全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052365206
玉米耐旱自交系在干旱条件下的 mRNA 差异表达
沙莉娜　付凤玲　李晚忱
(四川农业大学玉米研究所 ,四川 雅安　625014 ;西南作物遗传资源与遗传改良教育部重点实验室 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :用 16 %PEG26000 对玉米耐旱自交系“81565”进行模拟干旱处理 ,用 DD2PCR 技术研究干旱与正常
浇水对照的 mRNA 差异表达 ,发现 3 个干旱条件下差异表达的特异片段 MD1、MD2 和 MD3。MD1 和
MD2 在干旱条件下减量表达 , MD3 为干旱诱导表达。序列分析和同源性比对表明 , MD1 与玉米叶绿体
基因组中编码参与 RNA 转录本 Ⅱ型内含子剪切的成熟酶的 matK基因有 93 %的相似性 ,MD2 与极端耐
旱的 Sporobolus stapfianus 的丝氨酸Π苏氨酸 2C 型蛋白磷酸酶基因 PP2 C 的相似性达 99 % , MD3 与属天
冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类的水稻 metacaspase 基因有 99 %的相似性。根据各自序列相似同源基
因的功能推测 , MD1、MD2 和 MD3 三个片段可能与“81565”的耐旱机制有关。
关键词 :玉米 ;干旱 ;mRNA 差异表达 ; matK ; PP2 C ;metacaspase
mRNA DIFFERENTIAL EXPRESSION OF DROUGHT TOLERANT INBRED LINE
UNDER DROUGHT CONDITIONS IN MAIZE
SHA Li2na 　FU Feng2ling 　LI Wan2chen
( Maize Research Institute , Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan 　625014 ;
Key Laboratory of Crop Genetic Resources and Improvement ( Sichuan Agricultural University) , Ministry of Education , Ya’an , Sichuan 　625014)
Abstract :16 % PEG26000 was used for simulating drought treatment to drought tolerant maize inbred line‘81565’. DD2PCR
technique was used to research mRNA differential expression between drought stress and irrigated control . 3 specific
fragments : MD1 , MD2 and MD3 , were found differentially expressed under drought stress. The expression of MD1 and
MD2 was down2regulated and the expression of MD3 was induced under drought stress. Sequence analysis and homology
alignment showed that MD1 had 93 % similarity with matK in maize chloroplast genome , a gene encoding maturase included
in type Ⅱintron splicing of RNA transcript ; MD2 had 99 % similarity with gene PP2 C , encoding serine Πthreonine protein
phosphatase type 2C in extremely drought tolerant Sporobolus stapfianus ; and MD3 had 99 % similarity with rice gene
encoding metacaspase , belonging to aspartic acid specific cysteine caspases. It was concluded according to the functions of
their homologous sequences that fragments MD1 , MD2 and MD3 feasibility related to drought tolerance mechanism of inbred
line‘81565’.
Key words :maize ;drought ;mRNA differential expression ; matK ; PP2 C ;metacaspase
