全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 032207205
生长调节物质对刺槐复叶离体再生的影响
赵　芳　李　云 3
(北京林业大学生物科学与技术学院 ,北京　100083)
摘 　要 :以引进的速生型刺槐的复叶为实验材料 ,进行离体培养 ,研究生长调节物质对刺槐复叶
的小叶和叶轴再生的影响。以 MS 为基本培养基 ,对 IAA、IBA、NAA、2 ,42D 4 种生长素 ,及 BA、
KT、ZT 3 种细胞分裂素进行单因子试验 ,对比并筛选出对刺槐小叶和叶轴再生最好的生长素
和细胞分裂素为 NAA、BA。采用 32 析因设计 ,进行 NAA、BA 配合试验 ,确定叶轴不定芽分化
的最佳生长调节物质配比为 NAA 015mgΠL + BA 210mgΠL ,此时不定芽分化率 73147 % ;小叶的
不定芽分化的最佳配方为 MS + NAA 110mgΠL + BA 210mgΠL ,不定芽分化率为 2015 %。
关键词 :刺槐 ;复叶 ;再生 ;生长调节物质
EFFECTS OF GROWTH REGULATORS ON REGENERATION OF COMPOUND
LEAF in vitro ON Robinia pseudoacacia
ZHAO Fang 　LI Yun
( College of Biological Sciences and Biotechnology , Beijing Forestry University , Beijing 　100083)
Abstract :The effects of growth regulators on regeneration of compound leaves of fast2growing Robinia pseudoacacia
were studied. Base on MS medium , four kinds of auxin IAA , IBA ,NAA ,2 ,42D and three kinds of cytokinin BA ,
KT ,ZT were arranged in monofactoral experiments. NAA and BA were selected to be the best regulators for
regeneration of folioles and raches of the compound leaf . Then a 32 factorial design was used to determine the best
combination of NAA and BA with different concentration. The results indicated that MS + NAA 015mgΠL + BA
210mgΠL was the best medium for adventitious bud regeneration of the raches with the differentiation rate of
73143 % , and to the folioles , it was MS + NAA 110mgΠL + BA 210mgΠL with the differentiation rate of 2015 %.
Key words : Robinia pseudoacacia ;compound leaf ;regeneration ;growth regulator
收稿日期 :2003209220
作者简介 :赵芳 (1977～) ,女 ,山西忻州人 ,在读硕士研究生 ,从事林木生物技术研究。3 通讯作者刺槐 ( Robinia pseudoacacia L. )是一种豆科固氮植物 ,其良好的抗旱、耐盐碱能力对于干旱、土壤贫瘠地区的水土保持、防风固沙、改良土壤和改善气候等 ,具有重要的生态意义。同时 ,刺槐也是优良的蜜源树种和家畜饲料来源[1 ,2 ] 。近年来 ,生物技术的应用和发展为刺槐育种开辟了广阔的前景。通过茎尖、茎段、叶、形成层等组织或细胞的离体培养[3～6 ] ,可在短期内获得大量优良的刺槐苗木。在组培基础上 ,进行体细胞突变筛选、外源基因导入等[7～9 ] 对刺槐进行定向改良 ,可以得到目标多样化的刺槐优良品种。至今国内关于刺槐复叶离体培养方面的研究尚未见报道。本研究以引进的速生型刺槐的无菌苗复叶为材料 ,研究生长调节物质对刺槐复叶的小叶和叶轴离体培养和植株再生的影响 ,旨在建立以小叶和叶轴为材料的刺槐离体再生体系 ,为进行遗传转化、诱变育种和突变体的筛选等奠定基础。
