全 文 ：文章编号：1000．8551(2008)01．036—05
核 农 学 报 2008，22(1)：36—4o
Joarnd ofNudearAgdctdtard Sc／emm
根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究
朱海生 潘东明 林义章 张志忠 温庆放
(1．福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2．福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建 福州 350013)
摘 要：利用带有内含子 gus基因的瞬时表达，研究影响根癌农杆菌介导“鬼露甘”草莓遗传转化的若干
因素。结果表明：草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感，适宜的筛选浓度为20mg／L，可明显抑制非转化
组织的生长；300mg／L的羧吩青霉素可有效抑菌，对外植体生长影响也较小；预培养 2—4d有利于转化；
共培养2—3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长；OD枷 值为0．4的菌液侵染 lOmin效果
最佳。再生植株经 PCR检测初步证明 gus基因已成功整合到草莓基因组中。
关键词：根癌农杆菌；草莓；遗传转化 ．
STUDIES ON Agrobacterium tumefaciens-MEDIATED GENETIC
TRANSFoRM A n oN IN STRAW BERRY
ZHU Hai．sheng · PAN Dong．ming LIN Yi-zhang ZHANG Zhi—zhong WEN Qing-fang2
(1．Colege ofHoaw~ture，FufianAgric~ture and Fo~stry Uni~rshy，Fuzhou，Fujian 350002；
2．Vege~bleResearch Center，FujianAcademy ofAgricultural Science，Fuzhou，Fujian 350013)
Abstract：Several factors afecting Agrobacterium tumefaciens—mediated gene transformation of strawberry were studied by using
the transient expression of gus gene with introns as criteria．The results showed that：the explants of strawberry leaves were
rather sensitive to kan amycin，and the corresponding concentration of 20 mg／L could substantially inhibit the growth of non-
transformed tisse and be used to screen the leaves of strawberry after transformation．Timentin at the concentration of 300 ms／L
could be used to eliminate Agrobacterium tumefaciens and had minor impact Oil the growth of the explants．The precuhure time
of 2—4 days was beneficial to improve tran sformation frequency．Co-culture for 2—3 days not only had higher gus transient
expression but also avoid the over-growth of agrobacterium．The bacterial concentration of OD600 m 0．4 Was the best inoculum
density and 10 minutes was the best inoculation time．Th e PCR analysis proved that the target gene gus Was successfuly
