN3 复合处理后 ,愈伤组织的
生长受到抑制 ,相对生长量显著降低 (表 1) 。比较分析认为 ,20 Gy 的吸收剂量和 1mmolΠL 的NaN3 浓度 ,
是玉米愈伤组织诱变处理较为适合的剂量组配。在本试验中 ,该剂量组配的愈伤组织相对生长量为
0179 ,表明诱变处理致使大部分细胞或组织死亡 ,仅有少部分恢复生长 ,其中可能包含较多的突变细胞。
更高的处理剂量虽然可能诱导更多的突变 ,但细胞损伤较重难以通过筛选分化再生植株。
将γ射线和 NaN3 诱变并经恢复培养的存活愈伤组织 ,转接 NaCl 浓度为 1 %的高渗培养基 ,经过 2
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代的筛选培养 ,大部分愈伤组织不能抵御高渗筛选条件而褐变死亡 ,只有 20Gyγ射线和 1mmolΠL NaN3
以及邻近处理组合的部分褐化愈伤组织上 ,又长出了少量能够抵御高渗筛选条件的愈伤组织 (表 2) 。
经分化、生根壮苗培养和移栽管理 ,分别从 20Gyγ射线、110mmolΠL NaN3 和 20Gyγ射线、015mmolΠL NaN3
两组复合处理中分别获得 20 个和 2 个可育再生植株。从其他几个处理组合获得的少数再生植株 ,因长
势太弱 ,或在移栽管理过程中夭折 ,或者雌性不育 ,未能收获 M1 代种子。
表 1 γ射线和 NaN3 诱变后愈伤组织的相对生长量
Table 1 Growth rate of callus mutated
byγ2ray and NaN3
NaN3 浓度
NaN3 concentration
(mmolΠL) 吸收剂量 absorption dose ( Gy)0 10 20 30 40
0 3171 3165 1193 0137 0103
015 3163 3158 2111 0136 0107
110 3139 2103 0179 0121 - 0110
115 3105 3115 0130 0127 - 0136
210 2118 1179 - 0102 - 0142 - 0169 表 2 γ射线和 NaN3 诱变愈伤组织的高渗培养筛选率Table 2 Screening percentage of callus mutated byγ2rayand NaN3 during high osmotic pressure culture ( %)NaN3 浓度NaN3 concentration(mmolΠL) 吸收剂量 absorption dose ( Gy)0 10 20 30 400 013 014 110 010 010015 010 012 018 010 010110 010 011 114 012 -115 011 013 013 011 -210 010 010 - - -
212 诱变株系的耐旱性
方差分析表明 ,在干旱条件下 ,22 个诱变株系及未诱变对照的 ASI 和单株籽粒产量总体差异分别
达极显著和显著水平 ( FASI = 5126 33 , F单株籽粒产量 = 2108 3 ) 。用最小显著差数法 (LSD) ,将各诱变株系的
ASI和单株籽粒产量与未诱变株系进行多重比较 ,M01、M05、M07、M11 和 M13 五个诱变株系的耐旱性明
显优于对照 ,并以 M11 株系的耐旱性最强 (表 3) 。这 5 个株系均来自于 20Gyγ射线、110mmolΠL NaN3 处
理组合。
表 3 M2 代株系的耐旱性
Table 3 Drought tolerance of M2 lines
诱变株系
mutated line
ASI(d) 单株籽粒产量
yield per plant (g)
诱变株系
mutated line
ASI(d) 单株籽粒产量
yield per plant (g)
M01 317 3 4910 33 M13 310 33 5010 33
M02 416 3817 M14 413 3814
M03 315 33 3717 M15 415 3916
M04 510 2812 33 M16 410 3818
M05 311 33 4212 3 M17 317 3 3918
M06 411 3917 M18 418 3114 3
M07 219 33 4315 3 M19 313 33 3919
M08 316 3 3114 3 M20 414 3415
M09 315 33 4010 M21 315 33 4119
M10 417 3813 M22 416 3718
M11 215 33 5718 33 CK 415 3715
M12 315 4812
注 :M01～M22 为诱变株系代号 ;ASI 为雌雄花期间隔 ; 3 表示在 0105 水平与对照存在显著差异 , 33 表示差异达 0101 水平。
Note :M01～M22 mean codes of mutated lines ; ASI is abbreviation of anthering and silking interval ; 3 and 33 mean significant difference at 0105
and 0101 probability level , respectively , based on F test between mutated line and check.
