全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052392203
长期离体培养的春石斛兰类原球茎生长
及生根条件的优化
侯大强　柴明良　庄晓英
(浙江大学园艺系Π农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :为解决春石斛兰 ( Dendrobium nobile)类原球茎 (protocorm2like body ,简称 PLB)长时期离体培养后生
长缓慢、形成的嫩梢瘦小及根系难于发生等问题 ,本文从生长调节剂、有机添加物、蔗糖和嫩梢高度等因
子 ,对 PLB 的增殖、生长与生根等方面进行了系统研究。结果表明 :015mgΠL BA 最适合 PLB 增殖和生
长 ;20gΠL 的蔗糖最适合嫩梢的生根 ; IBA 虽在一定程度上促进生根 ,但嫩梢高度才是决定生根的关键 ,
215cm的嫩稍在添加 0105mgΠL 的 IBA 的培养基上 ,生根率提高到 51111 % ;鲜重增长倍数与 PLB 增殖倍
数的比值 (FΠP 值)是衡量 PLB 正常生长与否的一个重要指标 ,FΠP ≥016 时 ,PLB 生长健壮。
关键词 :春石斛兰 ; 类原球茎 ; 嫩梢高度 ; 生根 ; 有机添加物
OPTIMIZATION OF CULTURE CONDITIONS FOR GROWTH AND ROOTING OF
PROTOCORM2LIKE BODIES OF Dendrobium nobile in vitro
HOU Da2qiang 　CHAI Ming2liang 　ZHUANG Xiao2ying
( Department of Horticulture , College of Agriculture and Biotechnology , Zhejiang UniversityΠThe State Agriculture Ministry Laboratory
of Horticultural Plant Growth , Development and Biotechnology , Hangzhou , Zhejiang , 310029)
Abstract : To solve the problems of weak growth and low rooting potential of long period subcultured Dendrobium nobile
protocorm2like bodies (PLBs) in vitro , the effects of organic additives , plant growth regulators , sucrose and heights of the
shoots on the growth , proliferation and rooting of the PLBs were systematically studied. The results indicate that 015 mgΠL BA
was suitable for the growth and proliferation of the PLBs , and 20 gΠL sucrose suitable for rooting. Although IBA stimulated
rooting of the shoots , the height of shoot was crucial . On the basal medium supplemented with 0105 mgΠL IBA , the rooting
percentage of the 215 cm high shoots reached 51111 %. FΠP rate (increasing rate of fresh weight of PLBsΠincreasing rate of
proliferation of PLBs) is a key parameter to distinguish whether the growth of the PLBs is normal or not . When FΠP ≥016 , the
PLBs grew well .
Key words : Dendrobium nobile ; protocorm2like body (PLB) ; height of shoot ;rooting ; organic additives
收稿日期 :2005211224
作者简介 :侯大强 (19792) ,男 ,山东青岛人 ,在读研究生 ,研究方向为观赏植物生物技术。柴明良为通讯作者 ,Tel : 0571 86971036 ; Email : mlchai @
zju. edu. cn
　　石斛兰 ( Dendrobium) 是兰科多年生草本植物 ,分
布于印度、缅甸及东亚的许多国家和地区 ,是重要的观
