全 文 ：核 农 学 报 2011，25(1):0026 ～ 0031
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2011)01-0026-06
甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立
刘宏波 郭 翔 崔 鹏 刘 旦 许 玲 唐桂香 周伟军
(浙江大学作物科学研究所，浙江 杭州 310029)
摘 要:以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种浙双 758 子叶柄外植体为受体，建立农杆菌介导转化体
系，研究乙酰丁香酮、羧苄青霉素浓度和潮霉素筛选浓度等对农杆菌遗传转化效果的影响。结果发现，
羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以 500mg /L 最佳，且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最
小，愈伤组织诱导率和芽再生率分别为 75. 2%和 65. 1%。5. 0mg /L 的潮霉素能完全抑制未转化再生植
株的生长，使其最终褐化死亡，在此潮霉素筛选浓度下，获得了 32 株转化再生植株。共培养时培养基中
添加 100μmol /L AS 的芽再生率为 3. 9%，显著高于未添加 AS 的芽再生率(2. 0%)，说明共培养阶段添
加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体 T-DNA 的转化。部分转化再生植株经 PCR 和 Southern 杂交检
测呈阳性，病虫害接种试验表明转化植株对菌核病和小菜蛾有较好的抗性。
关键词:甘蓝型油菜;转化体系;PCR;Southern 杂交;病虫害抗性
TRANSFORMATION OF BINARY DISEASE AND INSECT RESISTANCE
GENES IN Brassica napus L.
LIU Hong-bo GUO Xiang CUI Peng LIU Dan XU Ling TANG Gui-xiang ZHOU Wei-jun
(Institute of Crop Science，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310029)
Abstract:Effects of acetosyringone，carbenicillin and hygromycin concentrations on the transgenic efficiency were
studied to establish the transformation systems using leaf-petiole explants of Brassica napus L. cv. Zheshuang 758. The
result showed that the optimum concentration of carbenicillin (500 mg /L)for inhibition of Agrobacterium tumefaciens
had little effect on the callus induction and differentiation of leaf-petiole explants. The callus induction and
differentiation of leaf-petiole explants were at the ratio of 75. 2% and 65. 1%， respectively. Hygromycin at a
concentration of 5. 0mg /L was enough to inhibit the growth of non-transformed regeneration plants，causing them
browning to death，whereas 32 regenerated plants were obtained at such lethal concentration. The frequency of shoot
regeneration on co-cultivation medium containing 100μmol /L of acetosyringone (AS，)was 3. 9% significantly higher
