全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012017203
甘蓝型油菜小孢子离体诱变
———紫外线对小孢子胚状体再生的影响
石淑稳　吴江生　牛勤思
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,湖北 武汉　430070)
摘 　要 :用紫外线对 3 个甘蓝型油菜品系的离体小孢子进行照射 0～60s。未经照射的对照和已照射的小
孢子于 NLN 培养基进行培养 ,诱导胚状体。结果表明 ,照射 20s 和 60s 对胚状体的再生没有影响 ,照射
40s 则有促进作用。
关键词 :甘蓝型油菜 ;紫外线 ;离体诱变 ;小孢子培养
IN VITRO MICROSPORES MUTAGENESIS IN Brassica napus .
———RESPONSE OFMICROSPORE EMBRYOGENESIS TO UV RADIATION
SHI Shu2wen 　WU Jiang2sheng 　NIU Qin2si
( National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan , Hubei 　430070)
Abstract :The isolated microspores from 3 lines of Brassica napus were irradiated with ultraviolet (UV) light for 0～60 seconds
and cultured in NLN medium to induce embryogenesis. The results showed that the treatment of 40s produced higher embryo
yield than those of 0 , 20 and 60s , but no significant difference was found among 4 treatments for embryo yield.
Key words : Brassica napus ; ultraviolet light radiation ; Microspore culture ; in vitro mutation
收稿日期 :2006207220
基金项目 :国家“863”项目 (20042AA241100) ;国家“948”引进项目 (20032Q04) ;创新团队项目 ( IRT0442)
作者简介 :石淑稳 (19492) ,女 ,河北衡水人 ,研究员 ,从事油菜生物技术研究 ,E2mail : shishuwenhe @yahoo. com. cn
　　使用物理和化学诱变剂对农作物进行诱变可提高
变异率 ,创造新的种质材料和改良品种。在油菜中 ,国
内外曾用 X射线 ,γ射线 ,离子束和热中子以及甲基磺
酸乙酯 ( EMS) 等诱变剂方法处理种子 ,分别获得了早
熟、长角果、高含油量、低亚麻酸、低硫苷、低芥酸、高油
酸和抗除草剂等突变体[1～5 ] 。诱变种子的方法简便易
操作 ,但突变体于 M2 代后才能发现和选择。由多基
因控制的性状需要多代自交才能稳定 ,获得突变体的
周期长 ,而且要于田间种植鉴定足够大的群体才能获
得。因此用地多、用工多、费用高 ,效率低。
20 世纪 80 年代油菜组织培养技术建立后 ,离体
诱变研究备受注目。一些学者用 EMS、快中子和 NaN3
等诱变剂处理甘蓝型油菜叶片和花茎再生的悬浮细胞
或愈伤组织和小孢子胚产生的胚性培养物或二倍体和
单倍体茎尖 , 获得了矮杆、抗黑胫病和菌核病材
料[6～9 ] 。Ahmad 等[10 ]用紫外线 ,Swanson 等[11 ] 用γ射线
和乙2基亚硝基脲分别诱变甘蓝型油菜小孢子获得了
耐除草剂和黑斑病材料。Barro 等[12 ] 用 EMS 和紫外线
诱变埃塞俄比亚芥小孢子使再生植株的种子芥酸和硫
苷含量变异很大。和江明等[13 ] 用 EMS 诱变甘蓝型小
孢子获得高油酸材料。诱变离体小孢子比诱变种子和
其他二倍体、单倍体多细胞培养物效率高。因为小孢
子 (不成熟的花粉) 具有单倍体和单细胞特性 ,且群体
大 ,诱变后产生的突变体不会出现嵌合体。经人工染
色体加倍后再生的双单倍体植株中的突变基因是纯合
的 ,后代不再分离 ,隐性突变基因于当代能表达 ,选择。
