全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 052595205
低能 N + 辐照提高小麦反转录转座子 Wis221A 的转录
并影响其邻近基因表达
押辉远1 ,2 　谷运红2 　王卫东2 　秦广雍2
(11 洛阳师范学院 生命科学系 ,河南 洛阳　471002 ;
21 郑州大学 河南省离子束生物工程重点实验室 ,河南 郑州　450052)
摘 　要 :为研究小麦反转录转座子 Wis221A 在低能离子束辐照小麦生物效应中的作用 ,用实时定量 PCR
的方法测定不同注量下 Wis221A 的转录水平及在基因组中的拷贝 ,并用转座子显示技术研究了 Wis22
1A 在注量为 5 ×1017N + Πcm2 的低能离子束处理后的转录对其邻近基因表达的影响 ,结果显示 :不同注量
的 N + 辐照都能提高 Wis221A 的转录水平 ,但在基因组水平上的拷贝没有大的提高 ,且在较高注量下 ,
由于 Wis221A 的高水平转录导致其邻近的某些基因沉默 ,这说明 Wis221A 在低能离子注入生物效应中
起主要作用。
关键词 :反转录转座子 ; Wis221A ;低能离子束辐照 ;基因表达
THE LOW2ENERGY N+ BEAM IMPLANTATION PROMOTING
TRANSCRIPTION OF WIS221A AND AFFECTING THE EXPRESSION
OF ITS FLANKING GENES
YA Hui2yuan1 ,2 　GU Yun2hong2 　WANG Wei2dong2 　QIN Guang2yong2
(11 College of Life Sciences , Luoyang Normal University , Luoyang , Henan 　471002 ;
21 Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering , Zhengzhou University , Zhengzhou , Henan 　450052)
Abstract :In order to investigate the roles of Wis221A in the low2energy beam biological effects , the transcription and the copy
number in genome of Wis221A were determined by real2time quantitative PCR. At the same time , the effect of the Wis221A
on the expression of its flanking genes under exposure of the low2energy ion beam was also investigated. The results showed
that the low2energy N+ beam implantation could promote the transcription of the Wis221A and restrain the expression of the
retrotransposon’s flanking genes. It was suggested that Wis221A played an important role in responsing the low2energy ion
beam biological effects.
Key words :retrotransposons ; Wis221A ; low2energy N + beam implantation ; gene expression
收稿日期 :2007212213 　接受日期 :2008203228
基金项目 :国家自然科学基金 (10505018)和国家“973”课题 (2004CB719604)
作者简介 :押辉远 (19772) ,男 ,河南禹州人 ,博士研究生 ,讲师 ,研究方向为辐射生物学。E2mail :yahuiyuan @yahoo. com. cn
通讯作者 :秦广雍 (19642) ,男 ,河南濮阳人 ,博士生导师 ,教授 ,研究方向为离子束与生物体相互作用。Tel :0371267767798 ; E2mail :qinguangyong @