than those without AS (2. 0%)，indicating that addition of phenolic compounds such as AS to the medium were
beneficial to the transformation of T-DNA in co-cultivation. Regenerated plants were confirmed by PCR and Southern
blot hybridization， and these transgenic lines were proven to be resistant to Plutella xylostella and Sclerotinia
sclerotiorum.
Key words:Brassica napus L.;transformation;PCR;Southern hybridization;disease and insect resistance
收稿日期:2010-05-05 接受日期:2010-07-16
基金项目:国家科技支撑计划(2010BAD01B04)，国家自然科学基金(30871652)，油菜现代产业技术体系建设专项(nycytx-005)，浙江省自然科学
基金(R307095)
作者简介:刘宏波(1981-)，男，湖南资兴人，博士研究生，研究方向为植物组织培养与调控。E-mail:ren. n@ 163. com
通讯作者:周伟军(1962-)，男，浙江鄞县人，教授，博士，博士生导师，研究方向为植物生理与分子生物学。Tel:0571-86971770;E-mail:wjzhou@
zju. edu. cn
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1 期 甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立
油菜是世界上最重要的油料作物之一［1］，但病虫
害严重制约着油菜产量的提高。“双低”油菜品种对
病虫害极其敏感，但目前抗原种质资源较少，传统的育
种方法培育周期长，且育出的抗性品种由于致病生理
小种的变异和虫类自身适应性的提高易产生抗性衰退
的现象。随着植物基因工程技术的发展和成熟，通过
遗传转化将外源抗病虫基因导入栽培种中，然后对转
化后代进行农艺性状和品质性状的定向选择，能够获
得高产、优质的抗病虫转基因育种材料，从而扩大油菜
抗病虫育种的种质资源。农杆菌介导遗传转化技术在
油菜转基因研究中已被广泛应用，然而油菜的遗传转
化效率受多种因素的影响，因此建立一套高效的遗传
转化体系是油菜转基因技术成功的关键。
蛋白质酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)泛指具有
抑制蛋白酶活性作用的一类物质，在植物受到伤害后
会诱导表达，影响啮食者消化和吸收，是一种植物体自
身防御物质［2］。蛋白质酶抑制剂作为基因表达的初
级产物，已成为植物抗虫基因工程较理想的工具。
几丁质既是多数真菌细胞壁的主要成分，同时也
大量存在于昆虫和动物的甲壳中，几丁质酶催化水解
几丁质中 β-1，4-乙酰氨基葡糖以达到抗真菌和抗虫的
目的［3］，该基因在抗病虫转基因研究中已被广泛利
用。以往作物抗病虫基因的遗传转化研究多是进行单
个基因的遗传转化，所得转化材料在抗病虫害方面的
效果已随着病虫自身适应性的增加而有所减弱，研究
表明将 2 个具有不同抗性机制的外源基因同时转入受
体中能明显改善植物单个基因转化带来的抗性范围狭
窄以及随着转化植株世代增加而抗性减弱等的状
况［4 ～ 8］。
本研究以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)主栽品
种浙双 758 子叶柄为试验材料，通过农杆菌介导转化
蛋白质酶抑制基因和几丁质酶基因，对油菜遗传转化
体系的影响因素进行研究，并通过分子生物学试验对
转化再生植株进行初步分析鉴定，以期建立一套适合
该品种的高效遗传转化体系，为油菜转基因研究参考。
1 材料与方法
1. 1 供试材料和试剂
遗传转化受体为甘蓝型油菜(Brassica nupas L.)
主栽品种浙双 758，农杆菌菌株为 GV3101，含质粒
pCAMBIA1300，其 T-DNA 结构见图 1，该质粒由台湾
大学叶开温教授实验室惠赠［9］。组织培养用激素乙
