全 文 ：此文于 1999 年 4 月 28 日收到。
本工作为中国科学院大型仪器升级改造项目。
用单路三束质谱法测定生物样品的15N 丰度
孙德玲　曹亚澄　孙国庆
(中国科学院南京土壤研究所　土壤与环境分析测试中心　南京　210008)
对 Finnigan MA T 251 质谱计的数据采集和处理系统进行了改造 ,使其能用单路
三束法测定生物样品的15N 丰度。就测定方法的精密度、准确度和所用样品氮量及
记忆效应问题做了试验 ,证实该测定方法精确可靠。
关键词 :15N丰度 　测定 　质谱法
稳定性同位素质谱测定法被广泛应用于地质学、生物学、农业和环境科学研究中。其优点
是精密而稳定。我国15N 质谱测定法在生物学和农业研究中的应用始于 60 年代中期。70 年
代以后 ,由于国产同位素质谱仪器的批量生产 ,使很多与农业有关的研究单位装备了质谱仪
器 ,并开展了15N 质谱分析工作。90 年代以来 ,许多质谱仪器被淘汰 ,有些单位新购进的是精
密同位素质谱计。因此 ,生物样品的15N 丰度测定 ,特别对低丰度样品的测定成了难题。
研究15N 自然丰度变异的样品 ,一般采用三束 (m/ z 28、29 和 30) 同时接收 ,并采用样品与
标准样品 (实验室工作标准)比较测量的方法 ,先测得样品相对于工作标准的比值 ,然后再根据
公式换算出样品相对于国际标准的δ15N 值。这种双样比较测量方式的精度通常在 0101 ‰左
右[1 ] 。对15N 示踪样品的丰度测定 ,以往大都采用单路单束的测量方式 ,即以电扫描或磁扫描
的办法 ,使经质量分析器分离的不同质荷比离子都依次在同一接收器和检测系统中接收和测
量 ,然后根据离子流强度比按公式计算出15 N 原子百分数。为了消除由于不同测量时间给离
子流强度比带来的误差 ,应采用等时间间隔测量峰强的办法 ,并以等差插入法计算离子流强度
比[2 ] 。这种单路单束测量方式的精度一般在 1 %～015 %。
美国 Finnigan 质谱公司生产的 Finnigan MA T2251 型质谱计是一种精密同位素质谱计 ,配
备双路进样系统和多个接收器。该仪器是由带 4 个驱动器的 Apple Ⅱe 型计算机实现数据采
集和处理功能。为了改变仪器原设计的双路比较测量和数据采集方式 ,用单路三束法测定生
物样品的15N 丰度 ,我们对仪器的数据采集和处理系统进行了改造 ,并对影响单路测量精度和
准确度的诸因素进行了试验。
1 　材料和方法
111 　仪器设备
Finnigan MA T2251 质谱计由 Apple Ⅱe 计算机实现数据的采集和处理 ,对单路或双路的
582　核 农 学 报　1999 ,13 (5) :285～290Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
测量方式不能选择 ;测量数据不能贮存 ,打印后即消除。为此 ,我们与四川联合大学分析测试
中心合作 ,改造了该仪器的数据采集和处理系统。
11 选用 MMX 166 MHz CPU 和 640k 内存的 Philips E 813 机代替 Apple Ⅱe 计算机。
21 按运行方框图设计了单路测量的计算机程序 (见图 1) 。
31 接收和测量 m/ z 28、29 和 30 离子流强度的放大器高阻值分别为 3 ×108Ω、3 ×1010Ω和
1 ×1011Ω。
112 　样品制备
11211 　系列参比样品的制备 　制备系列参比样品是为了粗略地检验制样及测量方法的可靠
性和重现性。选用上海化工研究院生产和定值的15N 丰度为 10 %的硫酸铵样品 ,并用自然15N
丰度的硫酸铵作稀释剂 ,配制成 8 个丰度值的系列参比样品。
(1)称取 31809g AR 级的硫酸铵 ,溶解于 200mL 水中 ,配制成约含 4mgN/ mL 的“T21”溶
液 ;
(2)称取 01953g15N 丰度为 10 %的硫酸铵 ,溶解于 50mL 水中 ,配制成约含 4mg N/ mL 的