赏植物。按照花期不同 ,可分为春石斛兰 ( D . nobile)
和秋石斛兰。春石斛兰是重要的盆栽花卉 ,因通过温
室栽培后可在春节期间上市 ,故在近年备受关注。
关于石斛兰的离体繁殖 ,已有相当多的报道[1～4 ] ,
但大多局限于外植体的试管建成、再生体系的建立、增
殖及愈伤的诱导等。与大多数植物一样 ,石斛兰经过
长时间的离体培养后 ,尤其是在含高浓度植物生长调
节剂的培养基上 ,体细胞无性系变异明显增加 ,导致畸
形苗和白化苗的产生 ;而更多情况下 ,是类原球茎的形
态正常 ,但生长减缓 ,再生的嫩梢瘦弱 ,难以生根 ,严重
影响试管快速繁殖的正常进行。而对于后者的防治对
策鲜有报道 ,本文就此问题展开研究。
293　 核 农 学 报　2006 ,20 (5) :392～394Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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1 　材料与方法
111 　材料
春石斛兰 (white Christmas‘Seagull’)的试管材料由
浙江森禾种业有限公司提供 ,在试管中继代约 18 个月
(继代 12 次左右) 。与初期 (接种 6～8 个月内) 材料相
比 ,类原球茎及再生梢形态正常 ,但生长速度明显减
慢、嫩梢瘦小 ;生根率从原来近 100 %(MS + 10 %椰乳)
下降到 5 %以下。
112 　方法
以大量元素减半的 MS 培养基为基本培养基 ,琼
脂 615gΠL ,蔗糖 20gΠL (有说明的除外) 。按试验设计在
灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物 ,培养基高温
灭菌前调 pH值至 514 ,121 ℃下灭菌 15 min。材料置于
光强 2000～2500 1x ,光周期 16hΠ8h ,温度 25 ℃±2 ℃的
条件下培养。
11211 　BA 对 PLB 增殖及生长的影响 　在添加了 100
gΠL 椰乳的基本培养基上 ,设置了 0、011、015、110 和
210mgΠL 5 个 BA(62苄基腺嘌呤) 浓度 ,4 次重复 ,每处
理接种 5 个外植体 ,每个外植体含 3 个 PLB ,称量鲜重
(g) 。试验结束时称量鲜重和统计 PLB (含嫩芽) 的数
量。
11212 　不同有机添加物对 PLB 生长的影响 　以基本
培养基为对照 ,分别添加椰乳、香蕉泥、马铃薯匀浆、番
茄匀浆、酵母提取物、蛋白胨和酪蛋白 7 种有机物 (前
4 种浓度为 100gΠL ,后 3 种为 110gΠL) 。每处理接种 10
个 PLB ,重复 4 次。
11213 　嫩梢高度和 IBA 对嫩梢生根的影响 　按嫩梢
高度分成 015、112 和 215cm 3 个水平 ,在添加 110gΠL
蛋白胨的基本培养基上 ,设置 4 个 IBA (吲哚乙酸) 浓
度梯度。
11214 　蔗糖浓度对嫩梢生根的影响 　以高度为 112cm
的嫩梢为外植体 ,在添加 110gΠL 蛋白胨的基本培养基
上 ,设置了 5 种蔗糖浓度的处理。
11215 　数据统计分析 　鲜重增长倍数 ( F) = (试验结
束时材料的鲜重 - 试验起始时材料的鲜重)Π试验起始
时材料的鲜重
PLB 增殖倍数 (P) = (试验结束时材料的 PLB 个数
- 试验起始时材料的 PLB 个数)Π试验起始时材料的
PLB 个数
所有试验均在四周后统计和测定。数据分析采用
DPS 分析软件 ,LSD 法 ,1 %水平差异。
2 　结果与分析
211 　BA 对 PLB 增殖及生长的影响
表 1 表明 ,浓度适宜的 BA 既是 PLB 增殖所必需
的 ,也是维持 PLB 生长状态不可缺少的。最适宜的BA
浓度为 015mgΠL ,PLB 鲜重增长及增殖效果均佳 ;不添
加BA 时 PLB 分化成单芽 ,而浓度过高 (210mgΠL) 时 ,
形成细弱的丛生芽。
表 1 　不同浓度的 BA 对 PLB 生长和增殖的影响
Table 1 　Effects of different concentrations of BA on the
growth and proliferation of PLB
BA 浓度
concentration
(mgΠL) 鲜重增长倍数growth rate offlesh weight (F) PLB 增殖倍数proliferationrate (P) 生长状态growth state
010 2173 ±1122 A 2158 ±0157 B 单芽1
011 6153 ±5141 A 6170 ±4127 AB PLB
015 7114 ±3142 A 10195 ±1109 A PLB
110 6121 ±2188 A 7120 ±2172 AB PLB
210 5151 ±2151 A 5191 ±2114 AB 丛生芽2
Note :1 :single bud ; 2 :caespitose buds.