酰丁香酮(Acetosyringone，AS)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，
4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)、6-苄基腺嘌呤
(6-Benzyladenine， 6-BA)、萘 乙 酸 (α-Naphthlcetic
acid，NAA)为日本 Wako 公司产品，分子生物学试剂
购自美国 Roche 和 Fermentas 公司。
图 1 质粒 pCAMBIA1300-PMSN-PMCN 的 T-DNA 区结构图
Fig. 1 T-DNA structure of vector pCAMBIA1300-PMSN-PMCN
1. 2 试验方法
1. 2. 1 农杆菌制备及外植体共培养 将农杆菌
GV3101 接种于 YEB 固体培养基中(Gen 50mg /L +
Kan 50mg /L + Hyg 50mg /L)28℃培养 2d，选取单菌落
进行菌落 PCR 检测，挑取阳性单菌落接种于 20ml 液
体 YEB 培养基中(Gen 50mg /L + Kan 50mg /L + Hyg
50mg /L)，250r /min，28℃培养至对数生长期，测 OD600
值，用 YEB 液体培养基稀释 OD600值至 0. 2 备用。将
发芽 5d 的无菌苗子叶柄外植体子叶柄端在备好的菌
液中 蘸 染 10s，然 后 分 别 接 种 到 未 添 加 和 添 加
100μmol /L As 的 BM1(MS + 2. 0 mg /L 2，4-D)固体
培养基上，25℃ ± 1℃，暗室共培养 2d。
1. 2. 2 羧苄青霉素对子叶柄外植体愈伤组织诱导率
及分化率的影响 共培养结束后，用含 500mg /L 羧苄
青霉素的无菌水冲洗外植体 3 遍，再用灭菌水冲洗 2
遍，用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的无菌水，然后将
其接种到含不同浓度羧苄青霉素(0、250、500、750mg /
L)的 BM2(MS + 2. 0mg /L 2，4-D)固体培养基上，一
周后转接至含不同浓度羧苄青霉素(0、250、500、
700mg /L)的 BM3 (MS + 3. 0mg /L 6-BA + 0. 1mg /L
NAA + 2. 5mg /L AgNO3)固体培养基上，每个处理接种
3 个培养皿，重复 3 次，每个培养皿接种 20 个子叶柄
外植体，在 25℃ ± 1℃，16h 光照 8h 黑暗，光照强度
30μmol / m2·s 的条件下培养 5d，研究羧苄青霉素对
愈伤组织诱导率和分化率的影响。
1. 2. 3 潮霉素对子叶柄外植体的筛选 子叶柄外植
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核 农 学 报 25 卷
体经共培养和脱菌培养后，愈伤组织已明显形成，将其
转接到含不同浓度潮霉素(0、2. 5、5. 0、10. 0mg /L)的
BM4 (MS + 3. 0mg /L 6-BA + 0. 1mg /L NAA +
2. 5mg /L AgNO3 + 500mg /L Carb)固体培养基上，每个
处理接种 3 个培养皿，重复 3 次，每个培养皿接种 20
个外植体，培养 3 周，每周更换一次新的培养基，培养
条件同 1. 2. 2，直至愈伤组织在筛选培养基中分化成
芽，研究潮霉素对子叶柄外植体的合适筛选浓度。
1. 2. 4 转化植株生根与移栽 经潮霉素筛选后分化
产生的转化植株长度达到 2 ～ 3cm 时，将其沿新生茎
底部 0. 5mm 处切下，将茎端接种到 1 /2 MS 固体培养
基上生根，生根两周后形成完整的转化植株在温室中
开瓶炼苗一天，洗净根部培养基，栽入有机质营养土中
(泥炭土 ∶ 珍珠岩 = 3 ∶ 1)，光照培养箱中培养(光照
16h /28℃，黑暗 8h /20℃)，1 月后春化处理 (4℃ /
40d)，然后转到温室中正常栽培管理，待抽薹开花后
套袋自交结实。
1. 2. 5 转化植株的 PCR 和 Southern 检测 采用
CTAB 法［9］提取所有转化植株基因组 DNA，PCR 反应
体系和程序参考分子克隆手册进行优化［10］，蛋白质酶
抑制基因和几丁质酶基因 PCR 扩增引物的退火温度
分别为 56. 8℃和 59. 6℃，引物序列和目的片段长度见
表 1。随机选取 7 株 PCR 扩增呈阳性的转化植株进行
Southern 杂交检测，按照 Roche 地高辛标记杂交试剂
