全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 032193204
60 Coγ射线诱变黑曲霉菌株产植酸酶的研究
杨平平　王　燕　陶文沂
(江南大学生物工程学院 ,工业生物技术教育部重点实验室 ,江苏无锡　214036)
摘 　要 :研究了60 Coγ射线对黑曲霉 447292 菌种产植酸酶的诱变效应 ,筛选出产植酸酶较高的
A . niger 49621 菌株 ,并初步分析了其植酸酶的基本性质。
关键词 :60 Coγ射线 ; 黑曲霉 ; 诱变效应 ; 透明圈
SCREENING OF MUTANT STRAINS PRODUCING PHYTASE FROM A. niger
BY 60 Coγ2RAY IRRADIATION
YANG ping2ping 　WANG yan 　TAO wen2yi
( School of Bio2tech . , Key Lab of Industrial Biotech , Ministry of Education , Southern Yangtze University , Wuxi ,Jiangsu , 214036)
Abstract :60 Coγ2ray was used to irradiate Aspergillus niger 447292 for screening the mutant strain of producing
phytase , and the effects of mutation induction were determined and analyzed. A mutant strain A . niger 49621 with
high level of phytase was selected , the phytase properties of A . niger 49621 were analyzed.
Key words :60 Coγ2ray ; Aspergillus niger ; inductive effect ; clearing zones
收稿日期 :2002210208
作者简介 :杨平平 (1961～) ,男 ,博士研究生 ,副研究员 ,研究方向为微生物菌种改造及发酵工程 ,现工作单位 :山东省农业科学院。
植酸及其盐类广泛存在于植物组织及相应的粮食中 ,植物中总磷的 60 %～80 %以植酸盐的形式存
在 ,这种形式的磷不能被单胃动物所利用[1 ] 。正因如此 ,饲料中需要添加动物可以吸收的无机磷 ,不仅
大大提高了成本 ;而且不被动物吸收的植酸排出体外严重污染水源和土壤 ;植酸还可与多价阳离子结合
形成不容性的复合物 ,降低无机物和微量元素的生物利用率 ,它与纤维素、蛋白质、氨基酸等结合影响动
物对该类物质的吸收[2～4 ] 。
植酸酶是催化植酸及其盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称 ,植酸酶可有效降解植物中植酸为
有用的物质 ,从而大大提高农产品的综合利用、饲料的营养价值及减少环境污染。某些微生物有分泌植
酸酶的能力 ,利用微生物发酵工程生产植酸酶已在饲料工业中得到应用 ,并取得了一定成效。但也存在
一些问题 ,主要是植酸酶活力不高或微生物植酸酶产量较低[5 ,6 ] 。本研究旨在用60 Coγ射线诱导并筛选
出新的黑曲霉高产植酸酶突变菌株。
1 　材料和方法
111 　材料
菌种为本实验室保藏的植酸酶突变株 A . niger 4472920。斜面培养基为察氏培养基 ;平板筛选培养
基 A 成分 ( gΠ100ml ) : 葡萄糖 115 , MgSO4 ·7H2O 0105 , KCl 0105 , MnSO4 ·7H2O 01001 , NH4NO3 015 ,
FeSO417H2O 01001 ,植酸钙 015 ,K2 HPO4 0106 ,琼脂 215 ,pH515 ;平板筛选培养基 B 成分 (gΠ100ml) :葡萄糖
115 ,MgSO4·7H2O 0105 , KCl 0105 ,MnSO4 ·7H2O 01001 ,NH4NO3 015 , FeSO4 ·7H2O 01001 ,植酸钙 015 ,琼脂
391　核 农 学 报　2004 ,18 (3) :193～196Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
215 , pH 515 ;摇瓶培养基成分 (gΠ100ml) :葡萄糖 310 ,NH4NO3 012 ,MgSO417H2O 0105 , KCl 0105 ,MnSO4 ·
7H2O 010005 ,FeSO4·7H2O 010005 ,K2 HPO4 0106 ,pH 515。