而在杂合二倍体背景下 ,有关突变性状尤其是多基因
和隐性基因控制的性状需要多代自交才能纯合 ,而且
隐性突变基因易丢失。可见 ,小孢子是非常理想的诱
变材料。用紫外线诱变小孢子比用化学诱变剂操作安
全、简便 ,不污染环境。该研究国内至今未见报道。我
71　核 农 学 报　2007 ,21 (1) :17～19Journal of Nuclear Agricultural Sciences
们用紫外线照射分离出来的甘蓝型油菜小孢子 ,研究
了紫外线对其胚状体再生的影响和小孢子对紫外线的
抗耐特性 ,旨在建立油菜小孢子离体诱变系统。
1 　材料和方法
111 　材料
供试材料为甘蓝型油菜品系 200520001、200127212
和 200422159 的离体小孢子。
112 　方法
在花期 ,从田间生长的油菜植株中选取小孢子发
育到单核晚期至 2 核早期的花蕾 ,用 70 %乙醇和
011 %HgCL2 进行表面灭菌后 ,用玻棒捣碎 ,加 B5 液体
培养基 ,用孔径 40μm 的尼龙网过滤 ,除去萼片和花瓣
等碎片。将含小孢子的滤液离心 3 次 (800rΠmin) ,以弃
除体细胞组织 ,纯化小孢子[14 ] 。纯化的小孢子悬浮在
含有 70mgΠL 秋水仙碱的 NLN 培养基中 ,并分装到直
径 610cm 的培养皿里。然后在超净工作台上 ,把含小
孢子的培养皿放在距离紫外灯管 (30W ,波长 25317nm)
34cm处 ,打开盖子 ,分别照射 20 ,40 和 60s 后 ,盖上皿
盖 ,用石腊封膜封口 ,放入 32 ℃的培养箱培养 50h 后 ,
把培养皿中的培养物转入离心管离心 ,去上清液 (即含
秋水仙碱的培养液) ,将沉淀的小孢子移入加有 NLN
培养基的培养皿中 25 ℃暗培养 ,诱导胚状体。每处理
取 20 个蕾以上 ,仅 200127212 每处理取 40 个蕾 ,均重
复 3 次。由于污染 ,200520001 和 200127212 仅获得 1
次重复的完整数据。不照射的小孢子作为对照。
113 　观察和统计分析
小孢子培养 7d 时 ,于倒置显微镜下观察 20052
0001 品系小孢子分裂状况 ,每处理观察 4 皿 ,每皿 12
个视野 (约 650～900 个小孢子) ,统计各处理的小孢子
分裂比率。培养至 21d 后 ,统计 3 个品系各处理的胚
状体再生数量 ,对 200422159 品系进行了方差分析。
2 　结果与分析
211 　紫外线对小孢子细胞分裂的影响
在紫外线处理第 7 天时 ,200520001 品系中的小孢
子有的进行了第 1 次分裂 ,有的进行了第 2 次或第 3
次分裂 ,形成了 2～8 个细胞的原胚。对照和照射 20s
的处理分裂细胞比率相近 ,分别为 6113 %和 5181 % ,
照射 40 和 60s 的处理分别为 6172 %和 5112 % (表 1) ,
60s 的处理细胞分裂率最低。但各处理间差异不显著
( F = 0111 < F0105 = 8174) ,且畸形胚很少见。
表 1 　紫外线对甘蓝型油菜小孢子分裂和胚状体再生的影响
Table 1 　Effects of UV light on division and embryogenesis
of microspores isolated from Brassica napus
材料
materials
时间
treated time
(s)
花蕾数
No of
Buds
胚数
No of
embryos
胚数Π每蕾
No. embryosΠ
per bud
分裂小孢子
divided
microspores( %)
200520001 0 20 225 11125 6113 ±0114
20 20 208 1014 5181 ±0108
40 20 776 3818 6172 ±0136
60 18 251 13194 5112 ±0127
200127212 0 40 12 013
20 40 26 0165
40 40 64 116
60 40 10 01253 200422159 0 74 83 1112
20 91 97 1107
40 123 237 1193
60 95 137 1144
注 :每蕾胚状体数是 3 次重复的平均值。
Note :embryo number of per bud in 4 treatments is the mean of 3 replicates.