盒操作方法(Cat. No. 11 745 832 910)，杂交探针为地
高辛标记的蛋白质酶抑制基因片段(297bp)，转化植
株基因组 DNA 用 HindⅢ酶切(T-DNA 区不含 HindⅢ
酶切位点)，琼脂糖凝胶电泳后转膜固定，杂交温度为
41℃。
表 1 用于 PCR 扩增的引物序列和目的片段长度
Table 1 PCR primers and target gene sizes
目的基因
target gene
片段长度
amplicon size(bp)
正向引物
forward primer
反向引物
reverse primer
Sporamin 297 5′-GAGCCGAACCGACAGTAAG-3′ 5′-CGTCATCGTATCACCCAAC-3′
PjChi-1 250 5′-GGCGACTCGTGGAATGAC-3′ 5′-CGTTCGGGTTCGTAGGGT-3′
1. 2. 6 转化植株抗病虫分析 对上述经 PCR 和
Southern 杂交检测呈阳性的转化植株进行菌核病菌
(Sclerotinia sclerotiorum)和小菜蛾(Plute xylostella)离
体接种试验［11，12］。菌核病菌接种新鲜叶片，重复 3
次;小菜蛾幼虫直接接种到植株上，每株接种 20 头 2
龄幼虫，接种 2d 和 4d 后统计菌核病病斑大小、小菜蛾
平均重量和存活率。
1. 2. 7 数据分析 所得数据均用 Statistical Analysis
System (SAS 9. 1)统计软件进行显著性分析，LSD 多
重比较分析在 0. 05 水平上进行［13］。
2 结果与分析
2. 1 羧苄青霉素对子叶柄外植体愈伤组织诱导率和
分化率的影响
羧苄青霉素是农杆菌介导法遗传转化试验中常用
的抑菌素。在共培养后脱菌培养和分化培养中被广泛
用于抑制农杆菌的生长以降低农杆菌对外植体造成的
伤害。本试验通过在脱菌培养基和分化培养基中添加
不同浓度的羧苄青霉素，研究其对子叶柄外植体愈伤
组织诱导率和分化率的影响。由表 2 可知，未用农杆
菌 GV3101 侵染的子叶柄外植体在正常培养情况下，
随着羧苄青霉素浓度的增加，子叶柄外植体愈伤组织
诱导率显著降低，但 250mg /L 和 500mg /L 之间无显著
差别，说明添加羧苄青霉素对子叶柄外植体诱导产生
愈伤组织有一定的抑制作用。子叶柄外植体与农杆菌
GV3101 共培养后在含不同浓度羧苄青霉素的脱菌培
养基中都能诱导产生愈伤组织，添加 500mg /L 羧苄青
霉素时愈伤组织诱导率显著高于羧苄青霉素浓度为
0、250 和 750mg /L 时的愈伤组织诱导率(表 2)，在未
添加羧苄青霉素的培养基中由于农杆菌 GV3101 的大
量生长对子叶柄外植体造成严重影响，愈伤组织诱导
率最低，仅有 26. 1%。含有 250mg /L 羧苄青霉素的培
养基中脱菌培养 1 周后仍有部分子叶柄外植体端部周
围长出农杆菌。
由表 2 还可知，在随后的分化培养中，羧苄青霉素
对未用农杆菌 GV3101 侵染的子叶柄外植体愈伤组织
分化率的影响与愈伤组织诱导率的表现一致，羧苄青
霉素对子叶柄外植体分化也有一定的抑制作用。子叶
柄外植体与农杆菌 GV3101 共培养后，未添加羧苄青
霉素的分化培养基中已诱导产生的愈伤组织由于农杆
菌 GV3101 疯狂生长而遭到伤害，因不能正常生长而
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1 期 甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立
腐烂死亡，未能分化出芽。添加 500mg /L 羧苄青霉素
的分化培养基的分化率显著高于 250mg /L 和 750mg /
L 2 个浓度的分化率(表 2)。以上结果说明在共培养
后的愈伤组织诱导培养和分化培养阶段添加 500mg /L
羧苄青霉素能有效抑制农杆菌 GV3101 的生长，同时
能最大程度地降低羧苄青霉素对子叶柄外植体愈伤组
织诱导率和分化率的影响。
表 2 羧苄青霉素对愈伤组织诱导率和分化率的影响
Table 2 Effect of carbenicillin on callus induction and shoot differentiation rate
羧苄青霉素
carbenicillin (mg /L)
愈伤组织诱导率
callus induction rate (%)
分化率