zzu. edu. cn
　　小麦中的反转录转座子 Wis221A 是小麦基因组
中古老的一个反转录转座子成员 ,插入在小麦 1 号染
色体 Glu21A22 基因内 , 长度为 8624bp , 包括两个
1755bp 长的长末端重复序列 (LTR) ,中间的编码区长
度为 5114bp , Wis221A 反转录转座子具有 copia 反转录 转座子的基本元件如 PBS (primer binding site) 、LTRs(long terminal repeat sequence) 、PPT(polypurine tract) 、蛋白酶、整合酶、反转录酶等 ,但中间编码区的编码功能蛋白的序列中存在着较多的移码突变 ,这会改变蛋白功能甚至失去原有的功能 ,这种情况暗示了 Wis221A
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如果只依靠自身编码的蛋白难以发生转座 ,如果发生
转座现象必需其他反转录转座子有功能蛋白反式作用
的帮助才能实现。在反转录转座子 Wis221A 的 LTR
序列中 ,有 44 %的核苷酸序列存在着发夹结构 ,这种
结构对基因的表达有重要的调控作用[1～4 ] 。
我们先前的研究发现[5 ] ,小麦中的 copia2反转录
转座子在发育早期有转录活性 ,参与小麦的生长发育
活动。小麦经低能 N + 离子束处理后 ,其反 copia2转录
转座子的转录活性大大提高 ,可能参与小麦对低能
N + 离子束刺激的应答。对低能离子束处理后的小麦
中 copia2转录转座子是否发生转座的研究显示有一个
反转录转座子发生了转座[6 ] 。一些研究表明 ,小麦中
的反转录转座子 Wis221A 能够影响邻近基因的表达 ,
如 Wis221A 在新合成四倍体小麦中具有很高的活性
并且能稳定表达 ,当它被激活时 , Wis221A 的 2 个LTRs
使得它们相邻的序列进行转录 ,形成已知基因的有义
链或者反义链造成相应基因的表达或沉默[7 ,8 ] 。本文
研究了低能 N + 离子束处理小麦能否提高 Wis221A 的
转录 ,以及对其邻近基因的表达模式是否产生影响。
1 　材料与方法
111 　材料
小麦品种周麦 16 种子为本实验室保存。
低能离子束注入机型号 :UIL. 01512 , TNV. 购自
俄罗斯强电研究所 ,其工作真空度为 2 ×10 - 2 ～5 ×
10 - 2 MPa。实时定量 PCR 仪型号 : Corbett Research
Rotor2Gene 2000 (澳大利亚 ) ; Total RNA 提取试剂
(Takara D312) 、Real2time PCR SYBR Premix Ex TaqTM kit
(DRR041S) 、DNaseI (D2215) 等试剂购自宝生物工程
(大连)有限公司 ;AFLP 试剂盒购自北京鼎国生物技术
有限责任公司 ,反转录系统 (A3500) 购自 Promega 公
司 ;其他试剂为国产分析纯。
1. 2 　试验方法
1. 2. 1 　低能离子束注入 　选取饱满一致的小麦种子
(所有种子均来自同一单株) ,种胚朝上排放在注入盘
上 ,真空 (3 ×10 - 3 Pa) 接受低能 N + (30keV) 的注入 ,注
入剂量为 : 1 ×1017 , 3 ×1017 , 5 ×1017 和 7 ×1017 N + Π
cm
2 。注入完毕后 ,部分种子立即在 25 ℃人工气候箱
中黑暗条件和适当的湿度下发芽。以未注入 N+ 的种
子作对照。
1. 2. 2 　RNA 的提取及反转录　试验前 ,将所用试剂和
器皿按 RNA 提取试剂盒说明进行处理。经 N + 注入后
的种子 ,在适宜条件下发芽 24 和 48h 时分别提取全株
的总 RNA(选取幼苗 20 株 ,混合提取总 RNA 池) 。提
取方法见试剂盒说明书 ,提取完毕后用 DNaseI 处理样
品 ,以除去其中的 DNA。取 1μg RNA 样品进行反转
录 ,引物为随机引物 ,操作按照反转录系统说明书进
行 ,反转录完成后 ,反应物用无菌去离子水稀释 100
倍 , - 20 ℃条件下保存 ,备用。
1. 2. 3 　实时定量 PCR 　实时定量 PCR 中 ,用于检测
18sRNA 表达量的引物序列如下 :