702　核 农 学 报　2004 ,18 (3) :207～211Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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1 　材料与方法
111 　材料
以引进的速生型刺槐无性系 1 年生嫁接苗为材料来源 ,选取其当年生健壮枝上带有腋芽的茎段 ,建
立刺槐无菌培养体系。在继代 20d 的试管苗上选取颜色正常充分展开的幼嫩复叶 ,将小叶与叶轴剪离。
叶轴剪成约 015～110cm 的小段。小叶沿叶缘一侧剪伤 ,至叶片主脉处 ,并将主脉切断 ,远轴面向下。小
叶与叶轴分别平放于附加不同组合、不同浓度生长调节物质的 MS 培养基上。
112 　方法
11211 　生长素对刺槐复叶离体培养的影响 　将刺槐小叶和叶轴分别接种于附加 IAA、IBA、NAA、2 ,42D
的 MS + BA 015mgΠL 培养基上。培养基含糖 3 % ,琼脂 016 %。培养温度 25 ±2 ℃,光照 2000Lx ,光照时间
12hΠd (培养条件以下相同) 。
11212 　细胞分裂素对刺槐复叶离体培养的影响 　将刺槐小叶和叶轴分别接种于附加 BA、KT、ZT的 MS
+ NAA015mgΠL 培养基上。
11213 　生长素与细胞分裂素的配比 　以上述试验结果为基础 ,选择对刺槐复叶离体培养效果好的细胞
分裂素与生长素进行配合试验 ,32 析因设计。
2 　结果与分析
211 　生长素对刺槐复叶离体培养的影响
21111 　生长素对刺槐小叶离体培养的影响 　由图 1 可见 ,生长素种类及浓度对刺槐小叶愈伤组织的诱
导有较大影响。30d 后没有观察到不定芽的分化。所有生长素都可促进刺槐小叶的脱分化 ,但是作用
程度明显不同。其中 2 ,42D 诱导愈伤组织所需的时间最短 ,诱导率最高 ,且愈伤组织量较多 ,愈伤组织
质量也较好 ;NAA 次之 ; IBA 与 IAA 诱导作用相仿。IBA 对外植体的伤害作用较大 ,相同的浓度和培养
条件下 ,接种于 IBA 培养基中的叶片外植体坏死现象比在其它生长素条件下严重。另外 ,相同的生长素
在同样培养条件下 ,愈伤组织量与生长素浓度呈正比。对上述培养物继代培养后继续观察。45d 后 2 ,
42D、IAA 诱导的愈伤组织变化不大。NAA 诱导的愈伤组织率、愈伤组织量都有明显的增加 ,且愈伤表面
出现白色纤维状愈伤组织。IBA 诱导的愈伤量也有所增加 ,但愈伤和外植体逐渐褐变死亡。
21112 　生长素对刺槐叶轴离体培养的影响 　30d 后 4 种生长素对叶轴愈伤组织的结果如图 2。除 NAA
011mgΠL + BA 015mgΠL 培养基中 ,1 个叶轴经愈伤组织分化不定芽外 ,没有观察到其它不定芽的发生。4
种生长素中 ,NAA、2 ,42D 的愈伤组织诱导率在 011、015、110mgΠL 时都达 100 % ,而 IAA 对叶轴愈伤组织
的诱导率则较小。相同条件下 ,刺槐叶轴的离体培养与小叶相比 ,具有以下特点 :愈伤组织产生时间较
早 ,愈伤组织量多 ,出愈率高。初步说明在相同的生长调节物质浓度下 ,叶轴对生长素的敏感程度较小
叶高 ,叶轴比小叶更易脱分化产生愈伤组织。
212 　细胞分裂素对刺槐复叶离体培养的影响
21211 　细胞分裂素对刺槐小叶离体培养的影响 　由图 3 可看出 ,在 3 种细胞分裂素中 ZT 对小叶的脱
分化作用最明显 , BA 和 KT 相近。另外 ,小叶愈伤组织的诱导率与细胞分裂素的浓度成反比 ( ZT 除
外) 。3 种细胞分裂素均未使小叶分化不定芽。与生长素对刺槐小叶愈伤组织的诱导结果相比 ,细胞分
裂素的作用要弱 ,诱导小叶产生的愈伤组织较少 ,诱导率也较低。
21212 　细胞分裂素对刺槐叶轴离体培养的影响 　诱导叶轴产生愈伤的结果见图 4。BA 110mgΠL 与
NAA 015mgΠL 配合后 ,有不定芽分化 ,其中既有直接分化的 ,也有经过愈伤组织后再分化的 ,分化率为
27 %。其中 ,除 ZT外 ,随着细胞分裂素浓度的增加 ,诱导叶轴产生愈伤组织的比例下降 ,而不定芽分化
的比例上升。在 3 种细胞分裂素中 ,BA 表现较好 ,分化不定芽的数量与质量最高。
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图 1 　生长素对小叶愈伤组织诱导率的影响
Fig. 1 　Effects of auxin on callus induction of folioles