shoot differentiation rate (%)
GV3101 OD600 = 0 GV3101 OD600 = 0. 2 GV3101 OD600 = 0 GV3101 OD600 = 0. 2
0 87. 5 ± 2. 5a 26. 1 ± 1. 9d 82. 7 ± 1. 1a 0. 0 ± 0. 0d
250 76. 0 ± 1. 1b 45. 3 ± 1. 9c 69. 2 ± 1. 7b 20. 5 ± 2. 0c
500 73. 9 ± 0. 8b 75. 2 ± 1. 1a 66. 6 ± 1. 0b 65. 1 ± 0. 9a
750 63. 0 ± 2. 5c 63. 8 ± 1. 7b 55. 8 ± 2. 5c 54. 1 ± 1. 2b
2. 2 潮霉素对子叶柄外植体芽分化率的影响
转化植株的初步筛选主要通过在各个分化培养阶
段的培养基中添加一定浓度的抗生素来抑制未转化植
株的生长，直至死亡。本试验中转化载体带有潮霉素
筛选标记，因此在分化培养基中添加了不同浓度的潮
霉素来研究抗生素的最适筛选浓度及其对子叶柄外植
体愈伤组织分化率的影响。结果表明，未经转化的外
植体在含有 5. 0mg /L 和 10. 0mg /L 潮霉素的分化培养
基中愈伤组织在分化阶段就全部褐化死亡，不能分化
出再生芽;而添加 2. 5 mg /L 潮霉素的分化培养基中只
有 7. 1%(共培养基添加 100μmol /L AS)和 6. 9%(共
培养基中未添加 AS)的分化苗产生(表 3)。因此，试
验中选择对农杆菌共培养的外植体在分化阶段添加
5mg /L 的潮霉素作为筛选压。同时由表 3 可知，潮霉
素浓度为 5mg /L 时，共培养时培养基中添加 100μmol /
L AS 的芽再生率为 3. 9%，显著高于共培养时培养基
中未添加 AS 的分化率(2. 0%)，说明在子叶柄外植体
转化中，共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于
转化载体 T-DNA 的转化。
表 3 不同浓度潮霉素对芽分化率的影响
Table 3 Effect of hygromycin on shoot differentiation rate (%)
潮霉素
hygromycin(mg /L)
100μmol / L AS
GV3101 OD600 = 0
100μmol / L AS
GV3101 OD600 = 0. 2
0μmol / L AS
GV3101 OD600 = 0
0μmol / L AS
GV3101 OD600 = 0. 2
0 64. 5 ± 1. 6a 61. 8 ± 1. 2a 63. 9 ± 1. 4a 62. 3 ± 1. 9a
2. 5 7. 1 ± 0. 5c 11. 6 ± 1. 0b 6. 9 ± 0. 6c 10. 7 ± 1. 1b
5 0. 0 ± 0. 0f 3. 9 ± 0. 9d 0. 0 ± 0. 0f 2. 0 ± 0. 6e
10 0. 0 ± 0. 0f 0. 0 ± 0. 0f 0. 0 ± 0. 0f 0. 0 ± 0. 0f
2. 3 转化植株的分子生物学检测
经 PCR 检测，获得的 32 株形态正常的转化植株
中有 27 株能同时扩增出 2 个目的基因片段(蛋白质酶
抑制基因片段 297bp，几丁质酶基因片段 250bp)，图 2
列出了 7 个转化株的 PCR 结果。对这 7 株转化株进
行 Southern 杂交检测，发现 1 号、6 号和 7 号材料为单
拷贝整合，其余为多拷贝整合(图 3)。
2. 4 转化植株抗病虫效果评价
接种菌核病菌 2d 后，转化植株都表现出一定的抗
性，菌核病病斑平均直径为 1. 32cm，显著小于对照植
株(2. 81cm)。接种小菜蛾 4d 后，转化植株叶片喂养
的小菜蛾平均重量只有对照植株的一半，存活率不到
25%，显著低于对照植株(100%)。以上抗病虫接种
试验结果表明转化植株对菌核病和小菜蛾均有较好的
抗性。
3 讨论
抑菌素的作用主要是在共培养后的继代培养过程
中抑制农杆菌生长，减小其对愈伤组织和分化芽的影
响，常用的抑菌素有羧苄青霉素和头孢霉素。张松
等［14］研究表明羧苄青霉素和头孢霉素对大白菜子叶
外植体愈伤组织诱导没有明显影响，羧苄青霉素对芽
和根的分化也无明显抑制作用，低浓度头孢霉素
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图 2 转化植株目的基因 PCR 扩增结果