次年 ,将耐旱性最强的 M11、M13 和 M01 三个诱变株系与未诱变对照和耐旱自交系“81565”一起[19 ] ,
再次进行耐旱性鉴定的结果列于表 4 ,方差分析均达极显著差异 ( FASI = 1015433 ,F单株籽粒产量 = 11135 33 ) 。
其中 ,仍以 M11 株系的耐旱性最强 ,耐旱系数比未诱变对照提高 56 % ,接近耐旱自交系“81565”。近 20
年来 ,以“81565”为亲本组配的杂交种“绵单 1 号”,一直是四川北部秦岭逆风坡旱区的主推品种。
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表 4 M3 代株系 ASI和单株籽粒产量耐旱系数
Table 4 Drought tolerant coefficients (DTC) of ASI and yield per plant of M3 lines
诱变株系 mutated line M01 M11 M13 CK 81565
ASI 耐旱系数 DTC of ASI 0164 0170 0165 0162 0178
单株籽粒产量耐旱系数 DTC of yield per plant 0158 0178 0167 0150 0185
213 雄性不育突变株的育性分离与遗传
在对 M1 代株系的观察繁殖过程中 ,从 M13 株系群体中发现一个植株的株高降低 ,雄穗变小 ,分枝
减少 ,花药极少露出颖壳、不开裂 ,花粉很少。用 I2KI 溶液染色镜检花粉 ,全部不着色。用同株系可育
株花粉授粉繁殖所得的 M2 代 ,花粉部分恢复育性 ,而 M2 代自交繁殖的 M3 代群体 ,花粉育性又发生分
离 (表 5) 。χ2 测验表明 (χ2 = 11467 ,小于χ20105 ,2 )该不育性符合 1∶2∶1 的分离比率。由此认为 ,该突变株
可能是由细胞核隐性单基因控制的孢子体雄性不育 ,但显性基因对隐性基因的育性恢复不完全。此外 ,
不育株的株高明显降低 ,而部分不育株的株高介于可育株与不育株之间 , 既可能是不育突变基因同时
具有降低株高的作用 ,也可能是诱变处理的另一种效应。
表 5 M3 代群体花粉育性分离及平均株高
Table 5 Pollen Sterility Separation and average plant height of M3 population
不育 sterile 部分不育 partial sterile 可育 fertile
株数 plant number 36 73 45
平均株高 average plant height (cm) 11810 13619 16916
3 讨论
综上所述 ,用γ射线和 NaN3 复合诱变处理玉米愈伤组织 ,以 20 Gy 的吸收剂量和 110mmolΠL 的浓度
组配较为适合 ,比王彩莲等复合处理水稻种子的 200 Gy 辐照和浓度 2mmolΠLNaN3 低[14 ] ,这是因为愈伤
组织对诱变处理的敏感性更高所致。除耐旱和雄性不育突变以外 ,本试验还发现叶片增大、白化苗、黄
绿苗等多种突变。
玉米愈伤组织继代培养的适宜温度一般为 27 ℃。在愈伤组织繁殖达到需要的数量之后 ,继续在最
适温度条件下培养 ,愈伤组织生长繁殖过快 ,在需要分化再生的季节以前继代次数过多 ,不利于胚性保
持和分化再生。因此 ,本研究根据付凤玲等的研究 ,将继代培养温度降低至 14 ℃,较好地解决了这一问
题[15 ,16 ] 。
诱变株系 M11 ,除耐旱性增强以外 ,在正常灌水条件下的生长势 ,也比未诱变的对照旺盛 ,出苗整
齐 ,叶色浓绿。其产量组成性状和配合力有无变异 ,还有待继续试验观察。
雄性不育突变株系 ,除株高降低以外 ,还有纹枯病发病比未诱变对照加重的趋势。可能是与抗病性
有关的基因发生了突变 ,也可能是株高降低导致节间缩短 ,纹枯病更容易沿叶鞘由基部向上扩展所致 ,
有待进一步研究。
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表 4 辐照后盐水鹅的氨基酸含量的变化 (gΠ100g 湿样)
Table 4 The amino acid content changes of the salted2goose after irradiation (gΠ100g wet sample)
氨基酸
amino acid CK
8kGy
辐照后 2d
2d after irradiation
偏差
deviation ( %)
辐照后 5 个月
5 months after irradiation
偏差
deviation ( %)
天门冬氨酸 Asp 2192 2198 2105 2198 2105
苏氨酸 Thr 1152 1152 0 1155 1197
丝氨酸 Ser 1131 1131 0 1132 0176
谷氨酸 Glu 4152 4169 3176 4171 4120
甘氨酸 Gly 1149 1174 16177 1164 10107
丙氨酸 Ala 2108 2125 8117 2118 4180
胱氨酸 Cys 0123 - - 0125 8170
缬氨酸 Val 1132 1142 7157 1138 4154
蛋氨酸 Met 0178 0179 1128 0180 2156
异亮氨酸 Lle 1142 1155 9115 1152 7104
亮氨酸 Leu 2178 2179 0136 2179 0136
酪氨酸 Tyr 1123 1125 1162 1124 0181
苯丙氨酸 Phe 1143 1145 1140 1144 0170
赖氨酸 Lys 3114 3122 2154 3129 4178
组氨酸 His 0178 0174 - 5113 0170 - 10125
精氨酸 Arg 2108 2121 6125 2116 3185
脯氨酸 Pro 0176 1104 36184 0189 17110
总氨基酸 total 29178 30198 30184
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