全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 022136205
正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立
蔡　诚　吴大强　纵　方　项　艳
(安徽农业大学林学与园林学院 ,安徽 合肥　230036)
摘　要 :本试验以建立的南林 95 杨高频再生体系为基础 ,利用正交试验设计 ,通过 GUS 组织染色分析法
研究了预培养时间、菌液浓度、AS 浓度、侵染时间和共培养时间 5 个因素在 4 个水平上对南林 95 杨遗
传转化的影响 ,并探讨了南林 95 杨转化中添加卡那霉素 ( Kanamycin) 的适宜浓度。结果表明 :外植体预
培养 7d ,在含乙酰丁香酮 AS 200μmolΠL、菌液浓度 OD 值为 016 的农杆菌液中侵染 20min ,共培养 3d 为最
佳遗传转化体系 ,适宜的卡那霉素筛选浓度为 50mgΠL ;经 GUS 染色检测和 PCR 分析表明 ,GUS 基因已初
步整合进南林 95 杨基因组中。
关键词 :杨树 ;正交设计 ;遗传转化 ;农杆菌
OPTIMIZATION OF AN GENETIC TRANSFORMATION SYSTEM FOR POPLAR
BY USING ORTHOGONAL DESIGN
CAI Cheng 　WU Da2qiang 　ZONG Fang 　XIANG Yan
( School of Forestry &Landscape Architecture , Anhui Agricultural University , Hefei ,Anhui 　230036)
Abstract :Based on the established regeneration system of Nanlin 95 ( Populus deltoids Bartr. cv. Lux ×P. euramericana
(Dode) Guineir cv. I245Π51) , through orthogonal design , an efficient transformation and screening system of Nanlin 95
mediated by Agrobateriurn was developed. The leaves from tissue culture served as excellent explants for transformation , and
the factors affecting the transformation frequency , such as preculture time of explants , concentration of Agrobacterium and
acetosyringone (AS) , infection time and co2infection time were discussed by GUS coloration analysis , and the concentrations
of antibiotics to inhibit the growth of Agrobacterium were also discussed. The data were analyzed by software DPS , a suitable
genetic transformation system was established. The results indicated that 7 days preculturation , 20 min Agrobacterium (OD600
= 016) infection with 200μmolΠL AS , and 3 days’co2infection would lead to an increase in transformation efficiency , and the
medium with kanamycin 50 mgΠL was found to be the most optimal for transgenic plantlets selection ; stable integration of GUS
gene in these plants were confirmed by GUS coloration analysis and PCR test .