图 3 　细胞分裂素对小叶愈伤组织诱导率的影响
Fig. 3 　Effects of cytokinin on callus
induction of folioles
图 2 　生长素对叶轴愈伤组织诱导率的影响
Fig. 2 　Effects of auxin on callus induction of raches
图 4 　细胞分裂素对叶轴愈伤组织诱导率的影响
Fig. 4 　Effects of cytokinin on callus
induction of raches
214 　生长素与细胞分裂素的配比
表 1 　NAA、BA 不同浓度配合后对刺槐小叶不定芽分化的影响
Table 1 　Effects of different NAA and BA levels on
adventitious buds differentiation from folioles
组合
combination
接种外植体数
No1 of folioles
inoculated
分化外植体数
No1 of folioles
differentiated
分化率
differentiation
rate ( %)
有效芽数
No1 of
effective buds
I0N0 (00) 34 0 0 　 0
I1N0 (10) 60 2 3133 2
I2N0 (20) 31 1 3121 1
I0N1 (01) 43 5 11163 8
I1N1 (11) 57 1 1175 0
I2N1 (21) 30 2 6167 2
I0N2 (02) 46 0 0 0
I1N2 (12) 54 0 0 0
I2N2 (22) 39 8 2015 1021411 　生长素与细胞分裂素的配比对刺槐小叶离体培养的影响 　以上述试验结果为基础 ,进行 NAA、BA 配合试验 (32 析因设计) 。NAA 采用 3 个浓度 :011、015、110mgΠL ,与 BA 015、110、210mgΠL 配合 ,进行小叶离体培养。30d 后调查分化不定芽的外植体数、有效芽数 (衡量不定芽的生长状况) ,并计算分化率。将刺槐小叶接种于上述组合的培养基上 ,10d 后陆续从切口处出现黄绿色到深绿色的愈伤组织 ,但愈伤组织量少。20d 左右在一些小叶的叶柄处或叶缘近叶脉处 ,开始分化不定芽 ,愈伤组织量也有所增加。分化的不定芽生长状况较好 ,从分化到成苗大约需要 10d ,分化的不定芽几乎都可成苗。不定芽大多由小叶直接分化产生 ,经愈伤分化的不定芽初期有玻璃化现象。小叶培养 30d 能够分化的叶片较少 ,不定芽分化率低 ,最高仅为20 %。将上述培养物在原培养基上继续培养后 ,分化的不定芽数继续增加。在上述的所有培 养 基 中 , NAA 110mgΠL + BA210mgΠL 的不定芽分化率最高 ,有效芽数较多 ,NAA 015mgΠL + BA 110mgΠL 次之。
902　3 期 生长调节物质对刺槐复叶离体再生的影响
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表 2 　NAA、BA不同浓度配合对刺槐叶轴不定芽分化的影响
Table 2 　Effects of different NAA and BA levels on 　　
adventitious buds differentiation from raches
组合
combination
接种外植体数
No1 of folioles
inoculated
分化外植体数
No1 of folioles
differentiated
分化率
differentiation
rate ( %)
有效芽数
No1 of
effective buds
I0N0 (00) 46 8 17139 14
I1N0 (10) 51 13 25149 24
I2N0 (20) 47 23 48194 35
I0N1 (01) 56 22 39129 16
I1N1 (11) 46 27 58169 40
I2N1 (21) 49 36 73147 45
I0N2 (02) 52 16 30177 25
I1N2 (12) 46 19 4113 16
I2N2 (22) 58 29 50 20
表 3 　方差分析表
Table 3 　Variance analysis
差异源
source of variance
平方和 SS
sum of squares
自由度 f
freedom
均方 Ms
mean squares
F
NAA 37411542 2 18710771 22116636 33
