全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):502 ～ 506
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0502-05
土三七不定芽直接发生与遗传稳定性的 RAPD分析
岑举人 步怀宇 张来军 王英娟 毕彦博 贾敬芬
(西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，陕西 西安 710069)
摘 要:以土三七叶片为外植体，在 MS + 6-BA 2mg /L + NAA 1mg /L 培养基上直接生成不定芽，经 MS +
IBA 0. 2mg /L 培养基诱导生根，多次继代培养、移栽，建立了土三七不定芽植株再生体系。用 RAPD 分
析了野生土三七、连续 3 次继代试管苗和移栽苗的遗传稳定性。结果显示:用选取的 20 条随机引物共
扩增出清晰的 88 个条带，条带数在 2 ～ 8 条之间，平均 4. 4 条。不同植株扩增获得的条带数目和带型一
致，表明在所检测范围内继代培养和移栽未影响土三七 DNA 序列。所建立的直接再生程序可用于土
三七试管苗大量生产。
关键词:土三七;不定芽直接发生;遗传稳定;RAPD
DIRECT ORGANOGENESIS OF ADVENTITIOUS BUDS OF Sedum aizoon L. AND ANALYSIS OF
GENETIC STABILITY IN REGENRATED PLANTLETS BY RAPD
CEN Ju-ren BU Huai-yu ZHANG lai-jun Wang Ying-juan Bi Yan-bo JIA Jing-fen
(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China，Northwest University，
Ministry of Education，Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology，Xi’an，Shaanxi 710069)
Abstract:Leaf segments of Sedum Aizoon L. were cultured on MS medium supplemented with 2mg /L 6-BA and 1mg /L
NAA. A few of adventitious buds were induced from incision of leaves explants，and regenerated shoots were rooted and
subcultured on MS medium with 0. 2mg /L IBA. Random amplified polymorphic DNA (RAPD)markers were used to
assess the genetic stability of regenerated plantlets. The 20 arbitrary primers used in this analysis yielded 88 scoreable
bands with an average of 4. 4 bands per primer. These 88 bands were monomorphic with identical bands at DNA level
among all shoots from the regenerated plantlets， transplants and control plants of Sedum aizoon L. The results
demonstrated that high-efficient direct organogenesis and regeneration system might be used for micropropogation of
Sedum aizoo L.
Key words:Sedum aizoon L.;direct organogenesis;genetic stability;RAPD
收稿日期:2009-09-25 接受日期:2009-12-04
基金项目:国家自然科学基金(30970308)，陕西省教育厅基金(09JS080，09JK775)
作者简介:岑举人(1984-)，男，海南澄迈人，硕土研究生，从事药用植物细胞工程研究。E-mail:cen67486379@ 163. com
通讯作者:步怀宇(1972-)，女，河北保定人，副教授，从事植物分子生物学及遗传转化工作。E-mail:buhy@ nwu. edu. cn
土三七(Sedum aizoon L. )为景天科景天属药食
两用植物，别名景天三七、费菜、养心草、吐血草等，具
有凉血止血，散淤消炎、安神、镇痛等作用［1，2 ］。近年
发现土三七可以降血脂和降血压，开发其成为心血管
方面的药物以及保健类产品，具有良好的市场前
景［3］。
芮和恺等［4］以土三七嫩叶产生愈伤组织，通过器
官发生形成完整植株;罗林会等［5］以土三七去叶后只
带 1 个节的嫩枝茎段，诱导腋芽萌动后生成小苗的方
法，实现了离体快速繁殖;何碧株等［6］以土三七顶芽
和带节的饱满茎段，诱导顶芽和腋芽形成小苗，建立
了离体快速繁殖体系，但以顶芽或腋牙诱导完整植株
数量有限。目前未见以土三七叶片为外植体的不定芽
直接发生方式的报道。
205
3 期 土三七不定芽直接发生与遗传稳定性的 RAPD 分析
本试验以土三七叶片为材料，通过不定芽发生途
径获得再生植株，并用 RAPD 方法进行了野生植株、组
培苗和移裁苗等不同植株的遗传稳定性分析，以期为
土三七快繁技术及工厂化实用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
土三七植株采自西北大学生物园，选取幼嫩的叶
片为外植体。
1. 2 方法
将叶片消毒后，接种于 MS + 6-BA 2mg /L + NAA
1mg /L 培养基上诱导生芽。待芽长至 2 ～ 3cm 时切
下，转移到 MS + IBA 0. 2mg /L 培养基诱导生根，获得
土三七再生植株。在相同培养基中扦插继代培养，炼
苗后移栽于含蛭石 ∶ 腐殖土 ∶ 田园土 = 2 ∶ 1 ∶ 1的盆钵中
培养。
1. 3 RAPD 分析
分别称取野生土三七、连续 3 次继代试管苗(继
代周期 40d)和组培移栽土三七的叶片 0. 5g，采用
CTAB 法提取基因组 DNA［7］。选用购自上海 Sangon 公
司的 40 条随机引物(编号 S21 ～ S40，S101 ～ S120)对
所提取的 DNA 样品进行 RAPD 分析。PCR 反应体系
20μl:10 × Buffer (含 Mg2 + )2μl，dNTP(10mmol /L)
2μl，Primer (10mmol / L)1μl，DNA 模板 20ng，Taq 酶
1U。反应程序为:94℃ 预变性 5min，36℃ 退火 60s，
72℃延伸 90s，5 个循环;94℃变性 50s，36℃退火 50s，
72℃延伸 60s，30 次循环;72℃延伸 10min。扩增产物
经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳，观测结果。
2 结果与分析
2. 1 叶片外植体不定芽的直接发生
将野生土三七叶片消毒后，接种于 MS + 6-BA
2mg /L + NAA 1mg /L 培养基上，培养 5 ～ 7d，在叶片的
表面切口处陆续产生绿色的不定芽芽点，18d 左右，芽
点进一步发育成不定芽(图 1-A)。试验过程中不定芽
均从外植体上直接产生，未经愈伤组织诱导阶段，也未
见其周围有任何小愈伤组织形成，是典型的不定芽发
生方式。
转接到新鲜的上述培养基上的不定芽(丛)大多
数能够健壮生长，较大的无根苗转接于生根培养基 MS
+ IBA 0. 2mg /L 上，约 10d 左右即发出白色不定根，生
成完整植株(图 1 － B)。进而截取长 2 ～ 3cm 长带顶
芽或腋芽的再生植株茎段扦插在相同培养基中生根，
继代培养。
将生长健壮、根系发达的再生植株进行移栽，2 周
后小苗有新叶长出，移栽成活率达 80% 左右，生长状
态良好(图 1-C)。
图 1 土三七不定芽的直接发生过程
Fig. 1 Direct organogenesis of Sedum Aizoon L.
