全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 052430206
转酿酒酵母海藻糖合成酶基因 ( TPS1)
玉米植株的获得
牟　禹　何　晶　付凤玲　李晚忱
(四川农业大学玉米研究所Π西南作物遗传资源与遗传改良教育部重点实验室 ,四川 雅安　625014)
摘　要 :PCR 克隆测序发现 ,酿酒酵母 AS. 1416 菌株的海藻糖合成酶基因 TPS1 与原报道序列发生了 11
处单碱基突变 ,其中 10 个突变发生在编码区域 ,但 9 个是同义突变 ,不影响编码蛋白的氨基酸序列。只
有 1135 位的 G变为 A ,使编码蛋白的第 355 个甘氨酸变成了天冬酰胺。用单子叶植物逆境诱导启动子
mwcs120 启动 TPS1 基因构建表达载体 ,基因枪法转化玉米胚性愈伤组织 ,PCR 检测获得阳性植株 ,平均
达到 0156 %的转化率。
关键词 :酿酒酵母 ;海藻糖 ;玉米 ;转基因 ;耐旱
TRANSFORMATION OF MAIZE WITH TREHALOSE SYNTHASE GENE( TPS1) CLONING
FROM Saccharomyces cerevisiae
MU Yu 　HE Jing 　FU Feng2ling 　LI Wan2chen
( Maize Research InstituteΠKey Laboratory of Crop Genetic Resources and Improvement , Ya’an , Sichuan 　625014)
Abstract :Trehalose synthase gene ( TPS1) was cloned from strain AS. 1416 of Saccharomyces cerevisiae by specific PCR.
Sequence analysis showed that 11 single nucleotide mutations exist compared with the previously reported sequence. 10 of the
mutations were located at the encoding domain , while 9 of them were synonymous mutations , which had no influence to the
amino acid sequence of the encoding protein. Only the mutation from G to A at site 1135 changed glycin of the 355th amino
acid to asparagine. Expression vector with TPS1 gene promoted by stress inducible promoter ( mwcs120) of monocotyledon was
used to transfer embyronic calli of maize by microprojectile bombardment . Positive plants were assayed by PCR amplification.
The average transformation rate was 0156 %.
Key words : Saccharomyces cerevisiae ; trehalose ; maize ; transgene ; drought tolerance
收稿日期 :2006212231
基金项目 :国家自然科学基金 (No. 30671309) ;教育部长江学者和创新团队发展计划 ( IRT0453)
作者简介 :牟　禹 (19812) ,男 ,四川广元人 ,硕士研究生 ,专业方向为生物化学与分子生物学。
通讯作者 :李晚忱 (19582) ,男 ,四川自贡市人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事玉米遗传育种与生物技术研究。Tel : 083522882096 ; E2mail : aumdyms @
sicau. edu. cn
　　干旱是玉米生产的主要限制因素。通过品种改良
提高玉米品种耐旱能力 ,是克服干旱危害最为经济有
效的方法。然而 ,玉米品种间耐旱性差异只是相对的 ,
即使耐旱性最强的种质材料 ,也往往不能满足生产上
对玉米品种耐旱性的要求。而且 ,玉米的耐旱性为微
效多基因控制的数量性状 ,遗传改良比较困难 ,多年来
进展不大。转基因技术可以打破物种间生殖隔离 ,转