Key words :poplar ; orthogonal design ; genetic transformation ; Agrobacterium tumef acien
收稿日期 :2007207217 　接受日期 :2007210209
基金项目 :由安徽省人才开发专项基金 (2007 年度)和国家十一五科技支撑项目 (2006BAD03A15050 - 4)资助
作者简介 :蔡诚(19832) ,女 ,安徽含山人 ,硕士 ,主要从事园林植物及观赏园艺遗传育种方面的研究。Tel :13865974229 ;E2mail : caicheng215 @126. com
通讯作者 :项艳 (19652) ,女 ,安徽桐城人 ,博士 ,主要从事林木遗传育种方面的研究。E2mail : xiangyan @ahau. edu. cn　　杨树是具有重要经济价值的优良阔叶树种 ,基因组小 (约 450～550Mbp) ,与水稻类似 ,仅为拟南芥基因组 (120Mbp)的 4 倍 ,且生长快 ,容易繁殖 ,易于基因工程操作 ,被认为是林木基因工程中的理想模式树种[1 ] 。在杨树上应用的遗传转化方法主要有 DNA 直接转移法和农杆菌介导法。农杆菌介导法是目前应用最广泛 且结果较为理想、技术较为成熟的一种基因转化方法。它具有操作简便 ,外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝 ,转移 DNA 片段明确 ,可直接用不同的植物组织进行基因转移等优点[2 ] ,但此法存在转化效率偏低的问题 ,故建立高效稳定的基因转化受体系统 ,是转基因育种的基础[3 ] 。农杆菌的有效侵染是 T2DNA 插入、整
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合、表达和稳定遗传的前提 ,而这期间影响有效侵染的
所有因素都将影响最终转化的效率[4 ] 。对外植体进行
一段时间预培养 ,严格控制侵染时间、共培养时间以及
选择农杆菌最佳活化时间、浓度及添加乙酰丁香酮等
酚类物质均可有效地提高转化效率[5 ] 。本试验借鉴前
人的研究 ,主要探讨了影响杨树农杆菌遗传转化的 5
个因素 ,即预培养时间、菌液浓度、AS 浓度、侵染时间
和共培养时间 ,旨在建立杨树农杆菌高效遗传转化体
系 ,为以后开展杨树转基因研究奠定基础。
1 　材料和方法
111 　材料
11111 　植物材料和菌株 　本实验室已成功建立了南
林 95 杨的再生体系 ,试验中用于侵染的叶片从组培苗
中取得。表达载体 pBI121 质粒为本试验室保存 ;农杆
菌LBA4404 由安徽农业大学生物质材料与能源实验
室惠赠。
11112 　主要培养基 　农杆菌培养基 :蛋白胨 10gΠL ,酵
母浸膏 5gΠL ,牛肉浸膏 10gΠL ,NaCl 10gΠL ,pH 710 ;预培
养培养基 :MS + 6 - BA 015mgΠL + NAA 011mgΠL + 琼脂
8gΠL + 蔗糖 20gΠL ;MS 液体培养基 :MS + 6 - BA 015mgΠ
L + NAA 011mgΠL + 蔗糖 20gΠL ;共培养培养基 :MS + 6
- BA 015mgΠL + NAA 011mgΠL + 琼脂 8gΠL + 蔗糖 20gΠL
+相应的 AS 浓度 ;恢复培养基 :MS + 6 - BA 015mgΠL
+ NAA 011mgΠL + 琼脂 8gΠL + 蔗糖 20gΠL + 头孢霉素
400mgΠL ;筛选分化培养基 :MS + 6 - BA 015mgΠL + NAA
011mgΠL + 琼脂 8gΠL + 蔗糖 20gΠL + 头孢霉素 200mgΠL
+ 卡那霉素 50mgΠL。
112 　方法
11211 　卡那霉素抗性筛选 　以卡那霉素作为遗传转
化的选择剂 ,将南林 95 组培苗叶片和幼苗分别接种在
含有 0、20、30、40、50 和 60mgΠL 以及 0、5、10、15、20 和
25mgΠL 的 Kan MS 培养基上 ,再分别进行分化和生根
抗性筛选[6 ] 。
11212 　遗传转化体系的正交试验设计 　为摸索出影
响遗传转化 5 个主要因素的最佳组合 ,选用 L16 (45 ) 正
交设计 ,见表 1。表中共有 16 个处理 ,每个处理的样
本量为 100 片叶 ,按表中的数据进行试验。
11213 　根癌农杆菌的活化与外植体的浸染、筛选及生
根 　从活化平板上挑取单菌落接种于含卡那霉素的农
杆菌 YEP 液体培养基中 ,28 ℃、230rΠmin 培养约 16h ,用
不含抗生素的 YEP 液体培养基按 1∶50 的比例进行稀