收稿日期 :2005211223
基金项目 :国家自然科学基金 (30571172) 、教育部长江学者和创新团队发展计划 ( IRT0453)和 Rockefeller 基金 (2004 FS 047)
作者简介 :沙莉娜 (19782) ,女 ,四川新都人 ,生物化学与分子生物学专业博士研究生。李晚忱为通讯作者 , Tel :0835 2882096 ; Email : aumdyms @
sicau. edu. cn
　　研究表明 ,玉米不同自交系的耐旱性存在显著差
异[1～3 ] 。但是 ,耐旱性是众多形态、生理和生化特性协
同作用的结果 ,而且不同的基因型可能涉及不同的胁
迫应答方式[4～9 ] ,加之环境因素的干扰 ,耐旱性的鉴定
在通常条件下比较困难。目前 ,玉米耐旱性分子遗传
机制研究报道相对较少 ,基本还停留在耐旱性的生理
生化机制和鉴定指标上。对拟南芥、大麦等植物的耐
旱性研究发现 ,与干旱胁迫反应相关的 DNA 序列涉及
563　核 农 学 报　2006 ,20 (5) :365～370Journal of Nuclear Agricultural Sciences
植物生长发育诸多方面 ,包括渗透调节物质合成基因
( CMO、P5 CS ) ,编码与水分胁迫相关的功能蛋白的关
键基因 (L EA 、DHNX) ,与细胞排毒、抗氧化作用相关的
酶蛋白基因 ( HvA PX1、SOD) ,与信号转导和基因表达
相关的调控序列 (MAPK、RPK1) 等等。植物的耐旱性
既是众多耐旱相关基因在精确的调控之下时间或组织
特异性协调表达的结果[10～16 ] 。本研究试图用差异显
示 PCR(DD2PCR)技术 ,分析玉米耐旱自交系在水分胁
迫与正常灌水条件下的 mRNA 表达差异 ,克隆测序差
异片段 ,并进行生物信息学分析 ,以期获得与玉米耐旱
性相关的序列信息 ,为进一步深入研究玉米耐旱的分
子机制奠定基础。
1 　材料和方法
111 　干旱处理与总 RNA 提取
根据周树峰等[2 ] 的耐旱性鉴定结果 ,将玉米耐旱
自交系“81565”播种于 6 个容积为 011m3 的大花盆中 ,
3 叶期后每盆定苗 4 株 ,在正常条件下生长至 8 叶期
开始干旱处理。参照 Michel 和 Kaufmann 介绍的方
法[17 ] ,在 3 个花盆中加入 16 %PEG26000 溶液 ,模拟渗
透势 - 015 MPa 的干旱条件 ,另外 3 盆加等体积清水作
为对照。
分别于处理后 17、24 和 48h 取相同叶位的叶片 ,
液氮速冻后 - 70 ℃保存。在液氮冷冻条件下研磨叶
片 ,用 Sigma 公司生产的 Trizal 试剂盒提取总 RNA。所
有操作均在严格消毒 ,无 RNA 酶污染条件下 ,按试剂
盒说明书进行。用 DEPC ddH2O 溶解提取的总 RNA 样
品 ,112 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 ,EB 染色检测其完
整性 ,再用 Bio2Rad 公司 SMARTSPECTM300 型核酸蛋
白仪测定 260 和 280nm 的吸光度 ,估计样品的浓度和
纯度。
112 　逆转录与 DD2PCR 扩增
在 Takara 公司合成 3 个长 28 nt 的 3′端锚定引物 :
A1 (5′2ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTG23′)
A2 (5′2ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTA23′)
A3 (5′2ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTC23′)
合成 10 个长 26 nt 的 5′端随机引物 :
R1 (5′2ACAATTTCACACAGGATACAACGAGG23′)
R2 (5′2ACAATTTCACACAGGATTTTGGCTCC23′)
R3 (5′2ACAATTTCACACAGGATCGGTCATAG23′)
R4 (5′2ACAATTTCACACAGGAGATCTGACAC23′)
R5 (5′2ACAATTTCACACAGGAGATCAATCGC23′)
R6 (5′2ACAATTTCACACAGGAGGTACATTGG23′)
R7 (5′2ACAATTTCACACAGGAGGAACCAATC23′)
R8 (5′2ACAATTTCACACAGGACTGCTTGATG23′)
R9 (5′2ACAATTTCACACAGGACTTTCTACCA23′)
R10 (5′2ACAATTTCACACAGGAGATCGCATTG23′) 。
为方便克隆测序 ,在 3′端锚定引物 10 个多聚 T的
5′端加了 T7 RNA 聚合酶启动子序列的 17 个碱基 ,在
5′端随机引物 10 个随机碱基的 5′端加了M13Πpuc 反向
测序引物序列的 16 个碱基 ,构成 TAILPCR 引物[18 ] 。