18sFw :5’2GAGTACAATCTAAATC23’
18sRe :5’2TGCTAATGTATCCAG23’;
测定 Wis221A 反转录转座子所用的引物序列如
下 :
PwisFw :5’2CAACAATTAGAGGACGTC23’
PwisRe :5’2AACATCACATGCAATCAAATA G23’
引物Ltr3fw :5’2AGG GTA TGT AGA TGC ACT CTC
C23’是根据 Wis221A 3’端 LTR 序列设计的 ,LTR 与引
物结合位点的下游 LTR 序列中不存在 MseI ( TTAA) 的
酶切位点。
MseI2adapter : 5’2GACGATGAGTCCTGAG23’ (MseI2
Oligo. 1)
3’2TACTCAGGACTCAT25’(MseI 2Oligo. 2)
试验中所用的反向引物为试剂盒提供的 MseI 引
物和选择性引物 M2CAA 和 M2CTC。由于 Wis221A 在
小麦基因组是高拷贝存在 ,在接头引物前面加 3 个随
机的碱基进行选择扩增 ,以便能在琼脂糖凝胶上有好
的分离效果。
实时定量 PCR 包括以反转录的 cDNA 为模板测定
小麦反转录转座子 Wis221A 的相对转录水平 ,将对照
小麦反转录转座 Wis221A 的转录水平设为 1 ,其他处
理样品与之相比作为相对表达量 ,内参照基因 18s
rRNA ;同时包括以基因组 DNA 为模板测定小麦反转录
转座 Wis221A 在基因组上的相对拷贝数 ,将对照的小
麦反转录转座 Wis221A 在基因组上的拷贝数设为 1 ,
其他处理样品与之相比 ,视为相对拷贝数 ,内参是 18s
rRNA 的 DNA 在基因组上的拷贝数。每个样品进行 3
次实时定量 PCR 重复试验。PCR 产物进行琼脂糖凝
胶电泳分析。实时定量 PCR 的阴性对照为只加引物
而不加模板的体系。数据组之间的差异性分析用
SPSS1010 进行 T2test 检测 ,柱状图由 Excel 生成。
参照实时定量 PCR 试剂盒说明书配制反应体系
溶液 ,用离心机轻轻离心 PCR 反应管后放入实时定量
PCR 仪中进行反应 ,反应程序 :95 ℃10sec 进行 1 个反
应后 ,进行 95 ℃10 , 45 ℃10 , 72 ℃20 的循环 ,共进行
40 个循环。反应结束后 ,分析 Real2time 扩增曲线和溶
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解曲线。
1. 2. 4 　转座子显示技术[9 ] 　本研究所用转座子显示
技术基于 AFLP 技术 ,模板不是 DNA 而是 cDNA ,这是
分析基因差异表达常用的方法之一。正向引物是反转
录转座子 Wis221A LTR 的保守序列 ,反向引物是接头
引物 ,通过 PCR 扩增出的条带是和 Wis221A 共转录的
下游基因 ,条带多少的变化就是共转录基因表达数目
的变化。
小麦幼苗总 RNA 提取后 ,用随机引物进行反转录 ,
合成第 1 链 ,反转录产物沉淀后在大肠杆菌 DNA 聚合
酶 Klenow 片段作用下于 15 ℃反应 20h ,此酶能识别
cDNA 3’末端发卡环 ,并以其为引物以 cDNA 第 1 链为模
板 ,合成第 2 链。沉淀第 2 链产物 ,然后用限制性内切
酶MseI酶切 ,并在 T4DNA 连接酶的作用下加上 MseI 接
头 ,按照 ALFP 说明书进行预扩增和选择性扩增。
1. 2. 5 　预扩增 　在 012ml 离心管中按下列方式加入
模板 :DNA 2μl , 引物Ltr3fw 1μl ,预扩增 MseI 引物 1μl ,
dNTPs 015μl ,10 ×PCR buffer 215μl , Taq DNA polymease
015μl ,ddH2O 1715μl。离心数秒 ,按下列参数进行 PCR
扩增 30 个循环 :94 ℃30s , 56 ℃30s , 72 ℃80s。最后用
TE buffer 按 1∶20 稀释样品。
1. 2. 6 　选择性 PCR 扩增 　在 015 或 012ml 离心管中
按下列方式加入 ,预扩增稀释样品 2μl ,10 ×PCR buffe
215μl , dNTPs 015μl , Ltr3fw 引物 (10pmolΠL) 1μl ,MseI