BA 43819585 2 21914792 26100562 33
误差 error 33175873 4 81439683
总计 total variation 84618714 8
初步说明 ,在 BA、NAA 合适的配比下 ,小
叶可以不经过愈伤组织的诱导 ,在短时间
内的进行不定芽的分化 ,迅速成苗。
对表 1 的分化率进行反正弦转换 ( X
→sin - 1 x) 后 ,进行方差分析 ,BA、NAA 两
因素均不显著。
21412 　生长素与细胞分裂素的配比对刺
槐叶轴离体培养的影响 　将刺槐叶轴接种
于如 21411 配合设计的培养基中 ,分化率
和有效芽数见表 2。15d 左右即在切口或
小叶着生处有不定芽的分化 ,多数不定芽
正常 ,可以在短时间内成苗。30d 后最高
的苗可达 20cm。其中 ,NAA 015mgΠL + BA
210mgΠL 的不定芽分化率最高 ,而且分化
的不定芽生长迅速 , 形态正常。NAA
110mgΠL + BA 210mgΠL 比 NAA 011mgΠL +
BA 110～115mgΠL 的不定芽分化率高 ,但有
效芽数低 ,原因可能是愈伤组织量多 ,分化
的不定芽玻璃化程度高。在试验中可以明
显看到 ,随着生长调节物质浓度的增加 ,叶
轴产生的愈伤组织量也逐渐增加 ,造成不
定芽分化困难 ,且此时 ,不定芽玻璃化的程
度增加。以上现象说明 ,刺槐叶轴不定芽的分化和正常生长需要较低浓度的生长调节物质。
对表 2 的不定芽分化率进行反正弦转换 ( X →sin - 1 x) ,方差分析结果见右表 (表 3) 。方差分析结果
表明 ,NAA 和 BA 两因子对不定芽分化的影响都达到了极显著的水平 ,需要进行多重比较。
多重比较结果如下 :刺槐叶轴离体培养中 ,NAA 浓度可敏感影响不定芽分化率 ,在 NAA 015mgΠL 时
不定芽分化率最高 ,与 NAA 011mgΠL 有极显著的差异 ,与 NAA 110mgΠL 有差异 ;而 NAA 011mgΠL 与 NAA
110mgΠL 的不定芽分化率则差异不显著。叶轴不定芽分化率对 BA 也敏感 ,BA 210mgΠL、BA 115mgΠL、BA
110mgΠL 三者之间差异显著 ,BA 210mgΠL 的不定芽分化率最高 ,与 BA 110mgΠL 有极显著的差异。
以上述数据分析可以得出 :NAA 015mgΠL、BA 210mgΠL 比较适合刺槐叶轴不定芽的分化 ,分化率达
到 73147 %。
3 　讨论与结论
本试验结果表明 ,刺槐复叶中小叶与叶轴的再生能力具明显差异 ,而且对生长调节物质要求也有差
异。在相同的条件下 ,叶轴比小叶容易诱导愈伤组织 ,也容易分化不定芽。在 MS + NAA 015mgΠL + BA
210mgΠL 培养基中 ,刺槐叶轴的不定芽分化率可达 73147 % ,而小叶的不定芽分化率仅为 6167 %。叶轴
的再生能力也大于小叶 ,小叶的不定芽分化率最高为 2015 % ,而叶轴最高可达 73147 %。而且 ,小叶再
生需要的生长调节物质的浓度也高于叶轴所需要的浓度。
同一植物器官不同部位的再生具有差异。孙月芳、黄剑华等以叶用莴苣为材料 ,研究子叶、子叶柄
和真叶、真叶柄对不定芽形成的影响 ,发现真叶的再生优于子叶 ,而在真叶中又以真叶柄的再生效果为
最好。研究者认为 ,真叶柄周围细胞群的生物全息表达潜能较强 ,易受外界条件的刺激 ,在适当条件下
易于产生全息表达 ,因而真叶柄最易再生[10 ] 。宋国庆、肖兴国等以草莓红丰品种作为材料 ,研究发现叶
圆盘的再生高于叶柄 ,而且再生率达到最高时所需的 BA 浓度也高于叶柄 ,推测是由于叶片和叶柄中内
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源植物激素的含量及二者利用外源生长调节物质的差异 ,造成二者再生的差异[11 ] 。陈维伦等对山新杨
叶外植体分化的研究表明 ,带有叶柄的下段 (极易在叶柄的切口上形成芽) 分化成芽的频率最高 ,达
70 %左右 ,而中、上段 (芽从叶脉上产生)的分化频率极低[12 ] 。
可见同一植物器官不同部位的再生差异是普遍存在的。其中不同部位内源激素的不同是造成差异
的主要因素 ,施用生长调节物质可以影响和改变内源激素水平[13 ] 。离体器官再生就是利用外部的生长
调节物质的刺激 ,打破内源激素的原始平衡状态 ,促使已分化的成熟细胞逆转、幼化 ,恢复原始分化能
力 ,重新进行分化 ,因而不同部位的再生就决定于内源激素原始状态的改变。
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