在 20μl 逆转录反应体系中 ,加入 2μg 总 RNA、
215mmolΠL 3’端锚定引物、20U RNase 抑制剂、10U AMV
RTase、10 mmolΠL dNTPs 和 5 ×AMV Buffer。65 ℃变性 5
min ,42 ℃反应 1 h ,70 ℃10min 灭活反转录酶。
取 1μl 逆转录合成的 cDNA 产物 ,稀释 7 倍后作
DD2PCR 模板。在 50μl DD2PCR 反应体系中 , 加入
10mmolΠL dNTPs、014mmolΠL 3′端锚定引物和 5′端随机
引物、1125U Taq DNA 聚合酶和 1μl 稀释 7 倍的 cDNA。
94 ℃预变性 2min 30s ;94 ℃变性 30s ,50 ℃退火 40s ,72 ℃
延伸 2min ,循环 30 次 ;72 ℃延伸 10min。
113 　DD2PCR 产物凝胶电泳和差异片段的回收、重扩
增、克隆和测序
用 3 %琼脂糖凝胶电泳分离 DD2PCR 扩增产物 ,
EB 染色。差异片段用 Omega 公司生产的琼脂糖凝胶
回收试剂盒回收、纯化 ,用原引物组合重扩增 ,再通过
酶切和连接 ,插入 PMDT218 载体。用重组质粒热击转
化大肠杆菌 DH5α菌株的感受态细胞 ,在氨苄青霉素
培养基上培养 ,挑取阳性克隆转接培养 ,提取质粒
DNA ,用对应引物 PCR 扩增鉴定重组质粒。委托
Takara 公司测定差异片段的碱基序列 ,登陆 GenBank
(http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. gov) 和 Maizeseq ( https :ΠΠ
www. maizeseq. org) 查询其同源序列 ,再用 Blastn 2. 2. 9
软件分析差异片段与其同源序列的相似性[19 ] 。
2 　结果与分析
211 　总 RNA 样品质量
图 1 是总 RNA 样品 112 %甲醛变性琼脂糖凝胶电
泳结果。6 个样品的 28、18 和 5S 3 条 rRNA 带清晰 ,各
种不同长度的 mRNA 形成连续的弥散带 ,说明 RNA 的
完整性良好。在 260 和 280nm 的吸光度比值 ,A260Π
A280 = 117～210 ,表明总 RNA 纯度较高 ,可用作逆转
录模板。
212 　DD2PCR 扩增结果
由 3 个 3′端锚定引物与 10 个 5′端随机引物组成
的 30 个引物组合 ,对干旱处理 17 、24 、48h 及对照的
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图 1 　总 RNA 样品的变性琼脂糖凝胶电泳检测
Fig. 1 　Denatured agarose gel electrophoresis
detection of total RNA samples
逆转录 cDNA 模板 ,均能扩增出特异条带。每个引物
组合一般扩增 3～12 个条带 ,分子量介于 100～2000bp
　　　
之间。其中 ,干旱与对照处理之间的差异条带有 20
条 ,包括干旱诱导表达的 2 条 ,增强表达的 8 条 ,减量
表达的 6 条 ,抑制表达的 4 条。
图 2 是引物组合 A1ΠR1、A2ΠR1 和 A3ΠR1 ,对干旱
处理 17 、24 、48h 及对照的逆转录 cDNA 模板的扩增结
果。在引物组合 A2ΠR1 和 A1ΠR1 扩增的条带中 ,分别
有 1 个约 850bp 和 700bp 的特异条带 ,在干旱处理 17 、
24 、48 h 及对照均有表达 ,但干旱条件下的表达量始
终低于正常浇水的对照。我们将这两个干旱条件下减
量表达的片段 ,分别命名为 MD1 和 MD2。在引物组
合 A1ΠR1 扩增的条带中 ,有 1 个约 520bp 的特异条带 ,
在干旱处理 17 和 24h 时表达极弱 ,干旱处理 48h 时表
达增强 ,正常灌水的对照没有表达。我们将这一干旱
条件下诱导表达的条带命名为 MD3。经重扩增、克隆
和测序后 ,登录 GenBank 和 Maizeseq 查询 ,未见有关
MD1、MD2 和 MD3 序列在玉米上的功能报道。
图 2 　引物组合 A1ΠR1、A2ΠR1 和 A3ΠR1 的 DD2PCR 扩增结果
Fig. 2 　DD2PCR amplified result with primer combination A1ΠR1 , A2ΠR1 and A3ΠR1
213 　MD1 与玉米叶绿体基因 matK的相似性
序列测定、Maizeseq 查询和相似性分析表明 ,干旱
条件下减量表达的 MD1 片段 ,与玉米叶绿体基因组
matK基因有 93 %的相似性 (图 3) 。在叶绿体基因组
中 , matK基因又位于 trnK 基因的内含子中 ,编码参与
RNA 转录本 Ⅱ型内含子剪切的成熟酶 ,通过对内含子
剪接的影响而调节基因的表达[20 ,21 ] 。Bennett 等从水
稻中克隆的一个与耐旱性相关的 mRNA 片段 ,也是基
因内含子成熟酶的编码序列 ( http :ΠΠsrs. dna. affrc. go.