“T28”溶液 ;
(3)吸收“T28”溶液 0105、0150、1100、4100、1010 和 2510mL ,分别置於 50mL 容量瓶中 ,用
“T - 1”溶液定容至刻度 ,混合均匀。每种溶液的含氮量为 4mgN/ mL 。
根据如下公式计算出所配制溶液的15N 丰度[3 ] 。
　　A 2 =
T ·A 0 + D ·A 1
T + D
式中 ,A2 为所配制溶液的15N 丰度 ; T 和 A0 为稀释剂溶液所含的氮量和15 N 丰度 ;D 和 A
为被稀释溶液所含的氮量和15N 丰度。经计算 ,配制成的 6 种溶液的15N 丰度分别为 :“T22”为
01373 ;“T23”为 01459 ;“T24”为 01559 ;“T25”为 1114 ;“T26”为 2129 ,和“T27”为 5118。
11212 　IAEA 标准样品的制备 　国际原子能机构 ( IAEA)备有两种15N 标记的植株参比物质 ,
提供给世界各国15N 示踪实验室 ,用于校验15N 丰度测量方法的准确性。两种15N 标记植株标
准样品的含氮量和15N 丰度分别为 IAEA21 全氮含量 ( %N2total) :1153 ±01025 ;15N 原子百分
超 ( %15N atom excess) :01027 ±01002 ,以及 IAEA - 2 全氮含量 ( %N2total) :1190 ±0103 ; 15 N
原子百分超 ( %15 N atom excess) :01820 ±0106。
称取 012g 植株参比样品置于消化管中 ,加入 4mL 浓硫酸和 1132g 混合催化剂后在消化
器内消化 ,待消化液呈清亮后再继续消煮 2h。用加碱蒸汽蒸馏法分离出消化液中的铵盐 ,将
其接收在稀硫酸溶液中。
11213 　N2 样品的制备 　吸取一定量的含铵溶液置于梨形反应中 ,于 80 ℃下浓缩至干。在自
行设计的与质谱计进样口连接的制样装置上 ,在真空条件下用次溴酸钠将铵氧化成氮气[4 ] 。
设置 U 型液氮冷阱去除水蒸汽和其它杂质气体。
2 　结果与讨论
211 　测量的精确度
为了检验测量的精确度 (即重现性) ,选用系列参比样品进行较长时间的重复测量。从表
1结果可以看出 ,由于采用二束 (在高丰度时 ,采用三束) 同时采集和测量的方式 ,消除了不同
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运行
测量方式 双路
　单路
测定样品
输入 :样品号
输入 :循环次数
n 次 / 每次测量
关闭进样阀采集 m/ z
28、29、30 峰本底
以 m/ z 28 进行峰对中
采集一次
m/ z 28、29、30 峰值
m/ z 30 > 110v否
采集 n 次
m/ z 28、29 峰值
计算出的平均 R 值
关闭进样阀门采集
m/ z 28、29 本底值
从峰值中相应扣除
两次本底的平均值
按下列公式计算
15N % = 12R + 1 ×100
计算平均值 A、SD、CV
打印出样品15N %、SD、CV
结束
是
采集 n 次
m/ z 28、29、30 峰值
关闭进样阀门
采集 m/ z 28、29、30
0 本底
从峰值中相应扣除
两次本底的平均值
按下列公式计算
15N % = [ 29 ] + 2[ 30 ]2 ( [ 28 ] + [ 29 ] + [ 30 ]) ×100
图 1 　单路测量的计算机程序图
782　5 期 用单路三束质谱法测定生物样品的15N 丰度
时间单束测量由于离子流强度的涨落给测定结果带来的误差 ,从而大大提高了测定的精度。
不论是低丰度还是高丰度的样品重复测量精度均低于 015 %。这样的测定精度达国内15 N 质
谱分析的最优水平。
表 1 　系列参比样品重复测量的精确度
Table 1 　Precision of repeated measurement of reference samples
样品编号
Sample No.
