全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 032186205
凤凰山牡丹药用器官的愈伤组织培养
时侠清　张子学
(安徽科技学院 , 安徽 凤阳　233100)
摘 　要 :本文采用植物组织培养的方法 ,在 MS 培养基中加入不同的植物生长调节剂 ,以牡丹根
韧皮部为材料诱导愈伤组织 ,并在不同温、光条件下继代培养 30d ,测定愈伤组织的生长情况
和丹皮酚含量。研究结果表明 ,在 MS 培养基中加入 110mgΠL 2 ,4 - D 或 115mgΠL NAA ,愈伤组
织的诱导率大于 70 % ;培养基中加入 110mgΠL 2 ,4 - D 和 510 ×10 - 6 mgΠL TDZ、或 115mgΠL NAA
和 510 ×10 - 3 mgΠL TDZ ,并在 29 ℃、黑暗条件下继代培养 ,可以显著提高牡丹根皮愈伤组织的增
长倍数和丹皮酚含量。
关键词 :牡丹 ; 药用器官 ; 愈伤组织培养 ; 增长倍数 ; 丹皮酚
CALLUS CULTURE OF PEONY ( FENGHUANG MOUNTAINS) MEDICINE ORGAN
SHI Xia2qing 　ZHANG Zi2xue
( Anhui Science Technology University , Fengyang , Anhui 　233100)
Abstract :Callus were induced with peony root phloem as explants and callus subculture were conducted on MS
adding different plant growth regulators , growth results and paeonol content of subculture callus were determined at
different light and temperature conditions for 30d. The results showed that the induced rate of callus was over 70 %
on MS adding 2 ,42D(110mgΠL)or NAA(115mgΠL) , and the increased times and paeonol content of callus increased
remarkably on MS adding 2 ,42D (110mgΠL) + TDZ (510 ×10 - 6 mgΠL) or NAA (115mgΠL) + TDZ (510 ×10 - 3
mgΠL) under the condition of 29 ℃in dark.
Key words :peony( Paconia ostii) ; medicine organ ; callus culture ; increased times ; paeonol
收稿日期 :2005202218
基金项目 :安徽省科技厅十五攻关专项 (01803003)和科技厅项目 (04023069)
作者简介 :时侠清 (1957 - ) ,男 ,安徽泗县人 ,副教授 ,主要从事作物种子生产和植物快繁的教学科研工作。电话 : 0550 6733118 ,
Email : xiaqingshi @yahoo. com. cn
牡丹为毛莨科 ( Paeonia saff ruticosa Andr. )木本植物 ,分观赏和药用两类。药用牡丹的有效部分是根
皮 ,俗称丹皮。丹皮是中医临床上的常用药材 ,主要的药用成份是丹皮酚 ,它具有抗菌、降压、抗血栓和
抗动脉硬化等作用 ,主治热病吐血、血瘀、经痛、跌打瘀血作痛、高血压和中风[1 ] 。安徽凤凰山牡丹丹皮
厚 ,是药用牡丹的优良品种 ,但采用传统的方法生产周期长、产量低。随着技术的进步 ,国内在人参、西
洋参、红豆杉、银杏、丹参和栝楼等 10 多种药用植物上 ,已通过细胞或组织培养的方法建立或开始建立
次生代谢物工厂化生产体系[2～9 ] ,但牡丹药用器官组织培养的研究目前尚无报道。本文以安徽凤凰山
牡丹 (凤丹)为材料 ,对生长调节剂种类及其水平和温光因素对牡丹愈伤组织的影响进行研究 ,以期为牡
丹药用器官的工厂化生产奠定理论基础。
681　 核 农 学 报　2005 ,19 (3) :186～190Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1 　材料与方法
111 　材料
试验材料为一年生凤丹 ( Paconia ostii)实生苗主根韧皮组织。