引物 (10pmolΠL) 1μl , Taq 酶 1μl , ddH2O 17μl (25μl 体
系) ,混匀后离心数秒 ,进行 1 个 PCR 循环 :94 ℃30s ,
65 ℃30s , 72 ℃80s ;以后每循环退火温度递减 017 ℃或
1 ℃,扩增 12 或 10 个循环 , 即递减 017 ℃,则扩增 12
轮 ,递减 10 ℃则扩增 10 轮。然后按下列参数扩增 23
个循环 : 94 ℃30s , 55 ℃30s , 72 ℃80s。试验设对照、
真空处理、5 ×1017 N + Πcm2三个样品进行反应。
2 　结果与分析
2. 1 　不同剂量 N+ 离子束注入时 Wis221 A 的相对转
录水平
试验测定了低能 N + 处理小麦种子后培养 24h 的
转录水平 ,结果显示 (图 1) ,除剂量 7 ×1017 N + Πcm2外 ,
小麦反转录转座子 Wis221A 的转录水平相对于对照
都显著提高。在剂量 7 ×1017 N + Πcm2时 , Wis221A 的转
录水平比对照极显著降低 (在此剂量下 ,小麦生长损伤
严重) 。同时在剂量 5 ×1017 N + Πcm2时 , 小麦反转录转
座子 Wis221A 的转录水平相对于对照和其他处理样
品达到最高值。这些结果都与我们测得的 copia 群反
转录转座子培养 24h 的转录水平相似。
经低能 N + 离子束注入后的小麦种子在培养 48h
后 ,其反转录转座子 Wis221A 的相对转录水平整体上
相对于 24h 有明显提高 (图 2) ,除了剂量 1 ×1017 N + Πcm2
外 ,其他处理样品相对于对照都达到极显著提高水平 ,
注量为 5 ×1017 N + Πcm2时 ,其转录水平为处理样品的最
高值 ,与对照相比达 112 倍。试验所设最大处理剂量 7
×1017N + Πcm2 处理的种子在培养 24h 时 ,反转录转座子
Wis221A 转录水平相对较低 ,而在培养 48h 时 ,达到了
较高的水平 ,说明辐照造成的损伤有所恢复 ,这一点也
与 copia 群反转录转座子在培养 48h 的表现相似 ,转录
水平与剂量间呈“马鞍型”曲线关系 ,即随着剂量的增
加 ,其转录水平呈现先升后降又升又降的曲线。
图 1 　培养 24h 时小麦反转录转座子
Wis221A 的相对转录水平
Fig. 1 　The comparative expression of the Wis221A
in treated wheat seed incubated for 24h
A、B、C、D、E、F 分别为 :对照、真空处理、1 ×1017N + Πcm2 、3 ×1017N + Π
cm2 、5 ×1017N + Πcm2 、7 ×1017N + Πcm2 。图 2 和 3 同
A ,B ,C ,D ,E ,F are the samples of the control , vacuum control , 1 ×1017N + Π
cm2 ,3 ×1017N + Πcm2 ,5 ×1017N + Πcm2 ,7 ×1017N + Πcm2 respectively。The
same as following Fig. 2 and 3
图 2 　培养 48h 时小麦反转录转座子
Wis221A 的相对转录水平
Fig. 2 　The comparative expression of the Wis221A
in treated wheat seed incubated for 48h
795　5 期 低能 N + 辐照提高小麦反转录转座子 Wis221A 的转录并影响其邻近基因表达
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2. 2 　不同剂量 N+ 注入种子培养 48h 时 Wis221 A 在
基因组上的相对拷贝数测定
如图 3 所示 ,经低能 N + 处理的小麦种子培养 48h
时 ,反转录转座子 Wis221A 在基因组上的拷贝数没有
较大提高 ,处理样品的 Wis221A 在基因组上的相对拷
贝数与对照相比在统计上没有显著差异。根据经验 ,
一般情况下 ,实时定量 PCR 结果显示为 2 倍以上才可
认为是有意义的差异。从本试验结果来看 , Wis221A
在基因组上的相对拷贝数没有显著增加。
图 3 　低能 N + 处理小麦种子在培养 48h 时反转录转座子
