全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):442 ～ 446
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0442-05
水稻 SUSIBA2-like基因的克隆与分析
方结红1 张明洲1 刘 军1 王雪艳1 孙传信2
(1. 中国计量学院生命科学学院，浙江 杭州 310018;2. 瑞典农业大学植物学系，瑞典 乌普萨拉 SE-75007)
摘 要:采用 RT-PCR 技术克隆了水稻中淀粉去分支酶 1 (isoamylase 1，ISA1)和 SUSIBA2-like 基因的
cDNA 序列，全长 ORF 分别编码了 811 个和 572 个氨基酸残基。生物信息学分析显示 SUSIBA2-like 与
SUSIBA2 氨基酸同源性为 80. 7%，同属于第 1 类 WRKY 转录因子家族，且三级结构相似，可能具有相同
的功能。半定量 RT-PCR 分析表明，ISA1 基因在灌浆期 12d 胚乳中的表达量达到了 1 个峰值，在叶、根、
茎中不表达;SUSIBA2-like 基因也在灌浆期 12d 胚乳中的表达量达到了 1 个峰值，在根中没有检测到表
达，在叶、茎中有表达。
关键词:淀粉去分支酶;转录因子;半定量 RT-PCR
CLONING AND ANALYSIS OF SUSIBA2-like GENE FROM Oryza sativa
FANG Jie-hong1 ZHANG Ming-zhou1 LIU Jun1 WANG Xue-yan1 SUN Chuan-xin2
(1. College of Life Science，China JiLiang University，Hangzhou，Zhejiang 310018;
2. Department of Plant Biology，The Swedish University of Agricultural Sciences，Uppsala，Sweden SE-75007)
Abstract:Two cDNA fragments，ISA1 and SUSIAB2-like，were isolated from Oryza sativa by RT-PCR technique. The
full length open reading fragments of ISA1 and SUSIAB2-like encoded 811 and 572 amino acid residues，respectively.
Both SUSIBA2-like and SUSIBA2，with 80. 7% similarity of amino acid sequences，belonged to the group I of WRKY
transcriptional factor superfamily. Furthermore，their putative tertiary structures were very much similar and may have a
similar biological function. The semi-quantitative RT-PCR analysis indicated that ISA1 expressed with a peak value at
12d after pollination，in endosperm but not in root，stem or leaf. The expression pattern for SUSIBA2-like was similar，
except that SUSIBA2-like also expressed in stem and leaf.
Key words:starch debranching enzyme;transcription factor;semi-quantitative RT-PCR
收稿日期:2009-10-08 接受日期:2009-12-04
基金项目:浙江省自然科学基金(Y3090617，Y304463)
作者简介:方结红(1984-)，男，安徽安庆人，硕士，主要从事植物分子生物学研究。Tel:0571 － 86914476;E-mail:figo0726@ 163. com
通讯作者:张明洲(1970-)，男，浙江温州人，博士，教授，从事植物生物技术研究。Tel:0571 － 86914476;E-mail:zmzcjlu@ cjlu. edu. cn
稻米淀粉主要由直链淀粉(amylose)和支链淀粉
(amylopectin)组成。直链淀粉是脱水葡萄糖苷元通过
α-D-1，4 糖苷键连接而成的线性长链。支链淀粉除有
α-D-1，4 糖苷键外，约每 20 ～ 30 个脱水葡萄糠苷元就
有一个分支;该分支在淀粉分支酶的作用下通过 α-D-
1，6 糖苷键连接而成，最后由淀粉去分支酶(starch
debranching enzyme)对分支进行修饰，最终合成具有
一定 结 构 和 功 能 的 支 链 淀 粉［1］。异 淀 粉 酶 1
(Isoamylase 1，ISA1)属于淀粉去分支酶中的一类，它
以变性支链淀粉、糖原和支链淀粉类似物为底物，去除
α-D-1，6 糖苷键，参与支链淀粉的合成，影响了直链淀
粉和支链淀粉在淀粉中的比例［2］。
大麦(Hordeum vulgare)中的 SUSIBA2 属于 WRKY
蛋白，可作为一种转录激活剂在糖信号转导途径中结
合 ISA1 启动子区域内的 W-box 和糖应急元件 SURE
(A /T rich element)，上调淀粉去分支酶的表达［3］。水
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3 期 水稻 SUSIBA2-like 基因的克隆与分析
稻中未见 SUSIBA2 的确切报道［3，4］。本研究通过 RT-
PCR 方法从水稻中克隆了 ISA1 和 SUSIBA2-like 的
cDNA 序列，并进行了相关的生物信息学分析，为开展
水稻中 SUSIBA2-like 转录因子对 ISA1 的调控研究奠
定基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
粳 稻 品 种 日 本 晴 (Oryza sativa L. subsp.
