全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012030204
植酸对霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞
生长和多糖合成的影响
魏　明　姜绍通　罗建平
(合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009)
摘 　要 :研究了植酸对霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞生长、多糖合成和培养基中主要营养成分消耗的
影响 ,并分析了细胞中可溶性还原糖、可溶性蛋白质、丙二醛含量以及过氧化物酶和多酚氧化酶的活性。
结果表明 ,植酸能抑制过氧化物酶和多酚氧化酶的活性 ,提高细胞活力 ,从而促进细胞生长和多糖合成 ,
以 215gΠL 浓度的植酸效果最好 ,培养 36d 时 ,类原球茎干重为 2914gΠL , 多糖产量为 2106gΠL。动力学分
析表明 ,添加 215gΠL 的植酸还有利于碳、氮、磷等营养物质的吸收。
关键词 :霍山石斛 ;类原球茎 ;悬浮培养 ;植酸 ;多糖
EFFECT OF PHYTIC ACID ON CELL GROWTH AND PRODUCTION OF POLYSACCHARIDES IN
SUSPENSION CULTURES OF PROTOCORM2LIKE BODIES FROM Dendrobium huoshanense
WEI Ming 　J IANG Shao2Tong 　LUO Jian2Ping
( School of Biotechnology and Food Engineering , Hefei University of Technology , Hefei ,Anhui 　230009)
Abstract :The effect of phytic acid on cell growth , accumulation of polysaccharides and nutrient utilization were investigated in
suspension cultures of protocorm2like bodies from Dendrobium huoshanense and the contents of reducing sugars , soluble
protein , malondialdehyde , the activities of peroxidase and polyphenol oxidase were analyzed. The results show that phytic acid
could greatly inhibit the activity of peroxidase and polyphenol oxidase of protocorm2like body cultures and increase cell
activity. Phytic acid could improve the cell growth and production of polysaccharides. Phytic acid was beneficial to the
absorption of carbon , nitrogen and phosphorus source. The medium supplemented with phytic acid 215gΠL was the most
suitable for protocorm2like body suspension culture. After 36 days culture the cell dry weight and production of polysaccharides
reached 2914gΠL and 2106gΠL , respectively.
Key words : Dendrobium huoshanense ; protocorm2like bodies ; suspension culture ; phytic acid ; polysaccharides
收稿日期 :2006203223
基金项目 :教育部科学技术研究重点项目 (NO :03098)
作者简介 :魏　明 (19692) , 男 , 安徽合肥人 , 博士研究生 , 研究方向为药用植物生物技术 ,E2mail : wmrainbow @sohu. com
通讯作者 :姜绍通 (19642) ,男 ,教授 ,博士 ,主要从事果树教学与科研工作 ,E2mail : jiangst @hfut . edu. cn　　霍山石斛 ( Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S.J . Cheng)属于兰科石斛属 ,产于安徽霍山地区 ,是名贵中草药 ,含有水溶性活性多糖、生物碱等多种化学成分 ,具有滋阴、清热、生津、润肺、止咳、清音明目等功效[1 ,2 ] 。现代药理研究证明 ,石斛多糖具有调节机体免疫功能、显著提高机体杀伤肿瘤细胞的能力[3 ,4 ] 。由于霍山石斛自然繁殖能力很低 ,在自然条件下生长缓慢、生长周期长 ,加上人工大量采集 ,其自然资源已濒临灭 绝。类原球茎是霍山石斛的体细胞胚胎 ,可由植株的不同部位诱导产生 ,具有和植株同样的物质代谢和形态发育潜能[5～7 ] ,且生长速度快。霍山石斛类原球茎的悬浮培养液 ,一方面可以用于霍山石斛试管苗的快速繁殖 ;另一方面可以用来代替原药材生产相关的活性物质。霍山石斛类原球茎悬浮培养周期较长 ,在培养过程中 ,培养物常常会遇到褐变 ,使细胞生长缓慢。提高