化利用其他物种有益基因。国内外曾用 SOD、DREB
等多种抗逆耐旱基因转化玉米 ,试图提高其耐旱性。
但因这些基因耐旱能力不够强 ,耐旱机制与玉米生理
代谢不协调等原因 ,转基因后代的耐旱性不能达到玉
米生产要求。开发利用耐旱能力更高 ,适宜玉米生理
代谢机制与生产要求的耐旱基因 ,是转基因耐旱玉米
培育技术的关键[1～3 ] 。
许多微生物可在干旱、高温、高盐碱等恶劣环境条
件下长期生存 ,与细胞内高浓度海藻糖密切相关。海
藻糖是由两个葡萄糖残基经α21 ,1 糖苷键连接的非还
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原二糖 ,其非还原性决定了对酸、碱、高温的稳定性。
海藻糖可与 2 个水分子结合形成玻璃态结构 ,吸水性
比蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖大 3 倍以上。在生物体
内 ,它具有很强的抗脱水作用 ,在干旱、寒冷、高盐碱条
件下可保护生物膜、蛋白质等免受伤害[4～8 ] 。最近研
究证明 ,在缺氧条件下 ,海藻糖对果蝇以及哺乳动物细
胞也有保护作用[9 ] 。
酵母菌海藻糖的合成 ,先由 TPS1 基因编码的海
藻糖 62磷酸合成酶 (trehalose262phosphate synhtase ,TPS)
催化 UDP2葡萄糖与 62磷酸葡萄糖经α21 ,1 糖苷键连
接合成 62磷酸海藻糖 ,再由 TPS2 基因编码的海藻糖
62磷酸磷酸酯酶 (trehalose262phosphate phosphatase ,TPP)
转化为海藻糖。TPS 和 TPP 酶与 TSL1 和 TPS3 两个调
节亚基组成海藻糖合成复合体 ,催化海藻糖合成。但
是 ,TPS 酶单体也具有海藻糖合成活性[10 ] 。在植物细
胞内 ,UDP2葡萄糖和 62磷酸葡萄糖是碳水化合物代谢
的中间产物 ,只要导入编码 TPS 酶的外源基因 ,即可合
成 62磷酸海藻糖。而 62磷酸海藻糖脱磷酸转化为海藻
糖 ,可由细胞内广泛存在的非特异性磷酸酯酶催化完
成。同时导入 TPP 酶的编码基因 ,对海藻糖的积累作
用不大。这与 Tarczynski 等[11 ] 用细菌甘露醇212磷酸脱
氢酶基因转化烟草 ,获得具有甘露醇合成活性烟草植
株的情形相似。Goddijn 等[12 ] 、Holmstrom 等[13 ] 、Pilon2
Smits 等[14 ] 、Romero 等[15 ] 将大肠杆菌和酵母菌的 TPS
酶基因 ,或者 TPS酶基因与 TPP 酶基因一起 ,导入烟草
和马铃薯 ,获得的转基因植株耐旱性有所提高。国内仅
见戴秀玉等[16]用大肠杆菌 otsA 基因转化烟草获得抗性
植株的报道。在禾本科作物上 ,国内外均未见利用海藻
糖基因转化的报道。
本研究拟克隆酿酒酵母海藻糖合成酶基因 TPS1 ,
用来源于小麦的逆境诱导启动子 mwcs120 启动[17 ] ,构
建单子叶植物逆境诱导表达载体 ,用以转化玉米胚性
愈伤组织 ,使其在干旱等逆境条件下表达积累海藻糖 ,
提高抗逆性。
1 　材料和方法
111 　酿酒酵母 TPS1 基因克隆
按 Adams 介绍的方法用酿酒酵母 AS. 1416 菌株提
取基因组 DNA[18 ] 。根据 McDougall 测定的 TPS1 基因
序列 ( GenBank : X68496) ,用 Premier 510 引物设计软件
(http :ΠΠwww. premierbiosoft . com) ,设计 1 对特异 PCR 引
物 ,在上下游引物的 5′端分别加入限制性酶 SpeI 和
ApaI 的 酶 切 位 点 ACTAGT 和 GGGCCC : P1 ( 5′2
CGACTAGTGCTAAGTAAGCAACAAAGCAGGC23′) 和 P2
( 5′2AGGGGCCCGAAAACCGGACCAGGAATAGACG23′) 。
按如下温度循环 ,扩增 TPS1 基因 : 94 ℃ 2min ; 94 ℃
30s ,60 ℃30s ,72 ℃2min ,循环 30 次 ;72 ℃10 min。琼
脂糖凝胶电泳后回收目的片段 ,插入 p Gem2T Easy 克
隆载体 ,得克隆载体 pT2TPS1 (图 1) ,送 TAKARA 公司
测序。
112 　酿酒酵母 TPS1 基因序列分析
用 DNAMAN 软件 ( http :ΠΠwww. lynnon. comΠ) 比较
TPS1 基因扩增序列与 McDougall 报道序列 ( GenBank :
X68496) 的相似性。用 DNA Star 软件 (www. dnastar.