估算15N 丰度
Estimated 15N %
测量值
Measured values
测量精度
S D
T21 01365 atm. % 01363 01363 01364
01363 01364 01364 01364 ±01001
T22 01373 atm. % 01371 01370 01371
01372 01371 01372 01371 ±01001
T23 01459 atm. % 01433 01434 01434
01434 01433 01434 01434 ±01001
T24 01559 atm. % 01563 01564 01564
01565 01564 01563 01564 ±01001
T25 1114 atm. % 11160 11170 11170
11170 11160 11170 1117 ±0101
T26 2129 atm. % 21330 21340 21330
21340 21330 21340 2134 ±0101
T27 510 atm. % 51150 51140 51150 5115 ±0101
T28 1010 atm. % 101040 101050 10105 ±0101
测量值和估算15N 丰度间的不一致 ,是由配制时吸取量的误差造成的 ,特别“T28”溶液吸
取的量越少 ,则测得值的偏差越大。多次重复测量 8 个系列参比样品 ,目的只是检验单路三束
测量方式对不同15N 丰度样品的测量精确度 ,而不是检验其准确性。
212 　测量的准确性
为了检验测量结果的准确度和估计系统误差的不确定范围 ,我们选用由联合国国际原子
能机构 ( IAEA) 提供的两个15 N 标记植株参比物质 (15N labelled plant reference material) ,在多
种条件下进行重复测定。根据 IAEA 发表的15N 原子百分超可计算出这两种参比植株样品的
15N原子百分数分别为 IAEA21 :01393 ; IAEA22 :1118。在我们的实验条件下 ,两个参比样品在
经消化、蒸馏和真空转化以后测得的15N 丰度如表 2 所示。
表 2 　植株参比样品的15 N丰度测量值
Table 2 　15N abundance measured value of plant reference material
样品编号
Sample No.
发表值
Reported values
测定值
Measured values
偏差
Deviation
%
IAEA21 01393 atm. % 01391 ,01391 ,01390
01390 ,01391 ,01391 - 015
IAEA22 1118 atm. % 1116 ,1116 ,1115
1115 ,1116 ,1116 - 117
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　　在 IAEA 提供的15N 标记植株参比物质的文字材料中说明 ,其发表的15N 原子百分超是由
推荐的发射光谱法测得。从表 2 可以看出 ,质谱测得的结果系统地较发表值低 ,且对15N 丰度
较高的样品偏差更大些 ,这是测量方法不同所致 ,还是由于在我们的实验条件下存在着系统误
差 ,有待进一步试验确定。
213 　要求的样品氮量
Finnigan MA T2251 同位素质谱计的主要功能是以双路比较测定的方式精密测定样品中
的碳、氮和氧的同位素比值。它具有双路毛细管进样系统 ,并且各路都配备一个可变容积的储
样器 ,属粘滞流进样方式。为了确保测定结果的稳定性 ,一般要求待测样品中含有 3～4mg 的
氮。对某些土壤样品而言 ,要使每个待测样品中含有这么多的氮量是很困难的。为此 ,我们选
取某一系列参比样品作了最小样品量的试验。分别吸取 1、015、0125、0120 和 011mL 的“T25”
样品溶液置于梨形反应瓶中 ,实际样品含氮量分别为 4、2、1、018 和 014mg。从测定的结果 (表
3)可以看出 ,减少样品氮量会使测定结果呈降低的趋势 ;压缩可变容积储样器 ,增大进样量 ,提
高离子流的输出电压 ,其测定结果略有升高。离子流强度太弱 (m/ z 28 ,强度 < 1V) ,不在接收
放大器的测量线性范围内 ,且受进样管道内剩余气体的影响较大 ,这是含氮量较少的样品测定
结果偏低的原因。在我们的实验条件下 ,样品的最低含氮量应控制在 1mg 左右。
表 3 　不同样品氮量对15 N丰度测定的影响
Table 3 　Effect of nit rogen amounts of samples on 15N abundance measurement
含氮量
N content
(mg)
离子流强度
Ion current intensity
m/ z 28
(V)
离子流强度
Ion current intensity
m/ z 29
(V)
测定值
15N atm1 %
measured values
4 3112 7134 1116
2 1165 3188 1116
1 0184 1196 1115
1 3 2137 5148 1116
018 0160 1138 1114
018 3 1155 3159 1115
014 0141 0194 1113
014 3 1103 2137 1114
　　3 压缩可变容积储样器 ,增大进样量。3 Sample container volume was compressed and sample amount was increased.