212 　不同有机添加物对 PLB 生长的影响
图 1 可见 ,除香蕉泥的鲜重增长倍数 (F)和 PLB 增
殖倍数 (P) 均低于对照 (CK) 外 ,其他添加物对 F 和 P
均表现出不同程度的促进作用。其中以椰乳、酵母提
取物、马铃薯和蛋白胨对 PLB 的增殖促进作用最明
显 ;蛋白胨、椰乳对鲜重的增加效果最佳。试验中观察
到 (照片未显示) ,在 FΠP 值 ≥016 的蛋白胨、椰乳、马铃
薯和番茄处理中 ,PLBΠ嫩芽生长健壮 ,色泽深绿 ;而 FΠ
P值 < 016 的其他各处理中 ,PLBΠ嫩芽生长偏弱、色泽
　　　
图 1 　不同有机添加物对 PLB 生长和增殖的影响
Fig. 2 　Effects of various organic additives on the
growth and proliferation of PLBs
1 :香蕉泥 ; 2 :酵母提取物 ; 3 :酪蛋白 ; 4 :番茄 ;
5 :马铃薯 ; 6 :椰乳 ; 7 :蛋白胨. 下图同.
1 :banana ; 2 : yeast ; 3 : casein ; 4 : tomato ; 5 : potato ;
6 : coconut milk ; 7 : peptone. The same as following figures.
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黄绿 ,部分材料黄化。表明 FΠP 值是判定 PLBΠ嫩芽生
长良好与否的一个重要指标。
213 　嫩梢高度和 IBA 对生根的影响
IBA虽在一定程度上能够促进嫩梢 (高度为 112
和 215cm)生根 (表 2) ,但高度才是嫩梢生根的关键因
素。嫩梢在 015cm 时生根率为零 ,而在 112cm 时 ,在不
同 IBA 水平上的平均生根率为 30156 % ;215cm 的嫩梢
在不同 IBA 水平上的平均生根率为 41167 % ,其最佳
IBA 生根浓度为 0105mgΠL ,生根率达到 51111 %。
214 　蔗糖浓度对生根的影响 Chen 等[5 ]在 PLB 增殖过程中发现 ,适宜浓度的蔗糖是增殖所必需的 ,但浓度过高会导致后期分化难度增加 ; Pawlicki 等[6 ] 也发现 ,蔗糖浓度过高会抑制苹果根系的形成。表 3 也证实适宜浓度的蔗糖是石斛兰正常生长和生根所必需的 (表 3) 。蔗糖浓度过低 (0 和510gΠL)导致部分材料白化并最终死亡 (死亡率依次为3313 %和 1313 %) ;而浓度过高 (40gΠL) 则明显抑制根的发生 ,导致茎叶畸形 (畸形率 6910 %) ;20gΠL 的处理效果最佳 ,生根率达到 40167 % ,同时单苗根量最多 ,根系最长 (表 3) 。
表 2 　嫩梢高度及 IBA 浓度对嫩梢生根率的影响
Table 2 　Effects of IBA and height of shoot on the rooting rate of the shoot ( %)
高度
height (cm)
IBA (mgΠL)
0100 0101 0105 0110
015 0 ±0A 0 ±0A 0 ±0A 0 ±0A
112 24144 ±3185B 33133 ±0100B 40100 ±0100A 24145 ±3185A
215 35155 ±3185C 44145 ±3185C 51111 ±3185B 35156 ±10118B
表 3 　蔗糖浓度对嫩梢生根的影响
Table 3 　Effects of sucrose concentrations on rooting of the shoots
蔗糖 sucrose (gΠL) 生根率 rooting rate ( %) 根数量 No. of roots 根长 length of roots (cm) 生长状态 growth state
0 0 ±0C 0 ±0D 0 ±0D 部分白化死亡 partly dead
5 13133 ±2108BC 1119 ±0104C 0126 ±0104B 部分白化死亡 partly dead
10 25133 ±4151B 5116 ±0118B 0132 ±0104B 正常 normal
20 40167 ±11102A 10110 ±0128A 0142 ±0103A 正常 normal