integrated into the genome of strawberry．
Key words：Agrobacterium tumefaciens；strawberry；genetic transformation
草莓(Fragarla ananasa Duch)是多年生草本植物，
近 1O多年来，草莓生产在我国发展迅速，栽培面积迅
速扩大。草莓传统育种技术虽取得一定进展，但其高
杂合性和多倍性给常规育种带来了周期长、工作量大
和效率低等问题⋯。利用植物基因工程技术培育草莓
品种可以不受上述因素的限制，可以获得常规育种难
以获得的新类型，从而创造出新种质，且草莓无性繁殖
的特点对转基因植株外源性状的保持十分有利。自
20世纪80年代末开始，国内外开展了草莓的基因转
化研究 ，但转 化效率很低 ，获 得的转基 因植株太
少。基因型是影响草莓遗传转化成功与否的关键，因
此，广泛收集不同基因型的草莓品种，探索更有利于草
莓遗传转化的再生条件仍是 目前研究的重要内容 。
“鬼露甘”是我国引进的最新一代丰产优质的大果草莓
品种，在“鬼露甘”草莓叶片高效再生体系的基础上，本
试验对影响根癌农杆菌介导的草莓叶片遗传转化条件
收稿日期：2007—04—10 接受日期：2007—07．03
作者简介：朱海生(1978-)，男，安徽安庆人，博士研究生，研究方向为园艺产品采后生理生化与分子生物学。E—mail：zhs0246@163．com
通讯作者：温庆放(1965．)，男，福建永泰人，研究员，研究方向为蔬菜育种和栽培。E-mail：five@163．com
维普资讯 http://www.cqvip.com
1期 根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究 37
进行了研究，建立了“鬼露甘”草莓遗传转化系统，以期
为进一步应用遗传转化方法改良草莓品种提供基础。
1 材料与方法
1．1 材 料
受体草莓为“鬼露甘”，由福州蔬菜科学研究所提
供。供试根癌农杆菌为 EHA105和 LBA4404，均含有植
物表达载体 pBI121，该质粒携带有 』3．葡糖苷酸酶基因
(gus)和卡那霉素(kanamycin，Kan)抗性的新霉素磷酸
转移酶基因(nptⅡ)。
预培养和共培养培养基 MS1：MS+6-BA 2．0 mg／L
+IBA 0．1mg／L；筛选培养基为 MS2：MS+6-BA 2．0mg／L
+IBA 0．1mg／L+羧吩青霉素(Timentin)300mg／L+Kan
20mg／L；生根培养基为 MS3：MS+NAA 0．2mg／L+Kan
20mg／L+Timentin 100mg／L。以上所用培养基均附加蔗
糖 3％，琼脂 6g／L，调 pH 5．8。工程菌液培养固体 YEB
为：蛋 白胨 5g／L+酵母 提取物 1g／L+牛肉浸膏 5g／L+
MgS04‘7H20 0．493 g／L+琼脂 15 g／L，pH 7．0；液体 YEB
为：蛋白胨 5g／L+酵母提取物 lg／L+牛肉浸膏 5g／L+
MgSO4‘7H20 0．493g／L，pH 7．0。
1．2 方法
1．2．1 抗生素敏 感性试验 草莓 叶片分别接种于不
同浓度 Kan(0、10、20、30、40、50mg／L)的诱导培养基上 ，
培养条件 ：光照强度为 1500 2OOlx，光周期为 16h光
照／8h黑暗，温度为 25℃±2℃。3—4周后观察 Kan浓
度对外植体生长情况和诱导不定芽的影响。叶盘经农
杆菌 侵 染 后 分 别 接 种 于 不 同 浓 度 头 孢 霉 素
(Cefotaxime，Cef)(100、300、5Omg／L)、羧 吩青 霉 素
(Timentin)(1o、300、500mg／L)与 羧 苄 青 霉 素
(Carbenicilin，Carb)(1o 、300、5Omg／L)的诱导培 养基
上，观察不同抗生素种类、浓度对外植体生长情况和诱
导不定芽的影响。每处理20块外植体，重复 3次。
1．2．2 工程茵液的制备 将冻存的菌株划线于添加
Kan(1omg／L)和链霉素(Streptomycin)(100mg／L)的固体
YEB平板上 ，在 28℃倒置培养 1 2d，待菌落长 出后挑
取单菌落接种于添加 Kan(1omg／L)和链 霉素(100m#
