全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 052773205
辐照对糖多孢红霉菌 M 的诱变效应
庄　韬1 ,2 　刘　超2 　武杉杉1 ,2 　黄训端1 　张部昌1 　曹　磊2 　张福生2 　汪晓鸣2
(11 安徽大学生命科学学院 ,安徽 合肥　230039 ; 21 安徽省农业科学院原子能应用研究所 ,安徽 合肥　230031)
摘 　要 :采用不同剂量的60 Coγ射线辐照糖多孢红霉菌 M 孢子 ,并采用不同的菌种保护剂 ,以研究60 Coγ
射线对糖多孢红霉菌 M 的诱变效应。结果表明 ,使用 20 %甘油吐温保护效果较好 ,可作为诱变保护剂 ;
当辐照剂量为 400 Gy 时 ,致死率为 90 %左右可作为适宜诱变剂量。诱变处理后利用链霉素抗性突变选
育得到 1203 株链霉素抗性突变株。其中 5 株形态发生较明显的变化 ,形态变异率为 4116 ‰;2 株突变株
的发酵液具有抑菌活性 ,正突变率为 1167 ‰。
关键词 :60 Coγ射线 ;糖多孢红霉菌 M ;诱变效应 ;链霉素抗性
EFFECTS OF 60 Coγ2rays IRRADIATION ON Saccharopolyspora erythraea M
ZHUANG Tao1 , 2 　LIU Chao2 　WU Shan2shan1 , 2 　HUANG Xun2duan1
ZHANG Bu2chang1 　CAO Lei2 　ZHANG Fu2sheng2 　WANG Xiao2ming2
(11 School of Life Sciences ,Ahhui University , Hefei Anhui 230039 ; 21 Institute of Atomic Application in Agriculture ,AAAS , Hefei ,Anhui 230031)
Abstract :Spores of Saccharopolyspora erythraea M with different protective agents were treated with different doses of 60 Coγ2
rays irradiation , and their morphological variations were observed and mutants were selected. The results indicated that 20 %
glycerol ( contain 011 % tween220) showed a better protective effect to irradiation , and lethal ratio reached 90 % when
irradiation dose at 400 Gy , therefore 400 Gy was selected as the appropriate dose. 1203 strains were obtained by streptomycin
resistance screening , among them , 5 strains changed in their phenotype and 2 strain fermentation products had antibacterial
activity. The morphological variation rate was 4 ‰and positive mutation rate was 1167 ‰.
Key words :60 Coγ2rays irradiation ; Saccharopolyspora erythraea M ;mutagenic effect ;Streptomycin resistance
收稿日期 :2009202218 　接受日期 :2009204220
基金项目 :国家自然科学基金 (30670068) ,安徽省科技厅重点科研项目 (08020303057) ,安徽省教育厅自然科学基金 ( KJ2007A017)
作者简介 :庄　韬 (19842) ,男 ,安徽怀远人 ,硕士研究生 ,研究方向为基因工程。E2mail :boyangzhuang @1631com