Japonica)由浙江大学原子核农业科学研究所提供。
PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。植物
多糖多酚总 RNA 提取试剂盒购自北京 Bioteke 公司;
pGEM-T easy 载体购自 Promega 公司，M-MLV 逆转录
试剂、LA Taq 酶等购自 Takara 公司。其他常规化学试
剂为国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 胚乳总 RNA 的提取及 cDNA 第 1 链的合成
分别收集灌浆后 3 ～ 24d 的胚乳组织及灌浆后 12d 的
根、茎、叶组织，液氮速冻，－ 80℃保存。总 RNA 的提
取参照 Bioteke 公司植物多糖多酚总 RNA 提取试剂盒
说明书，用琼脂糖凝胶和 Nanodrop 检测提取 RNA 纯
度和浓度。完整性和纯度较好的 RNA 样品逆转录合
成 cDNA 第一链。
1. 2. 2 水稻中 SUSIBA2-like 和 ISA1 cDNA 的克隆
根据已发表的水稻 ISA1 基因序列 (GenBank ID:
AB093426)设计引物 IsoaF1 和 IsoaR1，用于扩增包含
全长 ORF 在内的 ISA1 cDNA 序列［5，6］。在 NCBI 数据
库中，用大麦 SUSIBA2 基因全序列 (GenBank ID:
AY323206)进行 BLAST 检索，获得水稻中 SUSIBA2 同
源基因 SUSIBA2-like 序列;以此序列为模板设计引物
SusiLF1 和 SusiLR1，用于扩增含全长 ORF 在内的
SUSIBA2-like cDNA 序列(表 1)。利用 Takara LA PCR
试剂在 25μl 的体系中进行 PCR 反应，反应参数为:
94℃变性 30s，59℃退火 30s，72℃延伸 2min，共扩增 35
个循环。目标片段经切胶回收后连接到 pGEM-T easy
载体，转化后进行测序鉴定。
1. 3 分析测定
1. 3. 1 生物信息学分析 利用 DNAstar 进行序列分
析和同源性比对，基因结构与染色体定位分析采用
Gramene 数据库，核酸和蛋白质序列 BLAST 检索采用
NCBI 数据库。蛋白质三维空间结构的同源建模通过
Swiss-Model 实现［7］。
1. 3. 2 半定量 RT-PCR 分析 利用半定量 RT-PCR
分析 ISA1、SUSIBA2-like 基因在水稻不同组织(叶、根、
茎和胚乳)以及在不同灌浆期的胚乳(灌浆 3 ～ 24d)中
的表达情况。按照上述方法提取各组织的总 RNA，经
DNase I 处理，用 Nanodrop 测定浓度后按前述方法进
行逆转录反应。取等量的逆转录产物分别用引物
ISA1F、ISA1R 和 SU2LF、SU2LR 扩增 ISA1、SUSIBA2-
like 基因片段，扩增子长度分别为 212 和 150bp。选取
eEF-1a 为内参基因［8 ］，eEF-1aF、eEF-1aR 为引物(见
表 1)，扩增子长度为 103bp。RT-PCR 反应程序为:
94℃预变性 4min;94℃变性 30s，56℃退火 30s;72℃延
伸 20s，30 个循环，72℃延伸 10min。通过 2. 0% 琼脂
糖凝胶电泳检测 RT-PCR 产物来分析 ISA1、SUSIBA2-
like 基因的时空表达。
表 1 各引物序列汇总
Table 1 Summary of all primers
基因名称 gene name 登录号 accession No. 引物序列 primer sequences
eEF-1a AK061464 eEF-1aF:5’-TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT-3’
eEF-1aR:5’-GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA-3’
ISA1 AB093426 ISA1F:5’-CGGGTACAGGTTCGATGGTATGTT-3’
ISA1R:5’-GAGGTAGGTCACCTTGCCAATCAA-3’
IsoaF1:5’-CGATCGGAGATTTCGCAATT-3’
IsoaR1:5’-AGGACCGCACAACTTCAACATA-3’
SUSIBA2-like NM_001066651 SU2LF:5’-AACCGTGAGCCTCGTGTTGTAGT-3’
SU2LR:5’-GACTGGGCATCCTGTATTTGTGC-3’
SusiLF1:5’-GGGCGAGGTACAAGGCGATGT-3’