植酸钠为测酶活的底物 ,购自 Sigma 公司。植酸钙为化学纯 ,其余试剂均为分析纯。HYG2Ⅱ回转式
恒温调速摇瓶柜 ,立式圆形压力蒸气灭菌器 LS2B50L 型 ,电子天平 FA1004 , HH24 数显恒温水浴锅 ,721
型分光光度 ,酶标仪 (BIO RAD 35502UV) ,60 Co 辐射处理由江南大学辐射中心提供。
112 　方法
11211 　菌种分离 　分别取上述菌种直接在固体察氏培养基平板上划线 ,30 ℃培养 4～5d ,挑取单菌落转
接斜面 ,培养 4～5d 放入 4 ℃冰箱备用。
11212 　孢子悬浮液的制备 　从上述活化斜面挑取孢子 1 环 ,接入盛有 100ml 生理盐水的带玻璃珠三角
瓶中 ,在震荡器上震荡 1 h ,经脱脂棉过滤 ,制成单孢子悬浮液 ,取样计数调整孢子浓度至 108 个Πml。
11213 　60 Coγ射线诱变处理 　取 15 支灭菌的试管 ,每管分别装入新制备的 108 个Πml 的 A1 niger 447292
孢子悬浮液 5ml。每 3 个为 1 组 ,共分为 5 组。辐射剂量分别 0、388、581、775 和 969Gy。然后每管取 1ml
适当稀释后取 80μl 涂布于筛选培养基 B 培养皿。培养皿置 30 ℃恒温箱中培养。待培养皿中长出菌落
后 ,菌落计数。每组以 3 个皿菌落数的平均值作为该组的菌落数。另各取 80μl 孢子悬液涂布于筛选培
养基 A 培养皿内 ,置 30 ℃恒温培养箱培养 ,第 3d 测量透明圈的大小。
11214 　液体摇瓶发酵 　将筛选出的高产菌株 ,每支斜面接种至盛有 100μl 发酵培养基的摇瓶 ,接种量
为 1 环 ,置旋转式摇床 30 ℃,160rΠmin 发酵 4～5d。
11215 　植酸酶活力测定 　发酵液经 4000rΠmin 离心去除菌体 ,上清液利用截留分子量 10 ,000Da 的透析
袋在无离子水中透析 1h 得到去除无机磷的酶液 ,将 10μl 酶液 (以 10μl 灭活酶液或无离子水为对照) 加
入到装有 190μl 含有 1mmolΠL 植酸钠的 pH 515 0125molΠL 的乙酸2乙酸钠缓冲液的微板孔中混匀 ,然后加
入 150μl 钼钒定磷试剂 ,用酶标仪在 405 nm 处测定 OD 值 ,利用无机磷标准曲线计算出酶活力。在
37 ℃,pH 515 的乙酸2乙酸钠缓冲液中每 min 释放 1μmol 的无机磷作为 1 个酶活力单位。
11216 　微板培养筛选法 　将 (产生透明圈) 单菌落斜面分别进行微板培养 ,并在 10 h 测定无机磷的含
量 ,筛选出较高产菌株 ,每批初筛选 5 %高产酶活菌株 ,对这 5 %菌株进行重复实验 ,酶活仍然高于出发
菌株的定为正突变株。
11217 　致死率和突变率的计算
致死率 ( %) = (未经诱变菌液筛选培养基 A 中菌落总数 - 诱变筛选培养基 A 中菌落总数)Π未经诱
变菌液筛选培养基 A 中菌落总数 ×100 %
正突变率 ( %) = 诱变筛选培养基 B 培养皿中酶活力增加的菌株总数Π诱变筛选培养基 B 培养皿中
筛选的菌株总数 ×100 %
2 　结果与讨论
211 　60 Coγ射线诱变效应及诱变剂量的选择
由表 1 可见 ,不同剂量γ射线对 A . niger 447292 菌株均有致死作用 ,且致死率与剂量成正比 ,即随剂
量增大细胞致死率提高。当剂量为 581Gy 时 ,细胞致死率达 40174 % ,而剂量为 969Gy 时 ,致死率高达
98 %以上。
表 1 　不同辐射剂量对黑曲霉 447292 的致死率的影响
Table 1 　Effect of irradiation on death rate of A . niger 447292
剂量
radiation dose ( Gy) 0 388 581 775 969
活细胞
alive cell (cell No.Πml) 114 ×108 1110 ×108 8130 ×107 4149 ×107 1175 ×106
致死率 death rate ( %) 0 21134 40174 6719 98175
491 核　农　学　报 18 卷
表 2 　酶活力相对较高的突变株
Table 2 　The mutant of higher phytase activities
菌株
strains
49621 48626 5210 48623 5318
酶活性
enzyme activity(UΠml) 214 194 166 187 115
表 3 　传代对诱变株的产酶量的影响
Table 3 　The effect of the generations on stability
of phytase (enzyme activity UΠml)