A:叶片直接分生形成不定芽;B:再生植株生根;C:移栽苗
A:adventitious buds induced from leaf segments;B:roots regenerated plantlets;C:transplanted plantlets
2. 2 移载土三七的 RAPD 分析
用 40 条随机引物对移栽土三七苗进行 RAPD 分
析，结果除 S39 引物未能扩增出条带外，其余 39 条随
机引物分别扩增出 2 ～ 9 条条带(见图 2)。选取其中
20 条能扩增出清晰主带的引物进行不同培养材料的
遗传稳定性 RAPD 分析。
2. 3 土三七组培苗的 RAPD 分析
利用选取的 20 条引物对野生土三七、连续 3 次继
代试管苗(继代周期 40d)和经过 3 次继代培养后移栽
的土三七进行 RAPD 分析。结果显示:20 条随机引物
在不同植物材料中扩增带数在 2 ～ 8 条之间，总带数为
88 条，平均 4. 4 条;并且每一引物在不同材料中获得
的扩增带数和带型一致，表明在所检测的范围内继代
培养和移栽未影响土三七 DNA 序列。只在如 S29、
305
核 农 学 报 24 卷
图 2 移载土三七苗不同引物(S21 ～ S40，S101 ～ S120)RAPD 扩增结果
Fig. 2 RAPD amplification from the transplants of Sedum Aizoon L. using different primers
(S21 ～ S40，S101 ～ S120)
S40 等引物得到的扩增条带中，野生土三七谱带带型
亮度与继代试管苗和移栽苗不同，而继代试管苗和移
栽苗间完全保持一致(见图 3)。从 RAPD 分析结果可
以看出，野生土三七经离体再生、移栽培养等过程获得
的再生植株 DNA 水平上基本没有变化，未显示出多态
性。也可见野生土三七组织培养过程中没有引起植物
体细胞无性系的明显变异。
3 讨论
植物离体培养植株再生对于离体快繁和遗传转化
具有重要意义，但组织培养的植株比常规繁殖方法产
生的植株容易产生各种各样的体细胞无性系变
异［8，9］。这些变异与组培过程中愈伤组织的形成和不
定芽体的分化有密切关系［10］。新生器官由愈伤组织
诱导产生的间接器官再生过程中，增加了细胞内染色
体变异的机率，易于导致无性系变异产生。而由植物
组织→拟分生组织→器官原基的直接器官再生过程，
未经愈伤组织直接由体细胞分化成器官，则可降低无
性系变异机率［8，11］。前人报道了土三七叶经愈伤组织
的间接器官发生途径，本试验以土三七叶片为外植体，
不经愈伤组织直接产生不定芽，获得高效稳定的直接
再生体系，理论上可有效降低土三七在培养过程中的
无性系变异的机率，又能在短时间形成大量的植株。
由于体细胞无性系变异的存在，使得鉴定植物再
生培养物的遗传背景，确保生产应用中性状的稳定性
非常重要。RAPD 技术因 DNA 多态性的检出率高，不
需有关 DNA 结构方面的信息，操作简单易行，故而在
植物的亲缘关系研究、遗传多样性评价及检测植物遗
传稳定性等方面得到了广泛应用［12 ～ 14］。本试验利用
RAPD 技术分析了野生土三七、继代试管苗和移栽苗
的遗传稳定性，在检测的范围内继代培养和移栽未引
起土三七 DNA 片段长度多态性和核苷酸序列的变化，
仅见 2 个引物的扩增亮度变化。试验结果表明，组织
培养过程中变异甚微，表现出较高的遗传稳定性，其离
体培养是一种稳定的繁殖方式，这一结果与在油菜、霍
山石斛及松树上的结果相符。也证实通过直接不定芽
发生途径获得再生植株过程是一种使无性系后代保持
原品种遗传特性的繁殖方法［14 ～ 16］。但由于高等植物
的基因组较大，利用少数引物检测的 DNA 序列有限，
可能会导致基因组的 RAPD 位点不能检出;并且
RAPD 技术具有多型性带型不稳定性，试验重复性较
差的缺点，试验结果还可通过 EST-SSR 等遗传标记并
结合细胞学检测进一步确证［17，18］。
405
3 期 土三七不定芽直接发生与遗传稳定性的 RAPD 分析
图 3 土三七不同植株的 RAPD 扩增
Fig. 3 RAPD amplification from the different plants of Sedum. Aizoon L.
1:野生土三七苗;2 ～ 4:继代 1 － 3 次的土三七苗;5:移栽的土三七苗
1:wild control plants;2 ～ 4:regenerated plantlets with different subculturing times;5:transplanted plantlets
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