jpΠsrs8Πsrs ? 2e + %5bDDBJ2AccNumber :CA766330 %5d) 。
由此推测 , MD1 片段在干旱条件下表达量减少 ,导致
成熟酶活性降低 ,可能改变叶绿体基因组中某些基因
mRNA 转录后的剪接方式 ,从而影响叶绿体蛋白质的
合成。
763　5 期 玉米耐旱自交系在干旱条件下的 mRNA 差异表达
图 3 　MD1 的碱基序列及其与玉米叶绿体基因 matK的相似性比对
Fig. 3 　Base sequence of MD1 and its alignment with chloroplast gene matK in maize
214 　MD2 与 Sporobolus stapfianus 丝氨酸Π苏氨酸 2C型
蛋白磷酸酶基因 PP2 C 的相似性
序列测定、GenBank 查询和相似性分析表明 ,干旱
条件下减量表达的 MD2 片段 , 与极端耐旱的
Sporobolus stapfianus 的丝氨酸Π苏氨酸 2C 型蛋白磷酸
酶基因 PP2 C 的相似性达 99 % (图 4) 。丝氨酸Π苏氨
酸 2C型蛋白磷酸酶的活性受 Mg2 + 调控 ,其作用与蛋
白质磷酸激酶的作用相反 ,催化蛋白质去磷酸化反应。
它与跨膜蛋白受体样激酶 ( receptor2like kinase , RLKs) 相互作用 ,在从细胞外向细胞内的胁迫信号传导中起重要作用[22～23 ] 。它还在脱落酸 (ABA) 和有丝分裂原活化蛋白激酶 (mitogen2activated protein kinase , MAPK)信号传导途径中起负调控作用[23～26 ] 。在水稻、烟草、拟南芥、苜蓿、海棠等多种植物中 ,都发现蛋白磷酸酶基因的差异表达与干旱和高盐胁迫条件有关[24～30 ] 。因此 , MD2 片段在干旱条件下表达量减少 ,蛋白质磷酸激酶的活性相对提高 ,再通过一系列的信号传导 ,启动细胞多方面的干旱应答机制。
图 4 　MD2 的碱基序列及其与 Sporobolus stapflianus 丝氨酸Π苏氨酸 2C型磷酸酶基因的相似性比对
Fig. 4 　Base sequence of MD2 and its alignment with gene type 2C of serineΠ
threonine phosphatase in Sporobolus staflianus
215 　MD3 与水稻 metacaspase 基因的相似性
序列测定、GenBank 查询和相似性分析表明 ,干旱
条件诱导表达的 MD3 片段 ,与水稻 metacaspase 基因的
相似性达 99 %(图 5) 。该酶属于天冬氨酸特异性半胱
氨酸蛋白酶类 (caspases) [31 ] 。在细胞程序性死亡过程
中 ,caspases 切断凋亡细胞与周围细胞之间的联系 ,关
闭 DNA 复制与修复 ,阻断 RNA 剪接 ,降解 DNA ,破坏
核结构 ,诱导细胞向外发出信号以便被周围细胞吞噬 ,
最后将细胞解体并包裹形成凋亡小体。在逆境胁迫强
度较低时 ,细胞可改变基因表达 ,合成防卫蛋白、热激
863 核　农　学　报 20 卷
蛋白等抗逆蛋白 ,抵御逆境胁迫 ,阻止细胞程序性死亡
的发生[32 ] 。在本试验中 , MD3 片段在干旱处理 48h 时
诱导表达 ,既可能是干旱造成的结果 ,也可能是耐旱自
交系延迟胁迫损伤的一种机制。
图 5 　MD3 的碱基序列及其与水稻 metacaspase 基因的相似性比对
Fig. 5 　Base sequence of MD3 and its alignment with metacaspase gene in rice
3 　讨论
植物对干旱胁迫的反应取决于胁迫的严重性及持
续时间、受影响植物的发育阶段和组织类型 ,过程相当
复杂[33 ] 。本研究所得的 3 条差异片段 MD1、MD2 和
MD3 分别与叶绿体 matK基因、PP2C 蛋白磷酸酶和细
胞凋亡中的 caspase 酶具有一定的相似性 ,也显示了玉
米响应干旱胁迫时的复杂性 ,这可能也说明了本次实
验设定的干旱处理时间较长 ,玉米植株已发生了一定
强度的胁迫 ,造成叶片中某些细胞发生程序性死亡 ,从
而影响了叶绿体基因组中某些基因的表达 ,而这一系
列的胁迫信号感知和传导又与蛋白激酶和蛋白磷酸酶
介导的逆境信号传导途径有关。
随着后基因组时代的到来 ,用于功能基因组研究
的基因差异表达新技术不断涌现和完善 ,在克服原有
技术缺点的同时 ,各自又产生了一些新的不足。DD2
PCR 技术具有假阳性率高、差异片段短等不足之处 ,使
其应用受到一定限制 ,但这一技术又具有操作简便、起
始 mRNA 用量少、纯度要求不高、可区别不同的表达强
度等其他技术难以取代的优点。为了克服 DD2PCR 技
术假阳性率高的缺点 ,本研究采用了较高的退火温度
(50 ℃) ,以提高扩增片段的特异性和长度。另外 ,设置
3 个干旱处理时间 ,既可检测不同处理时间基因差异
表达情况 ,又可相互对照 ,在一定程度上降低假阳性
率。
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