40 7167 ±2108C 4197 ±0112B 0110 ±0102C 部分畸形 partly abnormal
3 　讨论
对多数兰科植物而言 ,原球茎和类原球茎 ( PLB)
是离体繁殖最主要的中间体 ,其本质是胚Π体细胞胚 ,
所以再生比较容易 ,通常在少量或不含植物生长调节
剂的培养基上芽Π梢和根同时发生 ,或分化出芽Π梢后
自然生根。这在石斛兰属[4 ] 、树兰属 ( Epidendrum
radicans ) [5 ] 、兰 属 ( Cymbidium ) [7 ] 、五 唇 蝶 兰 属
( Doritaenopsis ) [8 ] 、文心兰属 ( Oncidium ) [9 ] 、杓兰属
( Cypripedium) [10 ] 、蝴蝶兰属 ( Phalaenopsis) [11 , 12 ] 上均有
报道。而本材料由于长时间的离体培养 ,虽然形态正
常 ,基本符合快速繁殖材料的要求 ,但生长弱、生根能
力明显下降 ,需要探索特定的培养条件 ,以实现正常的
繁殖。
预备试验发现 TDZ (12苯荃232(1 ,2 ,32噻二唑252
荃)脲)较 BA 对 PLB 的增殖效果更佳 ,但后期生长缓
慢 , 难 以 生 根。这 一 点 与 在 脆 兰 属 ( Acampe
praemorsa) [13 ] 、兰属和石斛兰属[2 ] 上得出结果相符。进
一步试验发现 (表 1) ,015mgΠL 的 BA 也具有较好的增
殖效果 ,鲜重和 PLB 的增长倍数分别为 7114 和 10195 ;
未加 BA 处理的外植体 ,增殖倍数和鲜重增长倍数均
较低 ,且不能保持 PLB 状态 ,分化成单芽。BA 浓度过
高 (210mgΠL) 时 ,鲜重的增长倍数明显低于增殖倍数
(即 FΠP < 016) ,PLB 个体变小、黄化 ,质量下降 ,后期生
长停止 ,而且容易诱发畸形丛生芽的形成。说明适宜
浓度的细胞分裂素既是该材料 PLB 增殖所必需的 ,也
是维持 PLB 状态不可缺少的。在添加不同有机物的
比较试验中 ,进一步证实 FΠP 可成为衡量类原球茎生
长健壮与否的一个重要参数。
本试验表明 ,对于经过长期继代培养后生长减慢、
发育减缓、根系发生困难 ,但形态依然正常 ,尚可继续
用于快速繁殖的春石斛兰类原球茎 ,可以通过培养条
件的优化 ,添加适宜种类和浓度的生长调节剂和有机
物 ,恢复生长势并调控生长量与增殖率的平衡 ,再选择
适宜高度的嫩梢生根 ,从而实现快速繁殖效益的最
大化。
(下转第 397 页)
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其花粉发芽率随着60 Coγ射线照射剂量的增加而依次
降低的结果不一致。
从表 3 还可见 ,50、150、300Gy 照射过的凯特杏花
粉杂交的坐果率比对照也表现降低 ,并且达到了显著
水平 ,但组合间坐果率降低并没有随着剂量的增加而
递减。
3 　结论与讨论
不同的植物种类甚至不同品种之间对射线辐射的
敏感性有很大差异[6 ] ,不同辐射源对花粉发芽率的影
响也不同。本试验表明 :经所用剂量的60 Coγ射线和
紫外线照射后 ,黑宝石李、帚型山桃、凯特杏的花粉发
芽率比未照射的花粉明显降低 ,均达到极显著水平 ;两
种射线对 3 种果树花粉处理后 ,黑宝石李花粉最敏感、
花粉发芽率降低幅度最大 ;帚型山桃花粉的次之 ;凯特
杏花粉的辐射敏感性最弱、花粉发芽率降低幅度最小。
黑宝石李的花粉发芽率受剂量影响不明显 ,适宜的照
射剂量应低于 50Gy。60 Coγ射线对花粉的发芽率比紫
外线影响更明显。紫外线处理间均未达到显著水平 ,
可能是照射时间设置间隔太短。
本试验两个杂交组合中 ,诱变后花粉的发芽率高
低与杂交后坐果率的高低不尽一致 ,可能与杂交的花
朵数量少有关 ,在以后的研究中应把杂交花朵数增加
到与对照同等水平。本试验结果表明 ,辐射后花粉均
降低了远缘杂交的坐果率 ,与杨红花等[7 ] 得出的60 Coγ
射线处理花粉均能提高远缘杂交坐果率的结果不一
致 ,可能是因为杂交组合差异的缘故。因此 ,辐射桃
树、杏树的花粉克服远缘杂交不亲和性的适宜剂量有
待进一步研究。
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