全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052414203
高效液相色谱法测定大豆中卵磷脂的含量
张德权1 　陈卫涛1 ,2 　张柏林3
(11 中国农业科学院农产品加工研究所 ,北京　100094 ; 21 河北农业大学食品科技学院 ,河北 保定　071001 ;
31 北京林业大学生物科技学院 ,北京　100083)
摘 　要 :应用高效液相色谱法 (HPLC) ,选用 Kromasil SIL 柱 ,以甲醇Π异丙醇Π正己烷 (60Π35Π5 ,VΠV) 为流动
相 ,采用紫外检测器 (205nm)对卵磷脂进行了测定。结果表明 ,大豆卵磷脂的保留时间为 261035min ,定
量线性范围 2106～3019μg(r = 019999) ,精密度和稳定性实验相对标准偏差均小于 5 % ,加样回收率达
97141 % ,表明建立的大豆卵磷脂检测方法灵敏度高、稳定性和重现性好。
关键词 :高效液相色谱 (HPLC) ;卵磷脂 ;大豆
DETECTION OF SOYBEAN PHOSPHATIDYLCHOLINES WITH HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY
ZHANG De2quan1 　CHEN Wei2tao1 ,2 　ZHANG Bo2lin3
(1 Institute of Agro2Food Science and Technology , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100094 ; 2 College of Food Science and Technology ,
Hebei Agriculture University , Baoding , Hebei 　071001 ; 3 College of Biology Science and Technology , Beijing Forestry University , Beijing 　100083)
Abstract :The determination of soybean phosphatidylcholines using high2performance liquid chromatography at 205nm was
investigated. The phosphatidylcholines was separated very well by the mobile phase of methanolΠ22propanolΠn2hexane (60Π35Π
5 ,VΠV) on the Kromasil SIL column. The results showed that : the retention time of soybean phosphatidylcholines is 261035
min , the linear range is 2106～3019μg(r = 019999) . The relative standard deviation (RSD) of reproducibility and stability
experiments was lower than 5 % and the average recovery rate of phosphatidylcholines is 97141 % , indicating that the method
was a simple and fast method with more accuracy and reproduciblity to detect phosphatidylcholines.
Key words :high2performance liquid chromatography ; phosphatidylcholines ; soybean
收稿日期 :2006204205
基金项目 :中国农业科学院杰出人才基金
作者简介 :张德权 (19722) ,男 ,河南信阳人 ,副研究员 ,主要从事农产品加工与标准研究。Email :dqzhang0118 @1261com　　磷脂是生命的基础物质 ,一方面它存在于人体的每一个细胞中 ,是脑组织及神经组织细胞膜、线粒体膜、核膜等的主要成分 ,是制备脂质体 (Liposome) 的主要膜材 ,在生物体内降解 ,无毒性、无免疫原性的特点 ,同时也是一类天然的表面活性剂 ,可应用于食品、医药、饲料和化妆品等领域[1 ,2 ] 。从来源上分 ,磷脂主要有蛋黄磷脂和大豆磷脂 ;从组成上分 ,主要包括鞘磷脂(神经磷脂)和甘油醇磷脂。其中甘油醇磷脂分布最为广 泛 , 主 要 包 括 卵 磷 脂 ( 磷 脂 酰 胆 碱 ,phosphatidylcholines ,简称 PC) 、脑磷脂 (磷脂酰乙醇胺 ,phosphatidylethanolamines ,简称 PE) 、肌醇磷脂 (磷脂酰 肌醇 ,phosphatidylinostols ,简称 PI) 和丝氨酸磷脂 (磷脂酰丝氨酸 ,phosphatidylserines ,简称 PS)等。近年来随着脂质体技术的发展 ,高纯度、性质稳定的磷脂类化合物越来越受到重视 ,尤其高纯度卵磷脂 (制备脂质体的主要原料)更是关注的热点。大豆中含有丰富的卵磷脂 ,是提取卵磷脂的重要来源[3 ] 。为精确衡量卵磷脂提取方法和脂质体制备方法的优劣 ,及时掌握原料及产品中卵磷脂的含量 ,建立高效、快速的卵磷脂检测方法至关重要。目前卵磷脂的检测方法主要有定磷法[4 ] 、薄层层析法 ( TLC) [5 ] 和高效液相色谱法 ( HPLC) [6～8 ] 等。定磷法需要消化、显色等过程 ,操作繁琐、耗时。薄层