112 　试验方法
11211 　单一生长调节剂处理　选取健壮无病凤丹实生苗主根 ,在自来水下冲洗干净 ,用吸水纸吸去水
分 ,在超净工作台上用 75 %的酒精消毒 30s ,然后用 011 %的升汞消毒 12min、无菌水漂洗 3～4 次 ,再用
解剖刀取其韧皮部 ,切块 015cm ×0135cm (约 013g) ,分别接种到含有 011、015、110 和 210mgΠL 的 2 ,42D
(2 ,42二氯苯氧乙酸 )或 014、110、210 和 410mgΠL NAA(萘乙酸)的MS 培养基上。每个处理接种 15 瓶 ,在
23 ±2 ℃条件下进行初代培养 ,第 30 天统计诱导率。
11212 　单一生长调节剂与温度处理 　继代培养仍以 MS 为基本培养基 ,分别加入 011、015、110、210 和
310mgΠL 2 ,42D 和 015、110、115 和 210mgΠL NAA 并结合温度处理 ,进行暗培养。温度处理分别为 20 ℃、
23 ℃、26 ℃、29 ℃和 32 ℃。接种的愈伤组织每块 013g 左右。每个处理接种 15 瓶 ,第 30 天统计诱导率。
11213 　复合生长调节剂与光照处理　在单一生长调节剂初代培养研究的基础上 ,添加 2 ,42D 110mgΠL
或 NAA 115mgΠL 并分别与不同浓度的 BA(62苄基腺嘌呤)或 TDZ ( N2苯基2N2[1 ,2 ,32噻二唑基 ]25 脲) 进
行激素复合处理。其中BA 浓度分别为 :0105、0110、0120 和 0140mgΠL ;TDZ浓度为 :5 ×10- 6 、5 ×10 - 5 、5 ×
10 - 4和 5 ×10 - 3 mgΠL。将丹皮愈伤组织接种到上述培养基中 ,每处理 12 瓶 ,每瓶 2 块 ,每块 013g 左右。
在 28 ℃下分别进行暗培养和光周期为 12hΠd 的光培养 (光强 4000lx ,以下称光照培养) ,第 30 天测定培养
物的重量和丹皮酚含量。
11214 　丹皮酚测定方法　将愈伤组织烘干研碎 ,过 60 目筛 ,用 95 %乙醇于 45 ℃水浴中浸提 115h ,提取
液过滤后用紫外分光光度计 (UV2754 型) 测 A272nm值。同时以原植物即商品凤丹皮作对照 ,用标准丹皮
酚 (中国药品生物制品鉴定所 ,纯度 98. 0 %)制作标准曲线。每个样品重复测定 3 次。
11215 　生长分析方法　愈伤组织生长用增长倍数表示 :增长倍数 = (样品鲜重 - 接种块鲜重)Π接种块
鲜重。培养 30d ,收集不同处理培养基上的愈伤组织称取鲜重 ,然后在 50 ℃恒温下烘干至恒重并称量干
重 ,计算鲜重与干重之比 (即鲜干比)和愈伤组织增长倍数。
11216 　综合值　选择合适的培养方式应考虑愈伤组织的增长倍数、鲜干比和丹皮酚含量等综合因素 ,
本文以综合值表示。计算方法为 :综合值 = 愈伤组织增长倍数 ×丹皮酚含量 ×10Π鲜干比。
2 　结果与分析
211 　牡丹愈伤组织的诱导
在MS 培养基中添加 2 ,42D ,随着浓度的增加 ,愈伤组织的诱导率呈上升趋势。当 2 ,42D 浓度为
110mgΠL 时 ,诱导率最高为 72 % ;且愈伤组织颜色鲜艳 ,表面泡状发亮 ,质地较好。当 2 ,42D 浓度为
210mgΠL 时 ,虽然诱导率为 70 % ,愈伤组织生长较快 ,但表面呈瘤状凸起、浆糊状 ,有黑点出现 ,且组织疏
松。诱导愈伤组织的适宜 2 ,42D 浓度为 110mgΠL。
当 NAA 浓度为 0. 4mgΠL 时 ,愈伤组织的诱导率仅为 13 % ;当 NAA 浓度为 110 mgΠL 和 210mgΠL 时 ,诱导
率可达到 78 %和 80 % ,且颜色正常、质地较好 ;当 NAA 为 410mgΠL 时 ,诱导率虽略有下降 ,但由于前期生
长较快 ,培养 20d 后生长速度明显减慢 ,有少数组织块开始褐化 ,并逐渐开裂、呈碎块状。因此 ,愈伤组
织诱导适宜的 NAA 浓度为 110～210mgΠL。
212 　单一生长调节剂与温度对愈伤组织生长的影响
21211 　2 ,42D 和温度对愈伤组织生长的影响　温度和 2 ,42D 在继代培养中对牡丹药用愈伤组织增长倍
数的影响见图 1。由图 1 可知 :采用 29 ℃培养 ,培养基中 2 ,42D 浓度在 011～310mgΠL 之间愈伤组织增长
倍数的差异最大。其中 2 ,42D 浓度为 110 mgΠL 时愈伤组织生长最快 ,比接种块鲜重增加 116 倍 ;当 2 ,42
781　3 期 凤凰山牡丹药用器官的愈伤组织培养
D 浓度为 210 mgΠL 时 ,虽然增长倍数达到 114 ,但其愈伤组织疏松、呈鲜艳的紫红色 ,质地显著次于 110