com)预测 TPS 酶蛋白质的氨基酸序列 ,再用 DNAMAN
软件比对预测氨基酸序列及 NCBI 数据库中不同物种
TPS 酶蛋白的氨基酸序列 ,分析其保守序列。
113 　单子叶植物逆境诱导表达载体构建及酶切鉴定
按图 1 所示步骤 ,用限制性内切酶 SpeI 和 ApaI 分
别消化包含单子叶植物诱导子 mwcs120 的 pWDREB
质粒和包含 TPS1 基因的 pT2TPS1 质粒 ,低沸点琼脂糖
凝胶电泳回收去除 DREB 基因的 pWDREB 质粒片段
和 TPS1 基因片段 ,T4DNA 连接酶连接构建 pWTPS1 质
粒 ,转化大肠杆菌 DH5α菌株 ,氨苄青霉素抗性平板筛
选。然后 ,用 EcoRV 和 HindIII 酶消化 pWTPS1 质粒 ,回
收表达结构 P2mwcs1202TPS12T2nos , 插入用 SmaI 和
HindIII 酶消化的 pCAMBIA1300 质粒 ,构建成 TPS1 基
因单子叶植物诱导表达载体 pCWTPS1300 ,卡那霉素抗
性平板筛选。用限制性内切酶 SpeI 和 ApaI 消化
pCWTPS1300 质粒 ,琼脂糖凝胶电泳检验 TPS1 片段是
否正确插入表达载体。
114 　玉米胚性愈伤组织的基因枪法转化和筛选
参考付凤玲等[19 ]和张莉萍等[20 ] 介绍的方法 ,在灭
菌离心管中依次加入无水乙醇灭菌处理的 1μmolΠL 的
金粉 60mg、1μgΠμl 的表达载体质粒 DNA 溶液 5μl ,
215molΠL 氯化钙溶液 50μl、011molΠL 亚精胺溶液 20μl ,
充分振荡 3min ,静置 10min ,离心后去上清液。加无水
乙醇 250μl ,振荡后离心 , 去上清液后加无水乙醇
60μl ,重新悬浮。将玉米自交系“182599”和“R09”的胚
性愈伤组织转接到高渗培养基上 ,预培养 4h 后用
PDS21000ΠHe 型基因枪转化。真空度 27～28 汞柱 ,气
压 1100psi ,轰击距离为 3cm ,每枪 1μg 质粒 DNA。轰
击后恢复培养 1 周 ,转潮霉素浓度依次为 5、10、15mgΠL
的筛选培养基上梯度筛选。
115 　T0 代植株的再生与 PCR 检测
将筛选后的愈伤组织转接到分化培养基上 ,在
2000lx 光照和 27 ℃条件下分化培养。待小芽长至 2～
134　5 期 转酿酒酵母海藻糖合成酶基因 ( TPS1)玉米植株的获得
图 1 　TPS1 基因单子叶植物诱导表达载体 pCWTPS1300 的构建
Fig. 1 　Construction of stress inducible expression vector pCWTPS1300 containing TPS1 gene for monocotyledon
3cm 时 ,转生根壮苗培养基 ,在相同光照和温度条件下
培养发根。成苗后置于温室内 ,用蛭石和珍珠岩 (3∶1)
盆栽炼苗 ,待新根、新叶长出后 2～3 周移栽大田。
取 T0 代再生植株叶片 ,CTAB 法提取基因组 DNA。
根 据 TPS1 基 因 设 计 特 异 引 物 : P3 ( 5′2 GCTAAGTAAGCAACAAAGCAGGC23′) 和 P4 ( 5′2GAAAACCGGACCAGGAATAGACG23′) , PCR 扩增 ,低沸点琼脂糖凝胶电泳检测 ,并回收特异条带测序 ,验证外源海藻糖基因是否转入。
234 核　农　学　报 21 卷
2 　结果与分析
211 　酿酒酵母 TPS1 基因克隆片段的碱基序列
用 P1ΠP2 引物从酿酒酵母 AS. 1416 菌株的基因组
DNA 扩增出一段 1603 bp 的 DNA 片段 (图 2) 。序列分
析表明 ,本研究所克隆的酿酒酵母 TPS1 基因序列 ,与
McDougall 报道的序列 ( GenBank No :X68496)有 99131 %
的相似性 ,仅有 11 个单碱基突变 ,其中 10 个突变发生
在编码区域。但是 ,其中 9 个是同义突变 ,不影响编码
蛋白的氨基酸序列。只有 1135 位的 G 变为 A ,使编
　　
码蛋白的第 356 个甘氨酸变成了天冬酰胺 (图 3 和图
4) 。这 一 新 序 列 已 在 Genbank 注 册 , 注 册 号 为
EF110520。
图 2 　酿酒酵母 TPS1 基因扩增产物
Fig. 2 　Amplication of TPS1 gene in
Saccharomyces cerevisiae
图 3 　酿酒酵母 TPS1 基因序列比对
Fig. 3 　Sequence alignment of TPS1 gene in Saccharomyces cerevisiae
334　5 期 转酿酒酵母海藻糖合成酶基因 ( TPS1)玉米植株的获得
图 4 　根据酿酒酵母 TPS1 基因预测蛋白质的氨基酸序列
Fig. 4 　Amino acid sequence of the predicted protein based on TPS1 gene sequence in Saccharomyces cerevisiae
　　根据 DNA Star 软件的预测结果 ,本研究所克隆的
酿酒酵母 TPS1 基因序列可编码由 495 个氨基酸残基
组成的蛋白质 (图 4) ,相对分子量 56205 Da ,等电点
518 ,可能为酸性蛋白。其中 ,亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸
和谷氨酸含量较高 ,分别为 913 %、911 %、719 %和