Fig. 2 PCR results of sporamin (up)and
chitinase PjChi-1 (down)in some transformed plants
M:150bp DNA Ladder;P + :质粒 pCAMBIA1300-PMSN-PMCN;WT:
对照植株;1 ～ 7:转化植株
M:150bp DNA Ladder;P + :Plasmid pCAMBIA1300-PMSN-PMCN;
WT:wild type;1 ～ 7:transformed plants
图 3 转化植株 Southern 杂交结果
Fig. 3 Southern blot hybridization results
of some transformed plants
A:3，4，5，7 号转化植株杂交结果;B:1，2，6 号转化植株杂交
结果;P + :质粒 pCAMBIA1300-PMSN-PMCN;WT:对照植 株;
1 ～ 7:转化植株
A:Southern blot hybridization results of transformants (No. 3，4，
5，7);B:Southern blot hybridization analysis of transformed plants
(No. 1，2，6);P + :Plasmid pCAMBIA1300-PMSN-PMCN;WT:
wild type;1 ～ 7:transformed plants
(100mg /L)对芽和根的分化影响不大，但随着浓度的
升高，芽和根的分化受到严重抑制，尤其对芽分化的抑
制作用更加明显，当头孢霉素浓度大于 300mg /L 时，
愈伤组织不能诱导分化出芽。
本研究在共培养结束后先用含有羧苄青霉素的无
菌水清洗掉子叶柄外植体上生长的农杆菌，并将其转
入含有不同浓度羧苄青霉素的脱菌培养基进行培养，
结果表明羧苄青霉素对甘蓝型油菜浙双 758 子叶柄外
植体的愈伤组织诱导有一定的抑制作用(表 2)。试验
中发现在共培养后 250mg /L 羧苄青霉素的抑菌效果
并不是很理想，脱菌培养一周后仍有部分子叶柄外植
体端部周围长出农杆菌，这可能是造成部分子叶柄外
植体难以诱导产生愈伤组织的原因。添加 750mg /L
羧苄青霉素的脱菌培养基中愈伤组织诱导率较低则可
能是由于羧苄青霉素浓度过高，在抑制农杆菌 GV3101
生长的同时也抑制了子叶柄外植体愈伤组织的形成。
在随后的分化培养过程中，羧苄青霉素对子叶柄外植
体愈伤组织的分化同样有一定的抑制作用(表 2)。与
添加 500mg /L 羧苄青霉素分化培养基中的分化率相
比，250 和 750mg /L 2 个浓度下的分化率偏低，这可能
与 250mg /L 时抑菌效果不好，750mg /L 时浓度过高等
原因有关。因此在共培养结束后仍需在愈伤组织诱导
培养和分化培养过程中添加适宜的抑菌素浓度，以保
证在不影响愈伤组织诱导和分化的同时最大限度抑制
农杆菌生长对子叶柄外植体的影响。
油菜遗传转化体系中抗生素筛选标记的应用能快
速、简便的从大量非转化植株中筛选得到阳性转化植
株。本试验使用的转化载体携带了潮霉素磷酸转移酶
基因(hpt)，能使转化细胞产生对潮霉素的抗性。油菜
对潮霉素比较敏感，Cho 等［15］和 Cao 等［7，8］在白菜型
油菜、芥菜型油菜和甘蓝的转化试验中，潮霉素筛选浓
度均为 10mg /L，而 Melander 等［16］在 甘 蓝 型 油 菜
Westar 的遗传转化研究中潮霉素筛选浓度为 25mg /L。
而从本试验结果看，在含有 5mg /L 潮霉素的诱导愈伤
组织培养基中，未经转化的子叶柄外植体培养 1 周后
愈伤组织全部褐化死亡，含 2. 5mg /L 潮霉素的筛选培
养基中分化率仅为 7. 1% (共培养基添加 100μmol /L
AS)和 6. 9%(共培养基未添加 AS)，表现出敏感的特
性。石东乔等［17］以甘蓝型油菜双低品种“H165”为转
化受体，研究潮霉素对子叶柄外植体芽分化的影响，发
现该品种对潮霉素非常敏感，而有研究认为芥酸和硫
甙含量高的油菜品种对病虫抗性和其外界逆境的抗性
要优于双低油菜品种，因此双低油菜品种组织培养过
程中对潮霉素筛选标记的敏感性是否与其芥酸和硫甙
含量较低有关还需进一步的研究证实。
所获得的转化植株已进入温室培养阶段，低温春
化后套袋自交结实，T1 代植株的外源目的基因遗传分
离和表达效果及对病虫害的抗性正在研究中。
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