释后 ,28 ℃、230rΠmin 振荡培养 4 - 6h ,至相应 OD600值
表 1 　遗传转化体系的正交设计表 L16 ( 45 )
Table 1 　Orthogonal design for genetic
transformation system
编号
No1 预培养天数preculture
time (d)
菌液浓度
concentration
of
Agrobacterium
AS浓度
concentration
of AS
(μmolΠL) 侵染时间infectiontime (min) 共培养天数co2infectiontime (d)
1 1 012 0 5 1
2 1 014 100 10 2
3 1 016 200 20 3
4 1 018 300 30 4
5 3 012 100 20 4
6 3 014 0 30 3
7 3 016 300 5 2
8 3 018 200 10 1
9 5 012 200 30 2
10 5 014 300 20 1
11 5 016 0 10 4
12 5 018 100 5 3
13 7 012 300 10 3
14 7 014 200 5 4
15 7 016 100 30 1
16 7 018 0 20 2
时 ,在 4 ℃下 5000rΠmin 离心 5min 收集菌体 ,用 40ml 体
积的 MS 液体培养基 (含相应乙酰丁香酮浓度) 悬浮备
用。于超净工作台上 ,将工程菌液倒入无菌培养皿中 ,
浸入预培养过 1、3、5、7d 的叶片 ,不时轻摇 ,达到设定
的 5、10、20 和 30min 侵染时间后 ,用无菌滤纸吸干后
接种到共培养培养基上 ,25 ℃左右遮光进行共培养。
待平皿中长出可见菌落即可用无菌水清洗叶片 5～7
次 ,再用含 400mgΠL 头孢霉素水浸泡 ,放入恒温摇床中
振荡 30min ,然后将叶片接种到含头孢霉素 400mgΠL 的
恢复培养基上 ,25 ℃遮光进行恢复培养 7d。取恢复培
养后的 16 个处理下的杨树叶片材料若干 ,置于 X2Gluc
缓冲液中 ,37 ℃下过夜染色。剩下恢复培养 7d 的材料
转入筛选分化培养基中 ,25 ℃遮光培养 6d 后 ,转入光
照时间为 16hΠd 的条件下培养 ,以后每 20d 转入新配
制的筛选分化培养基 ,进行 3 轮筛选培养。经卡那霉
素筛选形成的抗性不定芽 ,在含有卡那霉素的生根培
养基上诱导生根[7 ] 。
11214 　转化植株的检测 　
1121411 　GUS 染色 　取转化所得植株的叶片进行
GUS染色 ,因试验中难免会出现接种时污染或脱菌时
冲洗造成损失 ,所以将每次处理的样本量定为 100 片
叶 ,分 3 个样方 ,每个样方 30 片叶 ,染色时任取其中的
一个样方 ,每处理的染色设 2 次重复。染色后取出材
料置 50 %的乙醇中 15min , 再转入 70 %的乙醇中
15min ,最后用 95 %乙醇脱色 3 次 (每次 3h) ,直至脱去
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所有叶绿素 ;同时 ,设阴性对照 (非转化的相同材料) 。
观察染色情况。
1121412 　PCR 检测 　采用改良的 CTAB 法[8 ] 提取转化
植株的基因组 DNA ,进行 PCR 扩增。检测 gus 基因所
用的 5′端引物为 :5′2GTCCGTCCTGTAGAAACCCCAACC2
3′,3′端引物为 :5′2GCCCTGATGCTCCATCACTTCCTG23′,
扩增 GUS 基因中大小为 344bp 的片段。反应条件为 :
94 ℃预变性 5min ,94 ℃30s ,63 ℃30s ,72 ℃30s ,35 个循
环 ,72 ℃延伸 5min。
2 　结果与分析
211 　卡那霉素筛选浓度的确定
卡那霉素浓度的敏感性试验结果表明 ,叶片和幼
苗对卡那霉素均比较敏感 ,在不含卡那霉素的对照培
养基上不定芽诱导率及生根率可达 100 % ,生长状况
良好。而在含卡那霉素的培养基上随着浓度不断提
高 ,不定芽的分化及生根表现出明显的推迟甚至死亡
等现象。在含 50mgΠL 卡那霉素的培养基上生长时 ,有
90 %以上的外植体 2 个月内迅速变黑并死亡 ;在含
15mgΠL 卡那霉素的培养基上生长时 ,幼苗白化基本不
能生根。因此 ,本试验选择 50mgΠL 作为合适的转化植
株筛选浓度 ,15mgΠL 作为合适的植株生根筛选浓度。
212 　遗传转化体系正交试验设计分析