L)的液体 YEB(蛋白胨 5g／L+酵母提取物 lg／L+牛肉
浸膏 5#L+MgSO ·7H20 0．493~L，pH 7．0)培养基 中，
28℃振荡 培养 至 对 数生 长期 ，4℃下 5000dmin离心
10min，收集菌体并用新鲜的MS液体培养基重悬，稀释
至不同浓度(以OD㈣ 值表示)，置4~C下备用。
1．2．3 预培养时间、侵染时间、共培养时间和茵液浓
度的优化 预培养时间设 6个水 平 (0、1、2、3、4、5d)；
侵染时间设 5个水平(5、8、10、15、20min)；共培养时间
设 5个水平(1、2、3、4、5d)；菌液浓度 OD㈣ 值设 5个
水平(0．1、0．3、0．4、0．5、0．7)。
1．2．4 遗传转化 将经过预培养的外植体浸在液体
细菌培养悬浮液中感染，感染的外植体用无菌滤纸吸
干，在 MS1培养基上共培养 2d，接着将外植体转移到
MS2培养基上进行选择培养和再生。再生后 4—5周
抗性芽移至 MS3培养基上生根。4周后 ，生根很好的
小苗从瓶中移出，用蒸馏水清洗掉培养基移植到含有
高压灭菌的泥沙(1：1)混合物的小盘中。盘上盖上聚
合薄膜以维持高湿度。盘植小苗放在培养室内(23℃
4-2~C，16h光周期)，用 1／4 MS盐剂浇灌 3周后将小苗
移到夜／昼 温度 为 18／20℃ 的玻璃 房 内进 一步炼 苗 1
周 ，即可定植 。
1．3 测定
1．3．1 gus瞬时表达检测 转化频率以 gus基因的瞬
时表达率为指标来衡量，每个处理 20个外植体，重复
3次。gus检测采用组织化学法 。¨。，即将侵染 、共培养
后的材料浸泡于染色液 中，37℃恒温过夜 ，然后转入
70％的乙醇脱色 3次，用电镜观察，计算 gus基因的瞬
时表达率 ：
瞬时表达率 =(有 gus基因瞬时表达的外植体数／
总外植体数)×100％
1．3．2 PCR检测 运用 Barcelo等““修改的 Rogers和
Bendich¨ 方法提取来 自再生不定 芽的 DNA。设计 1
对 gus基因特异引物 ，G1：5 ．CTATACGCCATTTGAAGC．
CC．3 ，G2：5 ．GCTC啊11AATCGCCTGTAAGT．3 ，期 望 扩
增出854bp片断。PCR扩增条件：94℃预变性 5min，
94℃变性 30s，54℃退火 40s，72℃延 伸 lmin，循环 35
次 ，72℃延伸 5min。
2 结果与分析
2．1 抗生素敏感性试验
“鬼露甘”草莓叶片接种于含不同浓度 Kan的培养
基上 2周后，叶片出现不同程度的黄化；在含有 Kan
10mg／L的培养基上，培养 30d，少量叶片边缘有愈伤组
织生成，部分叶片分化出少量不定芽，不定芽再生频率
比对照明显下降(图 1．A)；在含 Kan 20mg／L的培养基
上，接种 30d后 75％的叶盘黄化，没有愈伤组织形成，
没有不定芽的再生(图 1．B)；在含 Kan 30mg／L的培养
基上，接种 25d后叶盘几乎 100％无愈伤组织的形成，
没有不定芽的再生(图 1．C)；在含 Kan 40、50mg／L的培
养基上 ，25d后叶盘 100％黄化 ，无愈伤组织的形成(图
维普资讯 http://www.cqvip.com
核 农 学 报 22卷
1一D)。可见Kan浓度为 20mg／L时，能完全抑制“鬼露
甘”叶片不定芽的分化，因此作为不定芽分化阶段的选
择压。
本试验比较了头孢霉素、羧吩青霉素与羧苄青霉
素三者的抑菌效果及其对草莓叶盘再生的影响，叶盘
经农杆菌侵染后分别接种于含有抗生素Carb和Cef的
培养基上，即使将两者的浓度提高至 500mg／L时，都难
以抑制农杆菌的污染，但不定芽分化率开始下降。经
农杆菌接种观察，300mg／L的羧吩青霉素能完全抑制
农杆菌的增殖，且不会影响不定芽的分化率。因而，选
用 300mg／L的羧吩青霉素抑制培养基上农杆菌的生长
比较合适 。
图 1 Kan浓度对叶片不定芽诱导的影响
Fig．1 Effects of Kan concentration on induction of buds
A：(Karl 10rag／L)培养基培养30d后的叶盘；B：(Kan 20mg／L)培养基培养 30d后的叶盘；c：(Karl 30rag／L)培养基培养 25d后的叶盘；
D：(Karl 40mg／L)培养基培养 25d后的叶盘。