Wis221A 在基因组上的相对拷贝数
Fig. 3 　The relative copy number of the Wis221A
in genome of N + implantation treated
wheat seed after 48h culture
2. 3 　利用转座子显示技术研究 Wis221 A 转录对邻近
基因表达的影响
琼脂糖凝胶电泳分析 (图 4) 显示 ,对照和真空处
理在扩增条带上一致 ,而较高剂量 (5 ×1017 N + Πcm2 ) 的
N + 处理 ,2 条 MseI 引物的扩增产物相对于对照 ,都显
示有条带减少 ,说明在对照和真空处理样品中表达的
某些基因 ,在剂量 5 ×1017 N + Πcm2 时发生了沉默 ,
Wis221A 对这些沉默的基因起到了调控作用。而在表
型上看 ,这一剂量点的小麦损伤也较严重 (未发表) 。
由于本试验用的是琼脂糖凝胶电泳而不是分辩率高的
丙烯酰胺 ,有些条带的差异可能没有显示出来。
3 　讨论
反转录转座子的转录活性可以被一些胁迫激活或
是提高 ,反转录转座子参与植物对这些胁迫的应答。
研究表明 , Wis221A 在由 2 个二倍体亲本合成的四倍
体小麦中影响其邻近基因的表达[7 ] 。本试验表明 ,低
能 N + 离子束注入种子可提高小麦中 Wis221A 的转录
水平 ,并且 Wis221A 邻近的一些基因表达减少了 ,这
图 4 　Wis221A 反转录转座子差异表达显示
Fig. 4 　Profiles of the Wis221A retrotransposon display
A :对照 ;B :真空 ; C :注量 5 ×1017N + Πcm2 。1 和 2 分别为不同引物组
合的扩增结果
A ,B ,C are the samples of the control , vacuum control , and 5 ×1017N + Πcm2
respectively. 1 :primers pair of Ltr3fw and M2CAA , 2 :primers pair of Ltr3fw
and M2CTC
些沉默的基因是否与小麦苗当代离子束注入生物效应
有关 ,还需进一步深入研究。此外这些沉默的基因在
植物发育中起什么作用 ,也是很值得探讨的问题。以
上结果暗示了 Wis221A 参与小麦应答低能离子束辐
照的过程。
在 48h 时测得的 Wis221A 在基因组上的拷贝数并
没有多大变化 ,这说明经低能离子束辐照 ,其转录水平
的提高不是为了完成转座 (每发生 1 次转座 ,其拷贝数
要增加 1 倍) 。同时 ,我们也看到 ,在高注入量 (此剂量
下转录水平提高百倍) 下 Wis221A 邻近的一些基因表
达减少了 ,这说明其转录水平的提高影响邻近基因的
活性。由于各种原因 ,本试验只选择了一个低能 N+
离子束注入的剂量 ,还不能说明是否在较小注量的离
子束注入下 Wis221A 邻近的一些基因表达增强 ,或是
一些不表达的基因在 Wis221A 转录的作用下而表达
了的情况。但是本试验确实表明在一定注入量下 ,小
麦反转录转座子 Wis221A 的转录参与小麦对低能离
子束应答 ,这可能是小麦通过改变基因表达模式来抵
抗低能离子束注入的胁迫。这个结果提示 ,占植物基
因组很大成分的反转录转座子在低能离子束生物效应
中有很大的作用 ,应对此给以重视。我们在研究低能
离子束生物效应时 ,不但要研究离子束生物效应发生
的物理过程 ,还要研究离子束生物效应产生的生物学
机制 ,不但要研究低能离子束对生物造成的 DNA 损伤
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及修复错误过程 ,还要研究生物主动适应低能离子注
入胁迫发生的生理生化的改变以及基因表达模式的改
变。
植物中反转录转座子占植物基因组很大组分 ,高
等植物中的反转录转座子参与植物的多种生理生化过
程 ,但是 ,在不经环境胁迫的情况下 ,很多反转录转座
子并不发生转录 ,如果发生转录会影响一些基因的表
达 ,并影响生物特性 ,通过这个思路可以研究某些在低
能离子束辐照下受反转录转座子调控的基因在应答胁
迫中的作用 ,这样可以将生物表型和某些功能基因联
系起来。
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