通讯作者 :刘　超 (19632) ,男 ,安徽亳州人 ,研究员 ,主要从事作物辐射诱变育种和食品辐射加工的研究。Tel :055125311488 ; E2mail : hfliuchao @
tom. com
　　红霉素 (ethromycin , Er) 及其衍生物是临床上具有
广泛应用的一类广谱大环内酯类抗生素 ,第 1 代红霉
素易为酸降解及产生耐药性 ,已很少使用 ;通过化学修
饰改造的第 2 代红霉素可以克服红霉素酸降解的不
足 ,但依然无法克服耐药性[1 ] ;现在正在推向市场的第
3 代红霉素是以特利霉素 (telithromycin) [2 ,3 ]为代表的酮
内酯类抗生素 (ketolide) ,它也是使用化学修饰对红霉
素结构进行了改造。酮内酯类抗生素结构上最大特点
是在红霉素大环内酯的 C23 位用酮基取代了L2克拉定
糖 ,因酮内酯类抗生素的 C23 酮基能避免诱导出 MLSB 抗性 ,所以酮内酯类抗生素能大大提高对许多耐药性菌株的活性[4 ] 。目前可以使用基因工程的方法[5 ] 或基因工程改造结合化学修饰的方法[6 ]来合成第 3 代红霉素 ,然而经过基因工程改造以后的基因工程菌 ,其产物产量都普遍降低。张部昌等[7 ] 利用重叠 PCR 的方法去除糖多孢红霉菌 A226 基因组中的 KR6 酶域构建了糖多孢基因工程菌 M ,合成了 32脱氧232羰基2红霉内酯B (DOEB) ,它是一种新的酮内酯类化合物 ,但是产量很低。本试验利用诱变育种的方法研究60 Coγ射线对糖多孢红霉菌 M 的诱变效应 ,为筛选活性产物的高产菌
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株奠定基础。
目前在抗生素高产菌株选育中 ,诱变育种仍然是
普遍应用并且十分有效的方法。60 Coγ射线辐射诱变
既能获得较高的突变率和较宽的突变谱 ,有利于筛选
新的突变型。据统计 ,诱变育成的品种中使用60 Coγ
射线的占 75 %～8412 % ,目前用于工业化生产的抗生
素高产菌株几乎无一不是经过60 Coγ射线辐照诱变途
径得到的[8 ] 。研究发现利用60 Coγ射线辐照微生物可
以产生 AT →GC 的转换[9 ] ,这种转换可以增加代谢产
量[10 ] 。60 Coγ射线辐射诱变产生的高产变异菌株具有
遗传稳定性 ,经过多代培养后高产特性不降低[9～11 ] 。
由于人工的诱变方法所产生的突变是随机的 ,无
方向性 ,导致目标菌株筛选工作量大 ,直接影响了诱变
育种的工作效率。相对而言 ,有特定的作用靶位的抗
生素作为诱变育种的辅助手段用于微生物菌种的选
育 ,有一定的方向性 ,有利于加快突变体筛选工作的进
程。迄今为止 ,国内外γ射线辐射育种在糖多孢红霉
菌基因工程菌 M 中的应用未见报道。本试验以糖多
孢红霉菌 M 为原始菌株 ,根据分子育种中关于抗生素
产生菌抗性基因与抗生素合成的结构基因及调控基因
紧密连锁并易发生共突变的理论[12 ] ,尝试采用链霉素
抗性筛选法 ,结合传统γ射线诱变 ,筛选产物具有抑菌
活性的突变体。
1 　材料和方法
111 　材料
糖多孢红霉菌 A226 ( Saccharopolyspora erythraea
A226) , 试 验 所 用 诱 变 菌 株 糖 多 孢 红 霉 菌 M
( Saccharopolyspora erythraea M) ,枯草芽孢杆菌均由本
实验室保藏。
平皿及斜面培养基均为 R3M。R3M 基本组成为
蔗糖 103 g、K2 SO4 0125 g、酵母粉 4 g、胰蛋白胨 4g、
Casein Enzymatic Hydrolysates 4 g、琼脂粉 22 g、H2O 830
ml ,121 ℃灭菌 ,使用前融化并添加已分别灭菌的下列
溶液 : 215 molΠL MgCl2 20 ml , 50 % 葡萄糖 20 ml ,
215 molΠL CaCl2 20 ml , 2 molΠL TrisΠHCl (pH710) 1215
ml ,微量元素混合液 012 ml ,1 molΠL NaOH 5 ml ,015
molΠL KH2 PO4 0137 ml。其中的微量元素混合液每升含
40 mg ZnCl2 、200 mg FeCl3·6H2O、10 mg CuCl2·2H2O、10
mg MnCl2 ·4H2O、10 mg Na2B4O7 ·10H2O、10 mg
(NH4 ) 6Mo7O24·4H2O。发酵培养基 TSB 含 Tryptone Soya
