全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062454206
低能氮离子束注入水稻的生物学效应研究
王松丽　黄群策　王铁固　秦广雍
(郑州大学离子束生物工程省重点实验室 ,河南 郑州　450052)
摘 　要 :利用能量为 25KeV 的氮离子束为诱变源 ,剂量分别为 210 ×1017 、215 ×1017和 310 ×1017 N + Πcm2 对
5 份水稻材料进行处理 ,从其后代群体中筛选得到变异株 ,并对其生物学效应进行研究。结果表明 ,变异
株的叶绿素含量均比对照植株高 ,最高达到 148167 %;3 种同工酶 (POD、SOD、CAT)的酶活力变化趋势不一
致 ,与对照均有明显差异 ;AFLP 分析表明 ,变异株与阴性对照条带相似率很高 ,与阳性对照相似率低。
关键词 :氮离子束 ;水稻 ;FHS ;叶绿素 ;同工酶 ;AFLP
STUDIES ON BIOLOGICAL EFFECTS OF LOW ENERGY N+ ON ION BEAM IMPLANTATION RICE
WANG Song2li 　HUANG Qun2ce 　WANG Tie2gu 　QIN Guang2yong
( Key Laboratory of Ion Beam Bio2engineering , Zhengzhou University , Zhengzhou , Henan 　450052)
Abstract :Dry seeds of five varieties of rice were implanted by 25KeV low energy N+ with doses of 210 ×1017 , 215 ×1017 and
310 ×1017 N + Πcm2 , respectively. Mutant plants were selected from their progenies and the biological effects of the mutant
plants were studied. The results showed that chlorophyll content of mutant plants was higher than that of the control , and one
of those is as high as 148167 % of chlorophyll content compared with the control . Isoenzyme activities (POD , CAT and SOD)
of mutant plants were different from the control plants. And AFLP analysis showed that the similarity between variant plants
and feminine control plants was higher than that between variant plants and masculine control plants.
Key words :ion beam of N + ; rice ; FHS ; chlorophyll ; isoenzyme ; AFLP
收稿日期 :2006212220
基金项目 :国家“十五”科技攻关项目 (2001BA302B)
作者简介 :王松丽 (19792) ,女 ,河南郑州人 ,硕士研究生 ,主要从事生殖发育生物学研究。黄群策为通讯作者 , Tel : 0371 67766836 ; Email :
quncehuang @zzu. edu. cn
　　自 20 世纪 90 年代中期以来 ,水稻育种者一直在
寻找具有反向核雄性不育特性的水稻材料 ,试图从育
性的稳定性表达方面确保两系法杂交水稻制种的安全
性。本课题组通过离子束诱变获得反向核不育水稻品
系 FHS ,但其生长势弱和产量低的特点严重制约了它
在生产上的应用。采用常规育种方法对其进行遗传改
良 ,不仅周期长 ,而且改良性状有限。近年发展起来的
离子束生物技术具有独特的技术原理和简单的操作程
序 ,在作物育种中的实用性已经被越来越多的研究结
果所证实。
利用低能氮离子束辐照农作物种子等的生物效应
研究是由我国余增亮等[1 ] 率先开展的。1993 年 ,余增
亮、杨剑波等首次用离子束介导的方法将报告基因
GUS 和 CAT 导入水稻成熟胚和悬浮细胞[2 ] 。2000 年
吴丽芳以携带 GUS 基因的质粒为供体 ,进行了报告基
因转化小麦的研究。分子生物学证据表明 GUS 基因
已整合到小麦基因组中[3 ,4 ] 。本试验利用低能氮离子
束辐照水稻干种子的种胚 ,然后将水稻种子浸泡于一
定浓度的玉米基因组 DNA 中 ,已经初步获得了一些有
价值的实验材料。
1 　材料与方法
111 　供试材料
选用 5 个二倍体水稻品种 ( FHS、FHSΠ圭 630、99S、
培矮 64S 和新稻 9 号)的干种子为试验材料 ,其中 FHS
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是经低能氮离子束对籼型水稻品系 99202 进行诱变处