A：The leaves cultured for 30 days On the medium containing 10mg／L Kanamycin；B．：Th e leaves cultured for 30 days On the medium containing
20mg／L Kanamyein；C：Th e leaves cultured for 25 days On the medium containing 30mg／L Kanamycin：D：Th e leaves
cultured for 25 days On tlle medium containing 40mg／L Kanamyein。
2．2 预培养时间对转化的影响
试验发现，不经预培养的叶盘，在用农杆菌菌液浸
泡后直接接种容易褐化死亡(图 2)。预培养 2～4d的
外植体 gus的瞬时表达率较高，但当预培养时间过长
(5d)时，gus的表达率有所下降，预培养时间为 1d的
转化率也比较低。所以最适合的预培养时间为 2～
4d
g 80
嚣 0 0 l 2 3 4 5
预培养时间 preculture time(d)
图2 预培养天数对 gus瞬时表达率的影响
Fig．2 Efects of the precuhure time on gus
transient expression
2．3 菌液浓度对转化的影响
从图3可以看出，农杆菌侵染液 D鲫 值在 0．1—
0．4之间时，随 OD鲫 值的增加，gus瞬时表达量呈上
升趋势，菌液浓度为 OD鲫 0．4时，gus的瞬时表达率
最高，其 中 EHA105可达到 64．8％。但 D鲫 值超过
0．5时，瞬时表达率下降明显，浓度过高会导致外植体
切口处褐化，容易死亡 ；浓度太低 ，农杆菌数 目不足 ，又
易使转化效率 降低。在相 同浓 度下 ，农 杆菌 EHA105
比LBA4404有较高的瞬时表达率。在本试验条件下，
D鲫 值为0．4左右的农杆菌侵染液对草莓“鬼露甘”叶
片的遗传转化最适宜。
2．4 侵染时间对转化的影响
从 图 4可 以看 出，用 农 杆 菌 菌 株 EHA105的
OD鲫 值为0．4的菌液对外植体进行不同时间的侵染
处理，在5～10rain范围内，随着浸泡时间的延长，gus
瞬时表达率增大，10rain时最大。之后，随着浸染时间
维普资讯 http://www.cqvip.com
1期 根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究
0 1 0 3 0 4 0 5 0 7
菌液浓度 bacterium densily(OD㈨【llin)
图3 菌液浓度对 gus瞬时表达率的影响
Fig．3 Effects of bacterium density on gus
transient expression
的延长，外植体变褐软腐。试验结果表明，以OD60 值
为 0．4的农 杆 菌 菌 株 EHA105的 菌 液 浸 染 外 植 体
10min，效果最佳。
80
戮
童譬 20
0
侵染时问 infection time(min)
图4 侵染时间对 gus瞬时表达率的影响
Fig．4 Effects of infection time on gus
transient expression
g 80
邑重20
0
0 l 2 3 4 5
共培养时间 cocultrure time(d)
图 5 共培养时 间对 gus瞬时 表达 率的影响
Fig．5 Effects of the coculture time on gus
transient expression
2．5 共培养时间对转化的影响
由图 5可见 ，经 EHA105浸染 的外植 体在共 培养
1d后就可检测到较高的瞬时表达，2d后瞬时表达大幅
增加 ，而经 LBA4404浸染 的外 植体至少需共培养 2d，
瞬时表达量才明显。随着共 培养时间的延长 ，gus的
瞬时表达率呈递增趋势，但农杆菌会过度增殖。经
EHA105浸染的外植体在共培养至 3d时 ，就能够看出
外植体下的农杆菌斑迹 ，培养至 4～5d，农杆菌已经难
以抑 制 ，致 使 外 植 体 受 到 毒 害 死 亡 。相 对 而 言，
LBA4404繁殖速度较慢 ，在共培养 5d时，肉眼才能看
见农杆菌斑迹。不经共培养直接将侵染后的外植体接
种于抗性选择培养基上培养 ，则无 gus瞬时表达。
2．6 转化植株再生与分子检测