711 % ,初步推测该基因所编码的蛋白为亲水性蛋白。
DNAMAN 软件比对分析表明 ,本研究根据酿酒酵母
TPS1 基因克隆预测的蛋白质序列 ,与 NCBI 数据库中
注册的卷柏 ( Selaginella lepidophylla) 、旱稻 ( Medicago
truncatula ) 、拟 南 芥 ( Arabidopsis thaliana ) 、粘 菌
( Dictyostelium discoideum ) 、稻 瘟 病 菌 ( Magnaporthe
grisea) 、米曲霉 ( Aspergillus oryzae)等真核和原核生物的
海藻糖合成酶蛋白质序列 ,具有相同的保守序列 (图 4
下划线序列) 。
212 　pCWTPS1300 质粒的表达结构
根据 pCWTPS1300 质粒多酶切位点 ,用限制性内
切酶 SpeI 和ApaI 消化 pCWTPS1300 质粒。琼脂糖凝胶
电泳显示长 1603 bp 和 10059 bp 的两条特异带 ,分别
是 TPS1 和 pCWTPS1300 质粒骨架的长度 (图 5) 。由此
　　
说明 , TPS1 基因已插入到载体 pCAMBIA1300 上 ,且
pCWTPS1300 质粒具有设计的表达结构。
图 5 　表达载体的酶切鉴定
Fig. 5 　Restriction enzyme analysis of expression vector
213 　抗性愈伤率、再生率和转化率
自交系“182599”和“R09”的胚性愈伤组织转化后 ,
经过 3 轮潮霉素梯度浓度筛选 ,各获得 1567 和 703 块
抗性愈伤 ,抗性愈伤率分别为 2612 %和 3419 %。但
是 ,自交系“182599”的愈伤组织再生能力比自交系
“R09”强 ,再生率高 312 个百分点。加之一些偶然因
素 ,PCR 检测出的阳性植株 ,“182599”有 38 株 ,转化率
为 0164 % ,“R09”有 7 株 ,转化率为 0135 %(表 1、图 6) 。
表 1 　两个玉米自交系的抗性愈伤率、再生率和转化率
Table 1 　Positive callus rate , regeneration rate and transformation rate of two maize inbred lines
自交系
inbred line
转化愈伤块数
number of
transformed calli
抗性愈伤块数
number of
positive calli
抗性愈伤率
rate of
positive calli ( %)
再生植株数
number of
regenerated plants
再生率
regeneration
rate ( %)
PCR 阳性植株数
number of PCR
positive plants
转化率
transformation
rate ( %)
182599 5981 1567 2612 233 1419 38 0164
R09 2015 703 3419 82 1117 7 0135
合计 (total) 7996 2272 2814 315 1319 45 0156
4 　讨论
过去 ,除非洲南部一种耐旱性极强的香丛属植物
Myrothamnus flabellifolius ,在干旱胁迫条件下可从叶片
中检测到海藻糖外 ,其他被子植物均未发现海藻糖积
累[21～23 ] 。1998 年 ,Blazquez 等[24 ] 和 Vogel 等[25 ] 分别克
隆了拟南芥海藻糖262磷酸合成酶基因和海藻糖262磷
酸磷酸脂酶基因 ,并用酵母互补试验证实其生物活性。
Thevelein 和 Hohmann[26 ] 曾发现 ,海藻糖262磷酸有抑制
酵母己糖激酶的作用 ,可阻止碳水化合物合成的中间
产物进入糖酵解途径。Goddijn 和 van Dun[27 ] 、Goddijn
434 核　农　学　报 21 卷
图 6 　182599 再生植株的 PCR 检测
Fig. 6 　PCR assay of regenerated plants
泳道 1～11 为“182599”再生植株 PCR 检测结果 ;
泳道 12 为间隔为 1kb 的 Marker
lane 1211 :PCR assay of“182599”regenerated plants ;
lane 12 :1kb Plus DNA ladder
和 Smeekens[28 ]推测 ,被子植物的海藻糖可能也有相似
的生理功能。Goddijn 和 Smeekens[28 ] 、Serrano 等[29 ] 认
为 ,转基因植株耐旱性的提高是外源基因改变海藻糖
代谢途径 ,调节受体植物生长发育的结果 ,而并非直接
提高渗透调节能力。Goddijn 等[12 ] 用有效霉素 A 抑制
海藻糖水解酶活性 ,检测到转基因株系以及未转基因
的对照 ,海藻糖含量均明显升高。由此认为 ,转基因植
株海藻糖积累没有明显增加的原因 ,是由于受体植物
海藻糖水解酶活性较高 ,外源基因表达所合成的海藻
糖被水解所致。在正常条件下 ,海藻糖在玉米体内没
有明确的生理功能 ,只是在干旱胁迫条件下表达 ,提高
玉米的耐旱能力。因此 ,我们选用单子叶植物逆境诱
导启动子 mwcs120 启动 TPS1 基因的表达[17 ] 。
本研究 PCR 检测阳性的植株 ,还有待进一步作分
子杂交和表达检测 ,后代的耐旱性鉴定和遗传稳定性
也有待研究。
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