依据 GUS 染色的效果 ,即被染上蓝色的叶片占染
色叶片总数的百分数 ,来计算瞬时表达率 ,得出 1～16
个处理的结果为 0、10 %、7313 %、1617 %、4617 %、
4313 %、1313 %、20 %、40 %、0、5617 %、5313 %、6313 %、
8313 %、100 %、100 % ;重复染色的结果与第 1 次染色
结果有较强的一致性 ,分别为 617 %、1617 %、7617 %、
1313 %、40 %、5617 %、2313 %、2617 %、4313 %、313 %、
60 %、50 %、6617 %、80 %、9313 %、9617 %。
21211 　正交试验结果的直观分析 　利用 DPS 软件进
行方差分析 ,结果见表 2。由 F 值可知 ,预培养天数、
菌液浓度、AS 浓度、侵染时间和共培养时间 5 个因素
对遗传转化的影响均达到了极显著水平 ,故进一步进
行因素内多重比较分析。
21212 　因素内各水平对遗传转化的影响 　
2121211 　预培养时间对遗传转化的影响 　分析影响
结果的主次因素须将同因素中两个水平的结果做差 ,
差的大小反应了该因素的变化对结果影响的大小 ,而
同因素中不同水平的结果均值反应了不同水平在该因
素中影响的大小。预培养天数的均值极差分析结果为
5817375 ,是 5 个影响因子中极差值最大的 ,说明预培
表 2 　方差分析表
Table 2 　Variance analysis
变异来源
source
平方和
SS
自由度
DF
均方
MS
F 值
F
重复 repate 3510703 1 35107031
预培养 preculturation 1708610984 3 5695136615 32010306933
菌液浓度 concentration
of Agrobacterium
324318759 3 1081129198 6017593333
AS浓度 concentration
of acetosyringone
480017109 3 1600123698 8919195833
侵染时间 infection time 148419059 3 494196865 2718129933
共培养 co2infection time 358114309 3 1193181031 6710818933
误差 error 266194469 15 17179631
总和 total 30499103719
注 : F0105 (3116) = 3124 , F01 01 (3116) = 5129。33 :在统计假设检验中 ,公认的小概率事件的概率值称为显著水平
(significant level) 。
养天数是影响遗传转化的最重要因素。在进行基因转
化前将外植体预培养一段时间 ,不仅可以减少杂菌污
染 ,而且可以调整外植体的生理状态 ,使它们更适应体
外培养条件 ,以提高卡那霉素抗性芽分化频率。因此 ,
试验中优化预培养天数是保证遗传转化高效稳定的基
础。对预培养时间进行因素内多重比较 ,分析结果表
明 ,在遗传转化体系预培养天数的不同梯度中 ,3d 和
5d 之间差异不显著 , P 值为 011768 ,其余梯度之间差
异分别达到了显著与极显著水平。从图 1 也可以看
出 ,在 1 - 7d 之间结果均值随预培养天数的增加一直
呈上升状态 ,可得知 7d 并不一定是最佳预培养天数 ,
故做补充试验。设置 3、5、7、9、11d 五个梯度 ,用选出
的最佳菌液浓度、AS 浓度、侵染时间和共培养时间进
行试验 ,每个处理的样本量仍为 100 片叶片 ,从染色结
果 (图 2)可以看出 7d 为最佳的预培养天数。
图 1 　预培养天数与结果均值关系图
Fig. 1 　Relationship between preculturation
time and the mean of result
2121212 　菌液浓度对遗传转化的影响 　菌液浓度过
高会使植物外植体组织褐化 ,并且农杆菌的污染严重 ,
在以后的培养中难以控制 ;菌液浓度过低则会使转化
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图 2 　不同预培养天数对转化的影响
Fig. 2 　Effect of different preculturation
time on transformation
频率降低。由因素内多重比较的结果可以看出只有
OD 值的梯度为 012 和 014 之间差异不显著 , P 值为
01856 ,而其他各梯度之间差异均达极显著。图 3 显