经农杆菌介导转化和筛选后 ，获得 了形态 良好 的
Karl抗性不定芽并再生出转化植株(图 6)，设计特异引
物检测 gus基因，扩增 出 854 bp的预期 目的片段，初步
证明 gus基因已成功整合到草莓基因组中(图 7，图 8)。
图 6 抗 性芽丛和再生转化植栋
Fig．6 Resisted adventitious buds and transformed plant
图 7 转化植株叶片里 gus基 因的表达
Fig．7 The gus gene expression in the
leaves of transform ed plants
图 8 转化植株 gus基因的 PCR检测
Fig．8 PCR assay of gus gene in transform ed plants
M：DNA Marker DL 2000；1 4：转化植株 ；5：阴性对照
M ：DNA Marker DL 2000；1—4：transformed
plants；5：negative control
加 ∞ 如 ∞ 如 ∞ m 0
口0 ∞∞ _口 昌 扛 矗
瓣 茁蓝§
维普资讯 http://www.cqvip.com
3 讨论
在农杆菌介导的遗传转化中，利用选择性抗生素
准确、有效地区分转化和非转化细胞是必不可少的步
骤，常使用的两类抗生素是选择性抗生素和抑菌性抗
生素 ¨。选择性抗生素的种类及使用浓度需通过研
究具体确定。在进行草莓的遗传转化时，大多采用卡
那霉素，一般浓度在20 50mg／L之间 ，本试验采
用 20mg／L的卡那霉素作为筛选抗生素的适宜浓度，可
以有效抑制非转化组织的生长。以前在草莓的遗传转
化中采用的抗生素多为头孢霉素和羧苄青霉 引，本
试验对3种抗生素进行比较后发现，羧吩青霉素抑菌
效果明显优于头孢霉素和羧苄青霉素，且对不定芽分
化影响较小，30omg，L的羧吩青霉素就可有效抑制农
杆菌生长。
关于外植体在转化前是否要进行预培养，研究结
果不一致，一般认为I 引，对外植体进行一定时间的
培养可以促进细胞分裂 ，呈分裂状态的细胞更容易整
合外源基因，从 而提高外源基因的瞬时表达和转化率。
本研究发现，对“鬼露甘”草莓叶盘进行预培养是必要
的，不经预培养直接用农杆菌感染 ，叶盘会很快褐化、
死亡；预培养时间过短(1d)，叶盘还未形成感受 态细
胞，细胞转化率较低；若预培养超过 4d，伤口快要愈
合，农杆菌难以浸染，转化效率降低，而且即使获得不
定芽，假阳性很高，经 Kan抗性选择便逐渐白化。
菌液浓度对遗传转化的成败有很大影响，农杆菌
密度过高，则由于营养不足造成菌液中死菌数目过多，
具有感染能力的农杆菌数目实际减少，而且菌液浓度
太高，对植物材料的毒害也较大，容易导致外植体褐
化、死亡，高浓度菌液侵染，后期除菌也很困难；而菌液
浓度过低，农杆菌数 目不足，感染力弱，也使转化效率
较低。在适宜的菌液浓度下，掌握好侵染时间有助于
提高转化率，减少污染。本试验发现，感染时间过短，
共培养时无农杆菌生长，不能实现转化，侵染时间太长
容易导致外植体中毒死亡，本研究认为用 D咖 值为
0．4的农杆菌菌液浸染外植体 10min，效果最佳。
农杆菌与外植体共培养是整个转化过程中至关重
要的，也是必不可少的。农杆菌侵染植物伤口后，只有
在伤口部位存活 16 h之后才能诱发肿瘤，进行 T-DNA
的转移，因此共培养时间必须大于 16h。尽管试验材
料和菌株不同，但一般认为是共培养需 2—4 dI” ]，
有人认为 可以叶片与培养基接触处是否出现肉眼
可见的微菌落作为结束共培养的标志。共培养的时间
Joumat ofNuc／earAgr／cu／turd Sciences
2008，22(1)：36—40
也不宜太长，否则农杆菌会过度生长，不仅会造成以后
的除菌困难，还会致使外植体中毒死亡。众多研究表
明草莓的共培养时间以3d较好 ，就“鬼露甘”草
莓而言 ，2—3 d最好。
4 结论
本研究通过优化一系列影响转化的因子，建立了
“鬼露甘”草莓高效农杆菌介导的遗传转化体系：叶盘
预培养2—4 d，以 OD咖 值为 0．4的农杆菌菌液感染
10 min，共培养2—3d，选用 20 m#L的卡那霉素作为筛
选抗生素，300mg／L的羧吩青霉素作为抑菌抗生素，筛
选培养基 ：MS+6一BA 2．0mg／L+IBA 0．1mg／L+Timentin
3~mg／L+Kan 20mg／L；生根培养基 ：MS+NAA 0．2mg／L