mgΠL 2 ,42D 培养的愈伤组织。在 32 ℃时不同 2 ,42D 浓度之间愈伤组织增长倍数差别不大 ,其原因可能
是高温加速愈伤组织老化 ,因为该温度下培养的愈伤组织有明显的褐化现象 ,有的甚至逐渐变黑死亡。
21212 　NAA 和温度对愈伤组织生长的影响 　图 2 表明 ,温度和培养基中 NAA 含量对牡丹药用愈伤组
织的增长皆具有明显的影响。在不同 NAA 浓度的 MS 培养基上 ,愈伤组织增长倍数随培养温度的提高
都呈现低 →高 →低的趋势。温度相同、NAA 浓度不同的处理愈伤组织的增长倍数具有较大差异。在 26
～29 ℃培养的条件下 ,NAA 浓度为 115mgΠL 愈伤组织的增长倍数最大而稳定。但在 32 ℃或 20 ℃下培
养 ,无论 NAA 采用何种浓度 ,其愈伤组织的增长倍数均明显较低。
图 1 　不同 2 ,42D 和温度水平对愈伤组织
增长倍数的影响
Fig. 1 　Influence of 2 ,4 - D and temperature on
the growth of callus
———◆———2 ,4 - D 011mgΠL 　———■———2 ,4 - D 015mgΠL
———▲———2 ,4 - D 110mgΠL 　———×———2 ,4 - D 210mgΠL
———Ξ———2 ,4 - D 210mgΠL 图 2 　不同 NAA 和温度水平对愈伤组织增长倍数的影响Fig. 2 　Influence of NAA and temperature on thegrowth of callus———◆———NAA015mgΠL 　———■———NAA110mgΠL———▲———NAA115mgΠL 　———×———NAA210mgΠL
213 　复合生长调节剂与光照处理对愈伤组织的影响
21311 　光照条件对愈伤组织生长的影响　试验中发现 ,牡丹药用器官暗培养和光照培养所形成的愈
伤组织颜色不同。暗培养形成的愈伤组织呈灰白色或奶黄色 ,而光照培养的为黄绿色或浅绿色。无论
在光照培养或黑暗培养 ,新长出的愈伤组织通常为颗粒状或粘稠浆糊状 ,半个月后明显长大并堆积成蘑
菇形。但如果激素水平不当 ,小颗粒会增多但松散的堆积在一起 ,有少数组织块在培养过程中变为褐
色 ,或质地变软、呈海绵状。
21312 　复合激素与光照处理对愈伤组织生长和丹皮酚含量的影响
2131211 　2 ,42D 与 TDZ或 BA 组合对愈伤组织生长的影响　由表 1 看出 ,2 ,42D 与 BA 组合培养愈伤组
织 ,光照培养的其增长倍数和综合值明显高于暗培养 ,但愈伤组织的鲜干比和丹皮酚含量两个指标没有
明显差异。值得注意的是 ,丹皮酚含量随 BA 浓度的提高呈下降趋势。从表 1 还可以看出 ,在 2 ,42D 浓
度相同的基础上 ,随着 TDZ浓度的提高 ,暗培养其愈伤组织的鲜干比和丹皮酚含量均呈下降趋势 ,愈伤
组织的致密程度提高。此外 ,就平均值来看 ,在 MS 培养基中加入 TDZ 对愈伤组织的影响大于 BA。培
养基中添加适当浓度的 TDZ较 BA 更有利于提高牡丹愈伤组织中丹皮酚的含量。
通过 2 ,42D 与 TDZ或 BA 组合对愈伤组织影响的比较发现 ,在 MS 培养基中加入 110 mgΠL 的 2 ,42D
和 5 ×10 - 6 mgΠL 的 TDZ暗培养 30d ,所形成的牡丹愈伤组织比接种块鲜重增加 1175 倍 ,且丹皮酚含量达
到 2130 % ,其综合值为 2178 ,是该项试验的最佳组合。
2131212 　NAA 与 BA 或 TDZ组合对愈伤组织的影响　由表 2 看出 ,NAA 与 BA 组合 ,暗培养其愈伤组织
的增长倍数和鲜干比高于光照培养 ,说明暗培养有利于愈伤组织的增殖 ,但暗培养丹皮酚的平均含量较
低 (11284 % < 11365 %) 。除了 BA 浓度为 0105mgΠL 外 ,采用光照培养有利于提高愈伤组织中丹皮酚的
881 核　农　学　报 19 卷
含量。由表 2 还可以看出 ,NAA 与 TDZ组合对愈伤组织的影响很大。当 TDZ浓度为 5 ×10 - 6 mgΠL 时 ,愈
伤组织的生长处于停滞状态 ,丹皮酚含量最高 ;当 TDZ浓度为 5 ×10 - 3 mgΠL 时 ,在暗培养的条件下愈伤
组织的增长倍数最大 ,但是丹皮酚的含量偏低。值得注意的是 ,与 NAA 和 BA 组合相反 ,在培养基中
NAA 和 TDZ组合并进行暗培养其愈伤组织中丹皮酚的含量高于光照培养。在黑暗条件下丹皮酚含量
较高 ,与牡丹药用器官生长在土壤中 (黑暗)有利于药用成分的积累是一致的。
表 1 　110mgΠL 2 ,42D 与不同浓度的 BA 或 TDZ组合对愈伤组织生长和丹皮酚含量的影响