Broth 3 %(WΠV) 。
112 　诱变条件的选择
11211 　菌种培养 　将糖多孢红霉菌 M 的孢子或菌丝
体 ,涂于 R3M 斜面培养基 ,30 ℃培养 5～10 d ,待孢子
成熟时放入 4 ℃冰箱备用。
11212 　孢子悬液的制备 　上述活化斜面加入 5～
10 ml 20 %甘油 (含 011 %吐温220)溶液或其他溶液 ,用
接种铲把斜面上的孢子层刮起 ,倒入放有玻璃球的厚
壁玻璃试管 ,用旋涡振荡器打碎孢子层块 ,使孢子完全
游离 ,再用过滤装置过滤制成单孢子悬浮液 ,取样计
数 ,用 20 %甘油稀释调整孢子浓度至 106 个Πml [13 ] 。
11213 　链霉素最小抑制浓度的确定 　将制备好的适
宜浓度孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的培
养基平板上 ,30 ℃培养 10 d。观察不同平板上的菌落
生长情况 ,未长菌落的最低作用浓度为链霉素对该菌
的最小抑制浓度 (MIC) 。
1. 2. 4 　保护剂及诱变剂量的选择[14 ] 　因实验室常使
用甘油及二甲基亚砜 (DMSO)作为保护剂保藏菌种 ,本
试验用 20 %甘油及 20 %DMSO 制备孢子悬液 ,以纯水
制备的孢子悬液为对照 ,研究在保护剂作用下的辐照
效应。选择适宜的保护剂 ,以在同一剂量辐照下能够
获得较多的突变体。
取 70 支灭菌的试管 ,每管分别装入新制备的 106
个Πml 的 M 孢子悬液 2 ml ,10 个为 1 组 ,共分为 7 组 ,
进行诱变处理。60 Coγ射线诱变在安徽省农业科学院
原子能应用研究所进行 ,辐照剂量分别为 0、100、200、
300、400、500 和 600 Gy ,剂量率 7137 GyΠmin。辐照后每
管取 1 ml 稀释适当的倍数后取 100μl 涂布于 R3M 培
养基。30 ℃培养 ,菌落计数。
113 　突变体的筛选
11311 　链霉素抗性突变体的分离 　适宜剂量辐照后
的孢子悬液稀释后分别取 100μl 涂布于含最小抑制浓
度的链霉素培养基平板 ,30 ℃培养 10 d ,生长出的菌落
即为链霉素抗性突变株。
11312 　液体摇管发酵 　将筛选到的抗链霉素突变体
转接到 R3M 小斜面上 ,待长出菌丝体或孢子时再转接
到盛有 5 ml TSB 发酵培养基的摇管 ,置旋转式摇床于
30 ℃,200 rΠmin 发酵 5 d。
11313 　抑菌试验筛选突变体 　发酵液经 10000 rΠmin
离心 10 min 去除菌丝体 ,取 10μl 上清液做枯草杆菌抑
菌试验 ,以糖多孢红霉菌 A226 发酵液为阳性对照。筛
选产物具有抑菌活性的突变体。
11314 　致死率和突变率的计算 　致死率 ( %) = (未经
诱变培养基中菌落总数 - 诱变培养基中菌落总数)Π未
经诱变培养基中菌落总数 ×100 % ;正突变率 ( %) = 诱
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变筛选具有活性产物的突变体的总数Π诱变筛选挑取
的菌落总数 ×100 % ;形态变异率 ( %) = 诱变筛选形态
发生明显变化的突变体的总数Π诱变筛选挑取的菌落
总数 ×100 %
2 　结果与分析
211 　诱变条件的选择
21111 　链霉素最小抑制浓度的确定　由表 1 可见 ,随
着链霉素浓度的增加 ,糖多孢红霉菌 M 在链霉素梯度
平板上 ,长出的单菌落数量逐渐减少 ,当链霉素浓度达
到 100μgΠml 以上时 ,平板上无单菌落形成 ,所以最小
抑制浓度为 100μgΠml。本实验采用 90μgΠml 的链霉素
抗性平板来筛选抗性突变株 ,以增大突变株筛选机率。
表 1 　链霉素的最小抑制浓度确定
Table 1 　The minimum inhibitory concentration
of streptomycin
链霉素浓度
streptomycin concentration (μgΠml) 菌落生长情况colony growth condition
0 +
50 +
60 +
70 ±
80 ±
90 ±
100 -
110 -
注 : + 代表生长良好 ; ±代表微弱生长 ; - 代表不生长。
Note : + means growth well ; ±means growth weakly ; - means nogrowth.