414　 核 农 学 报　2006 ,20 (5) :414～416Journal of Nuclear Agricultural Sciences
扫描法干扰因素多 ,灵敏度不高 ,喷雾显色后定量误差
较大而主要用于定性分析。高效液相色谱法以其高
速、高效、高灵敏度、系统密闭避免不饱和键氧化等优
点 ,受到普遍关注 ,一些学者分别利用常规洗脱和梯度
洗脱方式对卵磷脂进行分离 ,并采用紫外和 ELSD 检
测器进行检测 ,但在已发表的文献中均存在洗脱程序
复杂、操作繁琐、磷脂各组分分离效果差等缺点。本文
在前人研究的基础上 ,采用改进的 HPLC 法对大豆中
的卵磷脂进行了检测 ,取得了较好的分离效果。
1 　材料与方法
111 　仪器与试剂
Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪 (安捷伦公
司) , 紫外检测器 ( UV , 安捷伦公司 ) , 泵 ( G1311A
QuatPump) ,自动进样器 ( G1313A ALS) ,卵磷脂标准品
(Sigma 公司 , 编号 P74432100MG 113K5214 800224325 ,
纯度 9915 %) ,甲醇、异丙醇、正己烷 (色谱纯 ,美国
Fisher 公司) 。
112 　标准溶液配制
准确称取卵磷脂标准品 10130mg ,置于 5ml 的容量
瓶中 ,用甲醇定容 ,配成卵磷脂含量为 2106mgΠml 的标
准溶液 , - 18 ℃贮藏待用。
113 　样品液制备
采用柱层析法[9 ] :称取约 20g 的大豆粉 (60 目) ,精
确至 01001g ,置于圆底烧瓶中 ,加入氯仿Π甲醇 (VΠV = 2
∶1) 混合溶液 160ml , 于磁力搅拌器上搅拌 60min
(40 ℃) ,布氏漏斗过滤 ,将滤液在旋转蒸发仪上浓缩至
少许溶剂时 (55 ℃) ,取下加入少量饱和 NaCl 溶液 ,剧
烈摇动数秒后离心分离 (10min ,3000rΠmin) ,取下层溶
液再次减压浓缩 ,制得粗大豆油。将粗大豆油进行层
析分离 ,依次使用丙酮 (70ml) 、氯仿Π甲醇 (3∶1 ,VΠV ;
60ml) 、甲醇 (150ml) 进行洗脱 ,收集后两种洗脱液合
并 ,减压浓缩至少许溶液时 ,用甲醇溶解并定容到
100ml 容量瓶中 ,制成样品液 , - 18 ℃贮藏待用。
114 　色谱条件
色谱柱 : Kromasil SIL 柱 , 5μm 填料粒度 , 250 ×
416mm ;流动相 :甲醇Π异丙醇Π正己烷 (60Π35Π5) ;流速 :
018mlΠmin ;检测波长 :205nm ;柱温 :2918 ℃。
2 　结果与分析
211 　最佳检测波长的选择
取卵磷脂标准溶液在 190～600nm 范围内进行紫
外光谱扫描 ,结果表明 ,在 205nm 处有一最大吸收峰
(图 1) ,因此确定检测波长为 205nm。
图 1 　卵磷脂的紫外吸收光谱图
Fig. 1 　UV absorption spectrogram of standard
phosphatidylcholines (PC)
212 　流动相的选择
据文献[10 ]可知 ,分离卵磷脂大多选用正相色谱
柱 ,常规或梯度洗脱 ,其所用的流动相体系主要有甲醇2乙腈2水和正己烷2异丙醇2磷酸。本实验对以上两类
流动相分别进行了测试。前者对卵磷脂的保留时间过
短 ,样品中的多种磷脂成分不能得到有效分离 ;后者虽
能分离卵磷脂成分 ,但峰形严重拖尾 ,很难达到满意的
分离程度。经反复试验 ,最终选用甲醇Π异丙醇Π正己
烷作流动相 ,并对其配比进行了研究 ,当甲醇Π异丙醇Π
正己烷 = 60Π35Π5 (VΠV) 时 ,样品中的卵磷脂得到了较
好分离 (图 2) ,保留时间为 261035min ,相对标准偏差
为 1132 %。
图 2 　标准品和样品中卵磷脂色谱图
Fig. 2 　HPLC chromatogram of standard PC and
PC sample
213 　标准曲线的绘制
准确吸取卵磷脂标准液 110、210、510、1010、1510μl
分别进样 ,按 114 色谱条件进行分析测定 ,以卵磷脂进
样量为纵坐标 ,峰面积积分值为横坐标 ,绘制标准曲
线 ,计算得回归方程为 : Y = 010017 X - 011679 ( r =
019999) ,表明卵磷脂在 2106～3019μg 范围内呈现良好
的线性关系。
514　5 期 高效液相色谱法测定大豆中卵磷脂的含量
214 　精密度和重复性试验
准确吸取 5μl 标准溶液 ,于上述色谱条件下重复
进样 5 次 ,分析测定卵磷脂的含量 ,并记录保留时间 ,
进行统计分析 ,结果见表 1 ,保留时间及卵磷脂含量的
RSD 均在 5 %以下 ,表明本实验具有良好的重现性 ,色
谱条件合理。
表 1 　标准溶液中卵磷脂测定的重复性
Table 1 　Detection reproducibility of standard PC
项目 item 保留时间
retention time
卵磷脂含量
content of PC
测定平均值 average value 261035min 9198μg
标准差 SD 0134 0121
相对标准偏差 relative SD( %) 1132 2113
Note : SD :standard deviation. The same as following table.