212 　紫外线对小孢子胚状体再生的影响
从表 1 可以看出 ,不同时间的紫外线照射中 ,40s
处理的出胚率最高 ,在 3 个品系中 ,每个花蕾出胚数分
别为 3818、116 和 1193 个。其他处理的出胚率在每个
品系中相近。与对照相比 ,照射 40s 对小孢子胚的再
生有一定的促进作用 (图 1) 。在 200520001 品系中 ,照
射 60s 的处理小孢子分裂比率 ( 5112 %) 比对照
(6114 %)低 ,似乎对细胞分裂有抑制作用 ,但该处理出
胚率却略高于对照。200422159 品系每个处理的胚状
体数是 3 次重复的平均值。4 个处理的出胚量平均在
1107～1193 之间 ,各处理间产胚量差异不显著 ( F =
6135 < F0105 = 8184) 。
关于不同的基因型对紫外线照射的反应 ,3 个品
系的产胚量有差异 ,尤其是 200520001 品系 ,每蕾的产
胚量显著高于 200127212 和 200422159。但 3 个品系中
60s 处理的产胚量均与各自的对照相近 ,表明品系间
产胚量的差异显示的可能是不同的胚胎再生能力而不
是对紫外线的反应。
3 　讨论
前人一般通过小孢子分裂数和小孢子胚产量来推
断紫外线诱变小孢子的半致死剂量 (LD50 ) 和适宜照射
时间。Ahmad 等[10 ]报道 ,用紫外线处理甘蓝型油菜小
孢子 20s 可以使 50 %小孢子致死。Mikami 等[15 ] 认为
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图 1 　200422159 品系小孢子经 UV 照射后再生的胚状体
Fig. 1 　The embryos regenerated from irradiated microspores with UV in line 200422159 :
1 :0 s 处理 ;2 :20 s 处理 ; 3 :40 s 处理 ;4 :60 s 处理
1 : 0 s treatment ;2 : 20 s treatment ; 3 : 40 s treatment ;4 : 60 s treatment
达到 LD50 需要 40s , CegieLska2Taras 等[17 ] 的报道则需
7s ,获得较高的变异率是 10s。Barro 等[12 ] 用紫外线照
射埃塞俄比亚芥小孢子 8min 达到 LD50 。本试验用紫
外线照射甘蓝型油菜小孢子长达 60s ,对小孢子的分裂
和胚状体再生基本无明显的阻碍作用。上述试验结果
产生的不同结论可能与各研究者所使用的紫外光强度
和小孢子离紫外灯的距离不同有关。Ahmad 等使用了
15W 紫外灯管 ,小孢子距离灯管 20cm ;Cegielsk2Taras 等
则采用了 30W 紫外灯管 ,小孢子离光源 25cm。前者
LD50是 20s ,后者是 7s。本试验采用 30W 紫外灯管 ,小
孢子距离灯管 34cm。小孢子离紫外光源较远 ,照射强
度弱可能是紫外线对小孢子分裂和胚再生没产生显著
抑制作用的原因之一。因此 UV 对甘蓝型油菜小孢子
的有效诱变剂量仍需进一步研究。另外 ,本试验通过
紫外线照射小孢子获得的再生植株是否产生形态变
异 ,将于田间进行鉴定 ,其种子中的硫苷和脂肪酸组分
含量将用液相和气相色谱进行分析 ,以研究 UV 对甘
蓝型油菜的诱变效应。
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91Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (1) :17～19
图 3 　自交后代出现极长与极短黄瓜类型 图 4 　自交后代瓜形分离情况
表 3 　特小形黄瓜自交系与对照的比较
自交系 单瓜重(g)
瓜长
(cm)
瓜型
指数
雌花节率
( %)
每节雌
花数
CHA032102222 50 813 2174 9915 2～3
CK 140 1910 6133 100 1
　　自交系材料 CHA03210 搭载后当代即表现出变异 ,
如自封顶及叶片明显变大、叶色明显偏深、叶脉突出、
叶形多样等。但自交 1 代后 ,这些变异均消失 ,说明这
些变异为生理性或机械损伤所致。遗传性变异应在自
交后代中表现出来。
本项目搭载的材料为纯化的自交系 ,从卫星搭载
后代中通过自交、分离、纯化 ,获得特小型黄瓜自交系
CHA032102222 ,株系内瓜形一致 ,瓜长 8cm 左右 ,雌花
节率达 9915 % ,表现稳定 ,且初花期比对照提早 8d。
可直接用于培育特小型黄瓜新品种 ,以满足不同需求。
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