表 2 　突变菌株与原始菌株生理形态的变化
Table 2 　The changes in physiological pattern of the colony after irradiation
菌株
strains
孢子颜色
spore color
孢子成熟时间
time for spores mature (d)
可溶性色素
soluble pigment
菌落表面结构
surface structure of clone
菌落高度
height of clone
M
红褐色
reddish2brown 5～10 红褐色reddish2brown 松散、褶皱少loose ,few fold 边缘突起convex edge
250 红褐色
reddish2brown 5～10 红褐色reddish2brown 紧密、褶皱多close ,multi2folds 较高耸towering
G4 Ⅰ 土黄色
khaki
2～3 土黄色
khaki
较紧密、褶皱少
compact ,few fold
较平
explanate
G4 Ⅱ 土黄色
khaki
2～3 土黄色
khaki
较紧密、褶皱少
compact ,few fold
较平
explanate
963 鲜黄色
bright yellow
7～12 淡黄色
light yellow
很紧密、褶皱较多
tight ,many folds
中间高耸
middle taller
967 淡黄色
light yellow
7～12 鲜黄色bright yellow
很紧密、褶皱较多
tight ,many folds
中间高耸
middle taller
21112 　保护剂及诱变剂量的选择 　实验室菌种保藏
常用保护剂有甘油和二甲基亚砜 (DMSO) ,本试验使用
20 %甘油和 20 %DMSO 提取并稀释制备孢子悬液 ,以
纯水为对照 ,采用γ射线对原始菌株进行诱变处理 ,研
究这两种保护剂在辐照时对糖多孢红霉菌 M 孢子是
否有保护作用 ,并选择适宜的诱变剂量。所得孢子致
死效应曲线见图 1。
图 1 　辐照与糖多孢红霉菌 M致死率的关系
Fig. 1 　Relationship between irradiation and lethal
rate of s. erythraea M
结果表明 ,M 菌株对γ射线是敏感的 ,不同剂量γ
射线对 M 菌株均有致死作用 ,且致死率与剂量成正
比 ,即随剂量增大细胞致死率提高。同一辐照强度下
以 20 %甘油为保护剂的孢子致死率最低 ,选择 20 %甘
油作为本试验的适宜保护剂。
当剂量为 400 Gy 时 ,使用 20 %甘油为保护剂的致
死率达 9013 % , 当剂量为 600 Gy 时 , 致死率接近
100 %。因突变率随着辐照剂量的增加而增加 ,但过高
又会导致存活率的下降和正突变菌株的减少 ,因此选
择 400 Gy 作为本试验的适宜诱变剂量。
577　5 期 辐照对糖多孢红霉菌M的诱变效应
212 　突变株的筛选
图 4 　突变菌株的形态变异
Fig. 4 　Morphological changes of mutants
21211 　链霉素抗性突变株的筛选 　原始菌株经辐照
强度为 400 Gy 的γ射线照射后 ,在链霉素浓度为 90
μgΠml 的 R3M 抗性平板上 ,挑取了 1203 株抗性突变
株 ,经筛选有 2 株突变菌株 (963 ,967) 的发酵产物具有
抑菌活性 ,结果如图 2 所示。其正突变率为 1167 ‰。2
株突变株的抑菌活性物质 ,其结构和性质仍需进一步
测定。
图 2 　突变体与原始菌株的抑菌效果
Fig. 2 　Bacteriostatic effect of mutants and parent strain
M:出发菌株 ;A226 :阳性对照 ;963、967 :突变株。下图同。
M:original stair ;A226 :Positive control ; 963 ,967 :mutants.