03　 核 农 学 报　2007 ,21 (1) :30～34Journal of Nuclear Agricultural Sciences
霍山石斛类原球茎的细胞活力 ,加快其生长是实现霍
山石斛类原球茎大规模培养的基础。植酸具有抗氧化
性和调节植物细胞生长等功能 ,本文通过研究植酸对
霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞生长和多糖合成的影
响 ,分析细胞中多酚氧化酶和过氧化酶的活性变化以
及培养基中主要营养成分的消耗规律 ,为解决霍山石
斛类原球茎增殖缓慢问题提供实验依据。
1 　材料与方法
111 　试验材料
霍山石斛类原球茎由本实验室诱导保存 ,在无激
素固体 MS 培养基中继代培养 ,继代周期为 30d ,生长
培养基为改良的 MS 培养基 ,其中微量元素、有机元素
减半 ,大量元素 : KNO3 30mmolΠL、MgSO4·7H2O 115mmolΠ
L , KH2 PO4 215mmolΠL , CaCl2 ·2H2O 415mmolΠL ,蔗糖浓
度 30gΠL。
112 　类原球茎悬浮培养条件
取生长 30d 的类原球茎接种于装有 60mL 液体培
养基 (pH为 518) 的 250mL 三角瓶中 ,接种量为 100gΠL
(鲜重) ,干重约 6gΠL ,置于摇床上 (110 rΠmin) , 25 ℃±
2 ℃下悬浮培养。光照周期为 14hΠd ,日光灯 ,光强为
80μmolΠm2 s ,植酸的浓度分别取 0、015、215、5gΠL ,每 6d
随机取样进行分析 ,培养 36d。
113 　分析方法
培养结束后 ,收获的类原球茎用蒸馏水洗 2 次 ,滤
纸吸干其表面的水分后 ,称重为湿重 ,把类原球茎置于
60 ℃烘箱中烘至衡重为干重。提取多糖时 ,研碎原球
茎后 ,用蒸馏水在 50 ℃～60 ℃水浴上提取 3 次 ,收集水
提液和培养液合并 ,加 95 %乙醇至乙醇浓度为 80 %过
夜沉淀 ,最后收集沉淀。沉淀溶于蒸馏水中用 savage
法脱蛋白 ,并用苯酚2硫酸测定多糖[8 ] 。可溶性还原糖
用还原糖法测定 ,培养基中的蔗糖用蒽酮2硫酸法测
定 ,磷酸根离子用磷钼蓝法测定 ,硝酸根离子用水杨酸2浓硫酸法测定[9 ] 。可溶性蛋白质用考马斯亮蓝法测
定[10 ] ,丙二醛用 TBA 法测定[11 ] 。
多酚氧化酶活性测定 :取 10g 类原球茎 (鲜重) ,加
0105molΠL 磷酸盐缓冲液 (pH 618) 提取粗酶液。反应
总体积为 3mL , 其中底物为 0102molΠL 的邻苯二酚
115mL ,粗酶液 011mL ,pH 618 磷酸缓冲液 114mL ,在
290nm下测定吸光值的变化。酶活力定义为 :每分钟
每克鲜重吸光值变化 01001 为一个酶活单位。
过氧化物酶活性以愈创木酚法测定 :同上方法提
取粗酶液。反应总体积为 3mL ,其中底物为 0105molΠ
L ,愈创木酚 110mL , H2O2 (2 %) 110mL ,粗酶液 011mL ,
pH618 磷酸盐缓冲液 019mL ,在 470nm 下测定吸光值
的变化。酶活力定义同上。
类原球茎生物量 = 收获类原球茎的总干重Π接种
时培养基体积 (gΠL)
类原球茎的比生长速率 　μ = 1X
dX
dt ( d
- 1 )
　　式中 ,X 为生物量。多糖总产量为多糖总提取量
(gΠL) ,所有试验重复 2～3 次。
2 　结果与分析
211 　植酸对霍山石斛类原球茎生长和多糖合成的影
响
植酸在植物体内参与生物合成 ,对植物细胞的生
长和代谢产物的合成起刺激作用[12 ] ,还起第二信使的
作用[13 ,14 ] 。由表 1 可知 ,添加植酸能促进霍山石斛类
原球茎的生长和多糖的合成 ,215gΠL 的浓度效果最好 ,
此时比生长速率最大 ,培养 36d 时生物量和多糖产量
分别为 2914gΠL (干重)和 2106gΠL。
表 1 　植酸对霍山石斛类原球茎生长和多糖合成的影响
Table 1 　The effect of phytic acid on growth and
accumulation of polysaccharides in suspension cultures of
procotorm2like bodies from D . huosahanense
植酸
phytic acid
(gΠL) 生物量biomass(gΠL) 多糖产量polysaccharideproduction (gΠL) 比生长速率μspecific growthrate (d - 1)
0 2613c ±0164 1162c ±0108 01047c ±01001
015 2812b ±110 1196b ±0112 01051b ±01002
215 2914a ±0126 2106a ±0116 01053a ±01001
510 2818ab ±0172 1198b ±0124 01051b ±01003
注 :表中同一列的数据中有相同字母者表示差异不显著 ( p = 0105) ,下
表同。μ= 1X
dX
dt ( X 为生物量)
Note :The same letter in the same column indicated that the difference was not
significant at p = 01051The same as following Tables.