Table 1 　The effect of combination of 110mgΠL 2 ,42D and
BA or TDZ on the callus growth and peony phenol content
生长调节剂
growth regulator
浓度
concentration (mgΠL) 增长倍数increased times 鲜干比fresh weightΠdry weight 丹皮酚含量paeonol content ( %) 综合值CV光照 light 黑暗 dark 光照 light 黑暗 dark 光照 light 黑暗 dark 光照 light 黑暗 dark
BA 0105 11205 01977 10199 10177 01866 01915 0195 0183
BA 0110 11081 11153 11175 11109 01921 01908 0185 0194
BA 0120 11041 01842 10144 11179 01899 01542 0189 0139
BA 0140 11750 01707 11128 91820 01614 01615 0195 0144
平均值 average 11269 01920 11112 10108 01825 01745 0191 0165
TDZ 5 ×10 - 6 01840 11750 14180 14148 11833 21300 1104 2178
TDZ 5 ×10 - 5 11701 01749 14180 14104 01844 11453 0197 0178
TDZ 5 ×10 - 4 11632 11144 10175 11114 11355 01591 2106 0161
TDZ 5 ×10 - 3 11107 11408 9184 11135 01645 01719 0173 0189
平均值 average 11320 11260 12155 12175 11169 11266 1120 1127
　　注 :原植物样品 (商品凤丹)丹皮酚的含量为 21063 %. 下表同。
Note : Content of paeonol in plant sample ( Paconia ostii) is 21063 %。The same as following table.
通过 NAA 与 BA 或 TDZ组合对愈伤组织影响的比较研究发现 ,在 MS 培养基中加入 115mgΠL NAA
和 5 ×10 - 3 mgΠL TDZ并进行 30d 暗培养 ,形成的牡丹愈伤组织比接种块鲜重增加 1134 倍 ,且丹皮酚含量
达到 2115 % ,其综合值达到 3115 而居试验的最佳水平。
表 2 　115mgΠL NAA 与不同浓度的 BA 或 TDZ组合对愈伤组织生长和丹皮酚含量的影响
Table 2 　The effect of combination 115mgΠL NAA and BA or TDZ on the callus growth and peony phenol content
生长调节剂
growth regulator
浓度
concentration (mgΠL) 增长倍数increased times 鲜干比fresh weightΠdry weight 丹皮酚含量paeonol content ( %) 综合值value光照 light 黑暗 dark 光照 light 黑暗 dark 光照 light 黑暗 dark 光照 light 黑暗 dark
BA 0105 01567 01635 8134 10189 11541 21480 1105 1145
BA 0110 01607 01904 8107 8166 11405 01829 1106 0161
BA 0120 01703 01762 8128 9196 11362 11007 1116 0177
BA 0140 01559 01658 7121 9196 11151 01821 0189 0154
平均值 average 01609 01740 7198 9187 11365 11284 1104 0184
TDZ 5 ×10 - 6 01010 01013 15126 14130 11420 31010 0101 0103
TDZ 5 ×10 - 5 11130 11001 15124 12127 11411 31000 1105 2145
TDZ 5 ×10 - 4 01600 01746 10112 11156 11609 21180 0195 1141