The same as following figure
21212 　突变菌株的遗传稳定性 　用群体传代法考察
筛选到的产物具有活性的突变株的斜面稳定性 ,将突
变菌株 963、967 在斜面上连续培养 5 代 ,各代菌株的
产孢时间、孢子颜色基本一致。对各代菌株进行发酵
培养 ,产物均有抑菌活性 ,如图 3 ,结果表明菌株 963、
967 两菌株均具有较好的遗传稳定性。
21213 　辐照引起的生理形态的变化 　观察链霉素抗
性平板上筛选到的抗性突变菌株以及普通 R3M 平板
上的诱变菌株的生理形态 ,经过γ射线辐照之后的存
活菌株大部分生理形态没有发生明显的变化 ,其中 5
株链霉素抗性突变体的生理形态发生较大变化 ,如图
4 和表 2。结果说明 ,γ射线辐照结合链霉素抗性平板
筛选抗性突变株明显提高了形态变异率 ,形态变异率
为 4116 ‰。菌株生理形态变化主要表现为 :孢子颜色 图 3 　突变株的产物活性稳定性Fig. 3 　Stability of mutants及成熟时间的变化、可溶性色素的变化、菌落表面结构和菌落高度的变化。其中产物具有活性的突变株963、967 与原始菌株相比质地较坚硬 ,褶皱增多 ,菌落高度增加。3 　结论与讨论γ射线诱变育种是用于筛选工业化生产的抗生素高产菌株的普遍方法。在本诱变效应的研究中 ,使用20 %甘油作为保护剂进行诱变 ,能够降低辐照致死率 ,既有利于筛选突变菌株 ,又有利于菌种的保藏。利用400 Gy 60 Coγ射线对糖多孢红霉菌 M 孢子进行诱变后采用 90μgΠml 链霉抑制浓度为标记 ,筛选出大量链霉
677 核　农　学　报 23 卷
素抗性突变体 ,然后通过液体发酵复筛 ,得到产物具有
抑菌活性的突变菌株 2 株 (963 ,967) ,正突变率达到
1167 ‰。
观察诱变对菌株生理形态及遗传稳定性的影响 ,
发现γ射线诱变结合链霉素抗性筛选的方法使 M 菌
株的形态变异率达到 4116 ‰,而且通过γ射线诱变得
到的突变菌株具有良好的遗传稳定性 ,在一定程度上
克服了诱变随机筛选的盲目性和不定向性 ,大大减轻
了筛选的工作量 ,提高了菌种选育的工作效率。
通过链霉素抗性筛选法辅助选育高产抗生素菌株
已有很多成功的范例[15 ,16 ] ,抗生素的生物合成通常在
营养生长和形态分化的过渡时期内进行 ,菌体形态分
化和产抗生素的开始往往伴随鸟苷四磷酸 (pp Gpp) 的
激增 ,充分表明 pp Gpp 是次级代谢起始的重要信号因
子 ,对抗生素生产的启动有重要作用[17 ] 。Kelly 等[18 ]
发现 Streptomyces coelicolor 的 relC 基因缺失突变株失去
产生抗生素的能力 ,可以通过获得链霉素抗性突变而
得到恢复 ,而没有伴随 pp Gpp 的积累 ,这表明链霉素抗
性基因可能和抗生素结构基因或调控基因存在着一定
的连锁关系。进一步研究发现 ,该链霉素抗性突变与
编码核糖体蛋白 S12 的 rpsL 基因或其他基因发生突变
导致核糖体或核糖体蛋白发生改变发生有关[19 ] 。这
也从理论上支持了采用链霉素抗性突变筛选方法高频
率选育高产菌的可行性。本试验采用链霉素抗性突变
筛选法与不使用链霉素筛选突变体之间变异率的差异
需进一步研究。
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