214 　进样系统中的记忆效应
在同位素质谱分析中 ,记忆效应系指一个新样品的分析结果 ,受到残留在进样管道中分析
过样品的影响。这一效应在某些分析中表现比较严重。毛细管进样系统管路长 ,管径较细 ,对
气体的吸附面积大 ,样品气体抽净比较困难 ,可能会存在明显的记忆效应。表 4 的试验结果证
实了这一点 ,特别相邻两次分析丰度相差悬殊时记忆效应尤为严重。例如在处理 3 中 ,第 1 次
进了15N 丰度为 10105 的样品以后 ,需连续进样测定 3 次自然丰度的样品才能消除它的影响。
克服记忆效应的办法 ,可以是增长抽气时间 ,或是按样品的估计丰度从低依次测定。一般说
来 ,由记忆效应引起的样品间交叉污染问题是稳定同位素分析中必须注意的问题。
982　5 期 用单路三束质谱法测定生物样品的15N 丰度
表 4 　进样系统中的记忆效应
Table 4 　Memory effect in input system
处理
Trea2
tment
第 1 次进样
First input
已知丰度
Known 15N %
第 2 次进样
Second input
已知丰度
Known 15N %
测得丰度
Measured 15N %
第 3 次进样
Third input
已知丰度
Known 15N %
测得丰度
Measured 15N %
第 4 次进样
Fourth input
已知丰度
Known 15N %
测得丰度
Measured 15N %
1 1116 01363 01367 01363 01363 - -
2 2134 01363 01375 01363 01363 01363 01363
3 10105 01363 01413 01363 01367 01363 01363
通过对 Finnigan MA T - 251 质谱计的数据采集和处理系统的更新改造 ,现在既可以贮存
测量的数据 ,又能对单路或双路的测量方式进行选择 ,达到了可用单路三束法测定生物样品
15N 丰度的目的。经过多种条件下的方法试验 ,证实该测量方法精确可靠 ,特别用于精确地测
定低丰度的15N 示踪样品 ,将会更加有利15N 示踪技术在生物学和农学中的广泛应用。
致谢 :四川联合大学分析测试中心潘万德和张峡老师参与了此项目的改造工作 ,谨此谢意。
参 考 文 献
1 　Boutton TW , Yamasaki S2i :Mass Spestrometry of Soils. Marcel Dekker , Inc. 1996 ,1～46
2 　曹亚澄. 质谱测定15N 的方法. 土壤 ,1978 ,6 :229～235
3 　曹亚澄. 稳定性同位素15N 示踪原子法. 北京 :原子能出版社 ,1992. 106～127
4 　曹亚澄 ,等. 土壤中不同含氮组份的δ15N 质谱测定法. 土壤通报 ,1993 ,24 (2) :87～90
DETERMINATION OF 15 N ABUNDANCE IN BIOTIC SAMPL ES
BY MASS SPECTROMETER WITH SINGL E
WAY AND THREE BEAMS
Sun Deling 　Cao Yacheng 　Sun Guoqing
( Instit ute of Soil Science , Academia Sinica Cent re of Soil and Envi ronment A nalysis Nanjing 　210008)
ABSTRACT
Data acquisition and treatment system of Finnigan MAT model 251 mass spectrometer has
been remade , and it can determine 15 N abundance of biotic samples with single way and three
beams. Precision , accuracy , sample amount and memory effect of this method has been tested.
It is conf irmed that this method is exact and rel iable.
Key words :15N abundance , determination , mass spectrometer
092 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (5) :285～290