+Kan 20mg／L+Timentin 10omg，L。利用该体系，获得
了卡那霉素抗性的 gus基因转化植株，转化植株经
PCR检测初步证明 基因已成功整合到草莓基因组
中。
参考文献：
[1] 尹淑萍，金万梅，孟凡红 ．草莓(Fr~ -ia anm Duch)遗传转化
研究进展．西北农林科技大学学报(自然科学版)，2003，31(1)：
172— 176
[2] Nehra N S，Stushnof C，Kartha K K．Regeneration of plants from
l nunatul~leaf derived callus of strawberry．HortScience，1988，23：56
[3] James D J，Passey A J，Bsrbera D J．Agrobaeteriunvmediated
transformation of cultivated strawbery(Fragaria ananassa Duch)miIlg
disarmed binary vectors．Plant Science，1990，69：79—94
[4] Schestibratov K A，Dolgov S V．Trmmgenic strawbery pl虮ts e吕 e8iIg B
thaumatin I gene demonstrate enhance resistance to&忉 cin~a．
scientia horticulnaae，2005，106：177—189
[5] 金万梅，尹淑萍，鲁韧强，等．GO基因对草莓遗传转化及抗病性
鉴定．分子植物育种，2005，3(6)：797—800
[6] 那 杰，王关林，夏 然，等．草莓annfd基因反义融合表达载体
构建及转基因植株的获得．中国农业科学，20O6，39(3)：582—586
[7] 张志宏，吴禄平，代红艳，等．草莓主栽品种再生和转化的研究．
园艺学报 ，2001，2S(3)：189—193
[8] 顾 青，朱睦元．幽门螺杆菌 ureB基因的草莓转化研究．浙江农
业学报 ，2006，18(3)：133—136
[9] 李小红，汤浩茹．草莓的遗传转化研究进展．西华师范大学学报
(自然科学版)，2006，27(2)：134—138
[1O] 王关林，方宏筠．植物基因工程．北京：科学出版社，2002：831—
832
[I1] Barcelo M，E1一Maneourl I，Mercado J，QIe∞da M，Alfaro F．
Regeneration and transformation via Agrobactefium tumefaeiens 0f the
straw cuhivar Chandler．Plant celltissue and0rg柚 culture，199g，
54：29—36
J(下转第35页)
维普资讯 http://www.cqvip.com
Journal of Nuclear Agricultural Scietwes
2008，22(1)：32～35
表 5 木霉菌 与多茵 灵协同作用活体拮抗性测定结果
Table 5 Resistanee test of the Co．interaction
of Trichoderma and Carbendazim
注 ：药剂处理 中的数字为木霉菌 T21—4孢子粉与多菌灵 口】湿性 粉剂的有
效成分重量配 比
Notes：The ratio in chemical treatment is effective composition content of
Trichoderma T21-4 spo re powder and carbendazim wettable po wder
表 5表明，木霉菌与多菌灵协 同作用 的防效均好
于它们单独使用 的效果 ，且差异显著。在菌和药重量
配比为 8：2时，对 黄 瓜灰 霉 病 的防 治 效果 可 达 到
78．9％，与 7：3配比基本相当。但为减少农药残 留，还
是选择 8：2较好 。
3 结论
本试验采用紫外线多重诱导与药物选择性培养基
驯化相结合的方法 ，成功地筛选 出对多菌灵产生高度
抗性的变异性木霉菌株 T21．4。其遗传稳定性及对病
原菌的拮抗作用均优 于亲本 菌株 T21，与杨合 同等
试验结果基本一致。但 因本试验是喷雾使用 ，故没有