示 ,菌液浓度 OD 值在 012～016 之间时 ,结果均值随着
菌液浓度的增加而递增 ,在 016 时达到最高。之后由
于菌液浓度过高 ,导致遗传转化结果均值下降。故选
择 OD 值 016 为遗传转化体系中最佳菌液浓度。
图 3 　菌液浓度与结果均值关系图
Fig. 3 　Relationship between concentration of
Agrobacterium and the mean of result
2121213 　AS 浓度对遗传转化的影响 　农杆菌对一系
列植物酚类化合物具有趋化性 ,同时高浓度的 AS 又
可使农杆菌的 Vir 基因活化并表达。从本试验 4 个梯
度的结果均值可以看出 (图 4) ,AS 浓度为 200μmolΠL
是遗传转化体系中最佳 AS 浓度。
图 4 　AS浓度与结果均值关系图
Fig. 4 　Relationship between concentration of
AS and the mean of result
2121214 　侵染时间对遗传转化的影响 　控制供试叶
片在菌液中的浸泡时间是至关重要的。通过因素内多
重比较的结果可以看出 ,在侵染时间的不同梯度中 ,20
和 30min、5 和 10min 之间差异不显著 , P 值分别为
013186 和 019291 ,其余梯度之间差异均达到了极显著
水平。从图 5 反应结果均值与侵染时间的关系图中也
可看出 ,在 5min 至 20min 之间均值随侵染时间的增加
而增加 ,在 20min 时达到最高。之后随着侵染时间继
续增加 ,遗传转化结果均值下降 ,故选择 20min 作为遗
传转化反应体系中最佳的侵染时间。
图 5 　侵染时间与结果均值关系图
Fig. 5 　Relationship between infection time
and the mean of result
2121215 　共培养时间对遗传转化的影响 　菌液浸染
后共培养时间的长短对转化也有着很大的影响。共培
养时间过短 ,由于农杆菌生长量不足而影响转化频率 ;
相反 ,共培养时间过长 , gus 基因瞬时表达频率则逐渐
下降 ,这可能是由于培养时间过长引起农杆菌过度生
长 ,导致植物细胞溺死或者阻断细胞对营养成分的吸
收 ,从而抑制了植物细胞正常生长而导致死亡。从本
试验的结果看 (图 6) ,共培养 3d 是最佳时间 ,过长或
过短均不利于南林 95 叶片的转化。
图 6 　共培养天数与结果均值关系图
Fig. 6 　Relationship betweenco2infection
time and the mean of result
213 　转基因植株的检测
取转化后植株的基因组 DNA、pBI121 质粒 (阳性
对照) 、未转化植株 (阴性对照) 分别进行 PCR 扩增 ,从
图 7 中可以看出 ,抗性植株扩增出与阳性质粒相同的
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条带 ,且叶片 GUS 组织染色呈阳性 ,说明外源基因已
初步整合到南林 95 基因组中。
图 7 　PCR 检测转化植株
Fig. 7 　PCR analysis of transplants
M:DNA marker DL22000 ;1 :阳性质粒 ;2 :阴性对照 ;3～5 :抗性植株
M: DNA marker DL22000 ; 1 :Positive Plasmid ;
2 : negative control ; 3～5 : resistant plant
3 　结论
有关遗传转化体系优化的报道很多 ,但大多是采
用简单的梯度试验方法对每个因素的最佳水平进行探
索[9 ] ,需要进行多次的梯度试验 ,过程繁琐 ,且不能兼
顾到各因素间的交互作用 ,对试验结果的判断缺少量
化 ,缺乏一定的标准[10 ] 。本试验以南林 95 杨组培苗
叶片为材料 ,采用正交设计的方法 ,对杨树遗传转化体
系中 5 个因素 (预培养时间、菌液浓度、AS 浓度、侵染
时间和共培养时间) 在 4 个水平上进行优化 ,结合图
表分析了试验中各因素间及因素内水平间的相关性 ,
　　　
选出了杨树最佳的遗传转化体系。即外植体预培养
7d ,在含AS 200μmolΠL 的菌液浓度OD 值为 016 的农杆
菌液中侵染 20min ,共培养 3d 为最佳遗传转化体系 ,适
宜的卡那霉素筛选浓度为 50mgΠL。
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