215 　稳定性试验
分别精确吸取 5μl 卵磷脂标准液和卵磷脂样品稀
释液 (样品液稀释 20 倍) ,于上述色谱条件下每 1h 进
样 1 次 ,共 5 次 ,分析测定卵磷脂含量 ,结果见表 2 ,标
准液与样品稀释液中卵磷脂的含量的 RSD 均在 5 %以
下 ,表明卵磷脂在 5h 内测定结果稳定。
表 2 　标准液和样品液中卵磷脂在 5h 内检测的稳定性
Table 2 　Detection stability of standard PC
and PC samples in 5 hours
项目 item 标准液
standard solution
样品稀释液
dilutesolution of sample
测定平均值 average value 21027mgΠml 01627mgΠml
标准差 SD 01018 010049
相对标准偏差 relative SD( %) 0191 0179
216 　加样回收率试验
准确称取大豆粉 20g (卵磷脂含量为 3121450mgΠ
100g) ,精确至 01001g ,准确加入卵磷脂标准溶液 015ml
(2106mgΠml) ,按 113 样品液制备方法制备供试液 ,准
确吸取供试液 5μl ,依 114 色谱条件进样 6 次 ,重复测
定 ,计算样品加样回收率 ,结果见表 3。
表 3 　卵磷脂加样回收率测定结果
Table 3 　Recovery of PC samples
加入量
added PC
(mg)
测得量
recovered PC
(mg)
回收率
recovery rate
( %)
平均值
average
( %)
标准差
SD
相对标准差
relative SD
( %)
1103 01989 96103
1103 11007 97177
1103 11020 99109 97141 2148 2154
1103 01968 93198
1103 01997 96177
1103 11039 100184
217 　样品测定
分别精确吸取 5 种大豆样品液 (8828 ,强丰 818 ,鑫
豆一号 ,台湾 819 ,美豆一号)各 5μl ,依 114 色谱条件进
样 ,分析测定卵磷脂的含量 ,结果见表 4。
表 4 　不同样品中卵磷脂含量的测定结果
Table 1 　The PC contents in different samples
样品 sample 卵磷脂含量
content of PC( ‰)
相对标准差
relative SD( %)
8828 5156 1125
强丰 818 Qiangfeng 818 4159 2121
鑫豆一号 Xindou No. 1 4156 1178
台湾 819 Taiwan 819 3124 1196
美豆一号 Meidou No. 1 6184 2117
3 　结论
本试验采用高效液相色谱法2紫外检测器建立了
卵磷脂的 HPLC 快速检测方法 ,并对该方法进行了验
证 ,标准曲线在 2106～3019μg 范围内线性关系良好。
利用该方法对不同品种的大豆进行了检测 ,结果表明 ,
“美豆一号”中卵磷脂含量最高 ,为 6184 ‰,“台湾 819”
最低 ,为 3124 ‰。该方法灵敏度高 ,操作简便、快速 ,
可广泛应用于卵磷脂的测定 ,并为磷脂的质量评价 ,磷
脂中主要成分 ,卵磷脂的含量测定及杂质检查提供了
可靠的依据。
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