SusiLR1:5’-TCGCCTCCGGTTCAACTGATGT-3’
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核 农 学 报 24 卷
2 结果
2. 1 胚乳总 RNA 的提取和 ISA1、SUSIBA2-likecDNA
序列的克隆
分离到无降解的、高纯度的总 RNA 是下游试验成
功的关键，本研究分离到的总 RNA 的 OD260 /OD280在
1. 95 左右，OD260在 0. 3 ～ 0. 5 之间，RNA 电泳显示无
明显降解(图 1)。质量合格的总 RNA 用来进行逆转
录反应，以逆转录后的第 1 链 cDNA 为模板，分别以
IsoaF1、IsoaR1 和 SusiLF1、SusiLR1 为引物，PCR 扩增
得到大小为 2400、1800bp 左右特异的预期片段(图
2)。将目标片段连接到 pGEM-Teasy载体，经测序验
图 1 总 RNA 电泳结果
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA
图 2 PCR 克隆水稻 SUSIBA2-like 和 ISA1 基因
Fig. 2 Isolation of SUSIBA2-like and ISA1
gene from rice by PCR
M:DL2000 plus marker;A:cDNA 中扩增的 SUSIBA2-like
产物;B:cDNA 中扩增的 ISA1 产物
M:DL2000 plus marker;A:SUSIBA2-like amplified from
cDNA;B:ISA1 amplified from cDNA
证为目标片段。
2. 2 SUSIBA2-like 序列的生物信息学分析
序 列 分 析 显 示， SUSIBA2-like 基 因 ORF 长
1719bp，共编码 572 个氨基酸。采用 Gramene 数据库
分析 SUSIBA2-like 基因的结构和染色体定位。结果显
示 SUSIBA2-like 基因位于第 7 号染色体(Gene ID:LOC
_Os07g39480)，由 6 个外显子组成(图 3)。
图 3 水稻中 SUSIBA2-like 基因结构
Fig. 3 Structure of SUSIBA2-like gene in rice
折线代表内含子，实心方框代表外显子
The line stands for introns，the solid frame stands for exons
大麦转录因子 SUSIBA2 作为转录激活剂调控着
ISA1 基因的表达［4］。序列比对分析显示水稻中
SUSIBA2 同源基因 SUSIBA2-like 与 SUSIBA2 的氨基酸
同源性为 80. 7%;保守序列功能域预测显示 SUSIBA2-
like 与 SUSIBA2 同为第 1 类 WRKY 转录因子超家族，
具有 2 个保守的 WRKY 结构模体;在保守的 WRKY
结构模体中，仅有 5 个氨基酸残基有差别:SUSIBA2-
like 在 221、229、230、233 和 391 位分别为 D、S、L、Q 和
N，SUSIBA2 对应的位置为 E、A、V、L 和 S;其中，与
WRKY 转录因子的 DNA 结合功能有关的 WRKY
domain 2 只有 1 个氨基酸残基有差别［9］(图 4)。以已
知 DNA 结合域晶体结构的 AtWRKY4(PDB ID:1wj2)
为模型，通过 SWISS-MODEL 对 SUSIBA2 和 SUSIBA2-
like 进行 DNA 结合域三维结构同源建模分析表明，有
4 个氨基酸位点差异的 WRKY domain 1 的三维结构有
轻微差别，只有 1 个氨基酸位点差异的 WRKY domain
2 的 三 维 结 构 相 同;SUSIBA2-like 与 SUSIBA2 在
WRKY 功能域的氨基酸的变化并没有引起功能域在
空间结构上的很大变化(图 5)。
2. 3 ISA1 和 SUSIBA2-like 的表达分析
为了分析 ISA1 和 SUSIBA2-like 的表达模式和初
步探索 SUSIBA2-like 与 ISA1 的表达相关性，采用半定
量 RT-PCR 方法对水稻各个不同器官和在不同灌浆期
的胚乳中 ISA1 和 SUSIAB2-like 基因的表达水平进行
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3 期 水稻 SUSIBA2-like 基因的克隆与分析
图 4 水稻中 SUSIBA2-like 与其同源蛋白 SUSIBA2 的序列比对