作变异菌株在土壤定殖 能力测定 。同时本试 验也表
明：紫外线诱导处理技术仍然是值得利用的菌种改良
牛辜牛辜牛辜牛辜牛辜牛辜牛辜
35
技术，不仅操作简便易行，而且通过扩大突变体的筛选
基数 ，可以得到性 能优 良的变异菌株。通过对黄瓜灰
霉病活体拮抗性测定 ，表明菌和药协同处理效果优于
单独使用生防菌和杀菌剂的防治效果。在生物防治 中
加入少量的化学杀菌剂 ，可 以使病原菌菌丝失活 ，生长
速度缓慢，致病性降低 ，使靶标病原菌对生物菌剂的侵
害更加敏感 ，从而提高了生物菌剂的防治效果 ，也减少
化学农药使用剂量及残留量。因此，选育具有高耐性
且对多种化学农药具有多重抗性的突变型菌株 ，实现
生物农药与化学农药综合协同作用 ，是当前植物病害
防治的一条新途径。
参考文献 ：
[1 j Lewis A．Biocontrol of plant disease：zhe approach for tomorrow．Cop
Protection，1991，10：1086～1105
[2 J Baker R．Diversity in biological contro1．Cop Protection，1991，10：85～94
[3] Papvizas G C Evaluation of new biotypes of Tfichderma harziaum for
tolerance tobenomyl enhanced capabilities．Phytopathology．1982．72：l26
～ 132
[4] Papvizas G C．Physiological and biocontrol characteristis of stable mutants
of Trichodermaviride resistant to MBCfungicides．Phytopathology，1983，
73：407～411
[5 Harman J S，Baker R．Competitive saptophytic ability and cellulolytic
activity of rhizosphere-competent mutants of Trichoderma harziaum．
Phytopathology，1987．77：358～362
[6] 徐 同．木霉对土传病原真菌的拮耐作用．植物病理学报，1993，23
(1)：65～67
[7] 杨合同，唐文华．绿色木霉 LTR．2菌株的紫外线改良．中国生物防
治 ，2004，20(3)：182～186
[8] 陈建爱，肖 敏，等．木霉诱变菌株发酵条件研究．核农学报，2002，
16(5)：305～309
[9 鲁海菊 ，刘云龙，等 ．哈茨 木霉多菌 灵抗药 性菌株 的筛选 ．云南农
业大学学报 ，2005，20(6)：436～437
(上接 第40页)
[12] Rogers S O，Bendich A J．Extraction of DNA from miligram amounts of
fresh，herbarium and mummified plant tissues．Plant Molecular Biology，
1985，5：69～76
[13] 王关林 ，方宏筠 ．植物 基因工 程 ．北京 ：科学 出版社 ，2002：345～
346
[14] 张红梅，王俊丽．“全明星”草莓叶片遗传转化体系的建立．生物
技术 ，2005，15(3)：68～7O
[15] 邓 孽，胡文玉．草莓叶片再生芽及遗传转化系统的建立．植物
学通报 ，2000，17(2)：174～178
牛辜牛辜膏辜牛辜牛辜牛辜牛辜
周春丽，郭卫东，路 梅．农杆菌介导佛手遗传转化主要影响因
素的研究．热带亚热带植物学报，2006，14(5)：374～381
范国强 ，赵振利 ，曹艳 春 ．根癌农 杆 菌介导 的悬铃木 叶片遗 传转
化体系研究．河南农业大学学报，2006，40(4)：359～362
陈秋苹，刘学群．根癌农杆菌介导的糖苷转移酶基因转化烟草的
条件研究 ．化学与生物工程 ，2005，9：9～11
沈俊岭，赵 芳 ，李 云，等．速生型刺槐遗传转化体系的建立．
核农学报，2006，20(6)：477～481
贾小明，樊军锋．影响农杆菌介导的河北杨遗传转化的因素．西
北林学院学报 ，2006，21(5)：102～105
" 培 加
j [ [
维普资讯 http://www.cqvip.com