212 　植酸对胞内可溶性还原糖、可溶性蛋白质和丙二
醛含量的影响
胞内还原性糖、蛋白质及丙二醛的含量与细胞生
理活性有一定的关系。细胞生长快 ,胞内可溶性蛋白
质含量高 ;丙二醛是植物脂质过氧化作用的产物 ,它常
被作为植物脂质过氧化程度的指标 ;胞内可溶性还原
糖在细胞的整个代谢中起着重要作用[15 ] ,它一方面提
供细胞生长 ,另一方面用来合成多糖 ,胞内可溶性还原
糖含量高 ,细胞生长快 ,多糖积累也多。从表 2 可以看
13　1 期 植酸对霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞生长和多糖合成的影响
出 ,添加植酸时 ,胞内可溶性还原糖、可溶性蛋白质的
含量高于对照组 ,而丙二醛含量低于对照组 ,所以 ,植
酸可以提高霍山石斛类原球茎的生理活性 ,促进细胞
生长及代谢产物的合成 ,抑制植物脂质的过氧化。
表 2 　植酸对胞内还原糖、可溶性蛋白质及丙二醛含量的影响
Table 2 　The effect of phytic acid on contents of
intracellular reducing sugar , soluble protein
and malondialdehyde
植酸
phytic acid
(gΠL) 还原糖reducing sugars(mgΠg) 蛋白质protein(mgΠg FW) 丙二醛malondialdehyde[ nmolΠ(g FW) ]
0 4612d ±215 3162d ±0113 4312c ±211
015 4915c ±117 4137c ±0122 2914b ±112
215 5611a ±314 5126a ±0117 2116a ±019
510 5415b ±115 4172b ±0145 2013a ±117
213 　植酸对细胞中过氧化物酶和多酚氧化酶的活性
影响
植酸可作为抗氧化剂抑制过氧化物酶和多酚氧化
酶的活性[16 ] 。由表 3 可知 ,植酸能明显抑制培养物中
过氧化物酶和多酚氧化酶的活性 ,当植酸浓度为 215gΠ
L 时 ,过氧化物酶和多酚氧化酶活性最低。过氧化物
酶催化过氧化氢氧化酚类物质 ,产物为醌类物质。多
酚氧化酶则催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌类物
质。醌类物质的积累会抑制细胞中多种酶的活性 ,使
细胞生长受到抑制。添加植酸可以抑制这两类酶的活
性 ,防止细胞衰老 ,从而促进细胞生长和多糖的合成。
表 3 　植酸对多酚氧化酶和过氧化物酶活性的影响
Table 3 　The effect of phytic acid on activities
of polyphenol oxidase and peroxidase
植酸浓度
phytic acid
concentrations (gΠL) 多酚氧化酶活性activity of polyphenoloxidase (U) 过氧化物酶活性activity of peroxidase (U)
0 1016c ±112 518c ±0124
015 516b ±013 410b ±0186
215 411a ±0145 218a ±0128
510 513b ±0156 318b ±0178
214 　植酸对霍山石斛类原球茎悬浮培养的动力学影
响
21411 　对细胞生长和多糖合成的动态影响 　图 12A
表示了植酸对霍山石斛类原球茎生长的影响 ,与对照
相比 ,添加植酸时 ,类原球茎生长较快 ,其中 215gΠL 的
植酸浓度下 ,类原球茎生长最快 ,生物量也最大。由图
12B 可知 ,在 215gΠL 的植酸浓度下 ,多糖合成速度最