Fig. 4 Alignment of SUSIBA2-like in rice and it’s homologous protein SUSIBA2 in barley
图 5 SUSIBA2-like 与 SUSIBA2 WRKY 结构域三维结构建模
Fig. 5 Molecular modeling of SUSIBA2-like and SUSIBA2 protein
A1:SUSIBA2-like WRKY domain 1;A2:SUSIBA2-like WRKY domain 2;B1:SUSIBA2 WRKY domain 1;
B2:SUSIBA2 WRKY domain 2;A1:SUSIBA2-like WRKY 结构域 1;A2:SUSIBA2-like WRKY
结构域 2;B1:SUSIBA2 WRKY 结构域 1;B2:SUSIBA2 WRKY 结构域 2;
了比较分析。结果显示 ISA1 基因在根、茎、叶中不表
达，在胚乳中表达且在灌浆后 12d 表达量达到最高值;
SUSIBA2-like 基因在根中不表达，在茎和叶中有表达，
在胚乳中表达并在灌浆后 12d 达到最高值(图 6)，说
明 ISA1 和 SUSIBA2-like 在胚乳中的表达有一定的正
相关性，这与大麦中 SUSIBA2 与 ISA1 的表达模式非常
相似［3，4］，暗示了 SUSIBA2-like 可能做为转录因子正
向调控 ISA1 的表达。与 SUSIBA2 不同的是 SUSIBA2-
like 在茎部和叶片中也检测到了表达［3］。
3 讨论
淀粉是植物炭源的主要储存形式，是人类的主要
粮食和重要的工业原料，具有重要的经济价值。淀粉
的合成过程受到一系列酶的调控，需要 4 种酶系的协
调催化［10］。但是对这些酶的调控基因还了解很少。
随着水稻等基因组数据的日益丰富和生物信息学技术
的不断发展，可以充分利用生物信息资源，从中发掘与
淀粉合成有关的功能和调控基因，加快淀粉合成和植
物糖信号通路的研究。
淀粉去分支酶是淀粉生物合成过程中的一个重要
调控酶，在支链淀粉的合成中起着重要的作用［11］。水
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Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(3):442 ～ 446
图 6 ISA1 和 SUSIBA2-like 的表达分析
Fig. 6 RT-PCR analysis of the expression pattern of ISA1 and SUSIBA2-like
a1 ～ a3:水稻的叶、根、茎;b1 ～ b5:灌浆 3、6、12、18、24d 的胚乳;eEF1-α:为内参对照
a1 ～ a3:leaf，root，stem tissues of the rice;b1 ～ b5:the endosperms at 3，6，12，18，24 days after
grouting;eEF1-α :internal comparison
稻中还没有发现淀粉去分支酶 ISA1 的相关转录调控
因子。为此，我们利用生物信息学方法结合 RT-PCR
从水稻中克隆到了 1 个 ISA1 可能的转录 因 子
SUSIBA2-like。生物信息学分析显示，SUSIAB2-like 与
SUSIBA2 的序列具有很高的同源性，进化上的亲缘关
系也很近，三维结构也十分相似。进一步 RT-PCR 研
究发现，SUSIBA2-like 与 SUSIBA2 在胚乳中的表达模
式相似，都在灌浆中期的表达量达到最大值，这与
ISA1 基因在灌浆期的表达模式也一致。同时，分析水
稻基因组上 ISA1 上游启动子序列，发现了和 SUSIBA2
能特异结合的 W-box 和 SURE 元件(另文报道)，由此
初步判定 SUSIBA2-like 做为转录激活剂结合到 ISA1
基因上游 W-box 和 SURE 元件来激活 ISA1 基因的表
达。
目前，高等植物已分离鉴定的转录因子有数千种，
其中 WRKY 家族是植物中普遍存在的一类重要转录
因子，广泛参与了包括淀粉代谢在内的多种生命活
动［12 ～ 16］，但在水稻中还未有关于 WRKY 家族基因参
与淀粉代谢或糖信号通路调控的报道。SUSIBA2-like
基因的发现和功能进一步研究对揭示水稻中淀粉合成
相关通路的信号转导调控机制有着重要的意义。
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(下转第 475 页)
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