世代
generation
1 3 7 12 average
A1 niger 49621 214 219 212 216 222
A1 niger 548626 194 190 194 191 192
A1 niger 5210 166 164 167 163 165
A1 niger 48623 187 185 189 184 186
A1 niger 5318 115 113 112 116 114　　黑曲霉菌 447292 经γ射线辐射后 ,黑曲霉突变率上升到 10 - 2 (图 1) 。由图 1 可见 ,γ射线诱变黑曲霉产生植酸酶是有效的 ,随辐射剂量增加突变率也增加 ,当剂量略大于半致死剂量为 775Gy 时 , A . niger477292 的植酸酶产酶能力正突变率最高 ,为1196 ×10 - 2 。以后辐射诱变剂量均用 775Gy。212 　诱变株的初筛和复筛以 A . niger 477292 为出发菌株 ,按上述剂量进行诱变 ,共诱变了 20 批 ,每批稀释后涂布于筛选培养基 B 的培养皿中。等出现菌落后 ,挑选单菌落接入斜面。利用微板法进一步筛选 ,在 17195 个菌株中选取产量较高的 400 株菌株 ,再利用微板法进行复筛 ,最后发现 337 株
菌株增产显著 ,确定为突变株。将 337 突变株
中酶活力超过出发菌株 20 %以上的 103 株突变株进行摇瓶发酵实验。其中有 5 株突变株酶活力超过
100UΠml ,结果见表 2。由于黑曲霉为多核真菌 ,其诱变菌株的性状常常不稳定 ,尤其是在连续传代时。
为了检测所得突变株的性状是否稳定 ,将上述五株诱变株经多代转接 ,其产酶能力基本保持稳定 ,结果
见表 3。由表 2 可知 ,有 4 株产酶能力比较强 ,其中 A . niger 49621 产酶能力最强 ,遗传性状稳定。
213 　植酸酶的酶学性质初步研究
为了考察诱变获得的 A . niger 49621 菌株粗酶液中植酸酶的酶学性质 ,对其植酸酶的最适温度和最
适 pH进行了初步研究。
图 1 　辐射剂量与突变率的关系
Fig. 1 　Relationship between irradiation
dosage and mutation rate
图 2 　温度对植酸酶活力的影响
Fig. 2 　Effect of temperature
on activity of phytase
图 3 　反应 pH对酶活的影响
Fig. 3 　Effect of pH on activity of phytase
21311 　植酸酶的最适温度 　植酸酶作为饲料用途的
酶 ,饲料在加工过程中需经较高温度灭菌处理 ,植酸
酶的最适温度显得非常重要。将摇瓶发酵 4d 的发
酵液在 40～100 ℃温度下处理 5min ,测定植酸酶的酶
活力 (以原始发酵液的酶活为 100 %) ,结果见图 2。
从图中可以看出 ,温度在 40 ℃～60 ℃范围内 ,酶
的活力较高 ,稳定性好 ,当温度到达 60 ℃时 ,酶活仍
然很高 ,但此后酶活力会迅速下降。
21312 　植酸酶的最适 pH 　利用柠檬酸2Na2 HPO4 和
乙酸2乙酸钠两种缓冲液配制不同 pH 值的缓冲液 ,
591　3 期 60Coγ射线诱变黑曲霉菌株产植酸酶的研究
反应的酶底物植酸钠也采用其相对应 pH 值的缓冲液配制。测得不同 pH 值条件下的酶活力结果见图
3。从图中可以看出 ,植酸酶的最适 pH为 516 ,在 pH418～516 之间 ,酶活力均较高。
3 　结论
　　研究表明 ,不同剂量60 Coγ射线辐射对 A . niger 447292 菌株均有致死作用 ,而且致死率与辐射剂量
成正比关系 ,即随剂量增大细胞致死率提高。当剂量为 581Gy 时 ,细胞致死率达 40174 % ,而辐射剂量为
969Gy 时 ,其致死率高这 98 %以上。实验表明 ,通过60 Coγ射线诱变黑曲霉产生植酸酶是有效的 ,随剂量
增加突变率也增加 ,当剂量略大于半致死剂量为 775Gy 时 ,A . niger 477292 的植酸酶正突变率最大 ,为
1916 ×10 - 2 。并从中获得产酶量最高的突变株 A . niger 49621。经传代实验 ,该突变株具有稳定的遗传
性状。对 A . niger 49621 菌株的酶学性质研究表明 ,该酶反应的最适 pH 为 516 ,最适温度为 40 ℃。诱变
育种 ,获得正突变的概率较低 (本实验为 10 - 2 ) ,要想获得比较理想的高产植酸酶菌株 ,需要有足够大的
筛选群体 ,利用高通量的微板筛选方法 ,可以在短时间内从大量诱变菌株中有效地筛选出高产菌株。
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