TDZ 5 ×10 - 3 01700 11340 7165 9116 11421 21150 1130 3115
平均值 average 01610 01775 12107 11182 11465 21585 0183 1176
　　比较表 1 和表 2 发现 ,在 MS 培养基中加入 2 ,42D 比加入 NAA 更有利于促进愈伤组织的生长 ,即加
入 2 ,42D 其愈伤组织的增长倍数一般大于 1 ,而添加 NAA 则普遍小于 1 ;培养基中加入 TDZ比加入 BA
更有利于提高愈伤组织中丹皮酚的含量。从综合值的比较中发现 ,适宜浓度的 TDZ 分别与 2 ,42D 或
NAA 组合并进行暗培养 ,都可以明显提高愈伤组织的产量和丹皮酚的含量。
3 　讨论
在植物离体培养过程中 ,当培养条件恶化、有害物质积累、细胞生长不良或受到伤害等刺激后 ,体内
的酚类化合物在多酚氧化酶的作用下 ,组织逐渐变为褐色或黑色 ,最后细胞死亡[2 ,6 ] ,因此褐化对植物组
织、细胞培养 ,尤其是对木本植物的组织培养是一种严重障碍[8 ] 。牡丹根皮在适宜的培养基上能诱导出
981　3 期 凤凰山牡丹药用器官的愈伤组织培养
愈伤组织 ,但在继代培养中 ,如果生长调节剂组合或培养条件不适宜 ,会因为严重褐化而导致失败 ,银杏
愈伤组织培养中也出现过类似的问题[6 ] 。另外 ,培养温度过高 ,也会促进愈伤组织老化、引起褐变。对
于目标培养物 ,一般通过调整外部培养条件来避免或缓解褐变 ,通常采用的方法有添加抗氧化剂或吸附
剂、调整培养基种类、激素[2 ] 、改变培养环境等。本研究表明 ,在适宜温度条件下进行暗培养 ,能使牡丹
愈伤组织处于旺盛的生长状态 ,可以有效地控制褐变、提高丹皮酚的含量。关于这一点 ,可能与牡丹根
皮生长在土壤中而处于黑暗条件下有利于药用成分的积累有关。
在牡丹愈伤组织继代培养的过程中 ,不同培养条件其愈伤组织的致密程度不同 ,这可能与细胞或组
织的增殖速度和细胞壁建成以及成分沉积有关。另外 ,根皮年龄、接种块大小与牡丹药用器官组织培养
的效果可能也有一定关系 ,还有待于进一步研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　王高潮 ,刘仲健. 中国牡丹培育与鉴赏及文化渊源. 北京 :中国林业出版社 ,2001 ,119
[ 2 ] 　蔡　茁 ,韩　东. 人参组织培养中氮、磷、钾素的消耗. 第四军医大学吉林军医学院学报 ,2003 ,25 (2) :24～26
[ 3 ] 　周福泉. 激素对西洋参愈伤组织人参皂甙形成的影响. 中国中药杂志 ,1998 ,23 (11) :656～657
[ 4 ] 　Wickremesinhe E R M ,Arteca R N. Taxus callus cultures :intiation ,growth optim production. Plant Cell Tissue Organ Culture ,1993 ,35 (2) :181～
193
[ 5 ] 　张广辉 ,陈春秋 ,等. 银杏离体培养生产次生代谢物研究进展. 北京林业大学学报 ,2002 ,24 (4) :130～134
[ 6 ] 　张荫麟 ,宋经元 ,等. 丹参的冠瘿组织培养和丹参酮的产生. 生物工程学报 ,1995 ,11 (2) :51～53 ,106
[ 7 ] 　郑树松 ,苑华毅 ,等. 药用植物栝楼的组织培养及其表达蛋白的分析. 生物工程学报 ,2001 ,17 (4) :60～62
[ 8 ] 　张　浩 ,陈　钧 ,等. 黄连属植物愈伤组织诱导及生物碱产生. 中国中药杂志 ,1996 ,21 (8) ,465～467 ,509
[ 9 ] 　朱宝成 ,吴爱民 ,等. 药用作物掌叶半夏组织培养及药物成份分析. 作物学报 ,1995 ,21 (4) :475～478
《小麦突变育种学》正式出版发行
　　由中国农业科学院著名小麦诱变育种学家王琳清研究员、江苏里下河农科所陈秀兰研究员、江苏
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章介绍了诱发突变的所使用的物理诱变因素和化学诱变剂 ;第五章至第六章介绍如何选择诱变亲本材
料、诱发突变的选育方法和程序、以及如何选择和鉴定突变 ;第七章介绍小麦主要性状的突变改良 ;第八
章介绍小麦突变遗传资源的鉴定评价 ;最后两章介绍提高诱变效率的途径和方法以及如何拓宽利用诱
发突变 ,进行种质创新 ,书末阐述了小麦突变育种的发展趋势与应用前景。
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2005 ,19 (3) :186～190