快 ,18d 左右就达最大值 ,且产量较高 ,而不添加植酸
时 ,24d 左右才达最大值 ,且产量较低。
图 1 　植酸对霍山石斛类原球茎生长 (A) 和多糖合成 (B) 的动态影响
Fig. 1 　Kinetics of cell growth (A) and accumulation of polysaccharides (B) in suspension cultures
of protocorm2like bodies D . huoshanense by adding phytic acid
21412 　对培养基中养分消耗的影响 　在培养过程中 ,
营养物质的消耗主要用于细胞自身的增殖和产物的合
成 ;培养基中主要的营养物质是碳源和氮源 ,磷酸盐也
是细胞生长所必需的。图 22A、B、C 分别表示了不同
植酸浓度下霍山石斛类原球茎培养过程中培养基中
糖、硝酸盐和磷酸盐的消耗动态。
在植物细胞培养过程中 ,碳源主要为蔗糖 ,其作用
是提供细胞代谢过程中所需要的能量及细胞组分与代
谢物的碳骨架。由图 22A 可以看出 ,糖的消耗与生物
量的积累密切相关 ,在 215gΠL 植酸浓度下 ,类原球茎
生长速度快 ,糖的吸收快 ,利用率也高 ,培养 30d 时 ,培
养基中的糖几乎被耗尽 ;而不加植酸时 ,类原球茎对糖
的吸收较慢 ,培养 30d 时 ,培养基中的糖浓度为 5gΠL
左右。添加植酸时 ,细胞生理活性较强 ,一方面 ,类原
球茎细胞分裂旺盛需要大量的碳源供应生长 ,另一方
面 ,此时较强的多糖合成能力也需要大量碳源 ;而不加
23 核　农　学　报 21 卷
植酸的类原球茎细胞活力较低 ,生长较慢 ,对糖的吸收
迟 ,糖需求量低。
氮源在培养基中的作用是合成蛋白质和核酸等细
胞物质 ,蛋白质是细胞膜等结构组分的重要成分。图
22B 显示 ,添加 215gΠL 植酸时 ,类原球茎吸收氮源的速
度最快 ,利用率也最高 ,而不加植酸时 ,则吸收氮源的
速度最慢 ,利用率也最低。
磷在细胞中是构成核酸、磷脂的成分 ,同时也用于
合成高能磷酸化合物 ,对细胞的能量代谢进行调节。
如图 22C 所示 ,由于磷被大量用于合成结构性成分 ,所
以在延滞期 ,磷的消耗非常迅速 ,在 215gΠL 植酸时的
类原球茎尤为突出 ,细胞对磷的吸收较快 ,在第 18d
时 ,磷几乎全部被吸收 ,而不加植酸的类原球茎吸收磷
较慢 ,30d 才完全被吸收。
由以上分析可知 ,添加一定量的植酸可以促进营
养成分特别是碳、氮的吸收和利用 ,这和类原球茎的快
速生长相对应 , 类原球茎的生长量越大 ,消耗的营养
成分也越多。
图 2 　霍山石斛类原球茎培养过程中培养基主要营养成分碳 (A) 、氮 (B) 、磷 (C) 的消耗动态
Fig. 2 　Kinetics of depletion of main ingredients in medium including sugar (A) , nitrate (B) , phosphate (C)
in suspension cultures of protocorm2like bodies from D . huoshanense
　　在霍山石斛类原球茎悬浮培养过程中 ,细胞经常
会分泌一些酚类物质到培养基中 ,这是造成类原球茎
生长缓慢的主要原因之一 ,有研究表明 ,在培养基中加
一些还原剂可以部分解决这些问题。本研究表明 ,植
酸作为天然抗氧化剂加入到培养基中去 ,可以明显抑
制多酚氧化酶和过氧化物酶的活性 ,有效控制细胞的
褐变 ,提高细胞活力 ,促进霍山石斛类原球茎生长和多
糖的合成。
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