理 ,在其后代中筛选到具有育性转换特点的反向核不
育水稻品系[5 ] ;99S 是反向核不育水稻品系 FHS 的亲
本材料 ;培矮 64S 是两系杂交籼稻两优培九的父本 ,典
型的光温敏核不育水稻材料 ;新稻 9 号则是生产上应
用的常规粳稻材料。
112 　方法
11211 　水稻材料的处理 　采用能量为 25KeV ,剂量分
别为 210 ×1017 、215 ×1017 和 310 ×1017 N + Πcm2 的低能
氮离子束辐照水稻种胚 ,设有空白对照 (CK) 、诱变处
理、浸泡处理 (将水稻种子浸泡于玉米基因组 DNA 中)
和介导处理 (即辐照后将水稻种子浸泡于玉米基因组
DNA 中) 。采用 CTAB 法提取的玉米基因组 DNA ,处理
水稻种子前用 011 ×SSC 稀释成浓度为 300μgΠml。为
使水稻种子处理条件相同 ,空白对照和各处理后的种
子均用自来水浸泡 24h ,催芽 4d 后种植。
11212 　叶绿素含量的测定 　采用丙酮乙醇混合液提取
叶绿素[6 ,7 ] 。用紫外分光光度计测定波长在 645nm 和
663nm处的 OD 值 ,并计算叶绿素的浓度和含量[8 ,9 ] 。
11213 　同工酶酶活力测定 　称取水稻新鲜剑叶 013g
提取同工酶 ,加入液氮充分研磨 ,再加入 115ml 预冷的
0105molΠL 的 KH2 PO42NaOH(pH710) 溶液 ,混匀 ,于 4 ℃
下 12000rpm 离心 15min ,吸取上清液分装于离心管 ,
- 20 ℃保存备用[10 ,11 ] 。过氧化物酶 ( POD) 酶活力测定
采用愈创木酚法 ,参照李和声 ,张龙翔等方法[12 ,13 ] 。过
氧化氢酶 (CAT) 酶活力测定采用紫外吸收法 ,参考邹
琦等方法[11 ] 。超氧化物歧化酶 (SOD)酶活力测定采用
NBT光化还原法测定 ,参考邹琦和汤章城等方法[11 ,14 ] 。
以上方法均略有修改。
11214 　AFLP 分析 　离子束介导玉米基因组 DNA 转
化水稻所得的变异株用 Pst ⅠΠMse Ⅰ进行双酶切 ,再经
过连接、预扩增和选择性扩增 ,每个材料均筛选了 16
对选择性扩增引物。
2 　结果与分析
211 　水稻苗期生长
不经任何处理的水稻材料生长正常 ,经离子束诱
变处理的材料 ,幼苗生长受到较小影响。而经过离子
束介导处理的水稻材料 ,幼苗最初生长缓慢 ,经过一段
时间之后生长状态恢复 ,原因可能是玉米 DNA 的转入
导致水稻原有的遗传平衡被打乱 ,现有的遗传体系需
要时间恢复 ,使得幼苗在初期生长速度相对缓慢 ,当新
的遗传平衡建立后 ,生长又恢复正常 ,在生长 14d 后 ,
这些幼苗逐渐生长加快 ,30d 后达到正常。
212 　变异植株的筛选
图 1 是经 210 ×1017 N + Πcm2 介导处理后 ,在培矮
64SM2 代获得基本能稳定遗传的变异株。变异株的
图 1 　培矮 64S变异株
Fig. 1 　Variant plants of Pei′ai 64S
a :培矮 64SM2 代变异株 (左)和对照 (右) ;b :培矮 64S M2 代变异株 (左) 和对照 (右)叶耳、叶枕、叶舌 ;c :培矮 64S M2 代变异株 (左) 和对照 (右)的根
部及茎杆 ;d :培矮 64S M2 代变异株 (左) 和对照 (右)籽粒 ;e :培矮 64SM3 代变异株 (右)和对照 (左)植株 ;f :培矮 64SM3 代变异株 (左) 和对照 (右)穗
子 ;g :培矮 64SM3 代变异株 (左)和对照 (右) 叶耳、叶枕和叶舌
a : Variant plant (left) and contrast plant (right) of Pei′ai 64S in M2 ; b : Auricle ,pulvinus and paraphyll of Variant plant (left) and contrast plant (right) of Pei′ai
64S in M2 ; c : Roots and stems of variant plant (left) and contrast plant (right) of Pei′ai 64S in M2 ; d : Seeds of variant plant (left) and contrast plant (right) of
Pei′ai 64S in M2 ; e : Variant plant (right) and contrast plant (left) of Pei′ai 64S in M3 ; f : Spikes of variant plant (left) and contrast (right) of Pei′ai 64S in M3 ;
g : Auricle ,pulvinus and paraphyll of variant plant (left) and contrast plant (right) of Pei′ai 64S in M3
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株高、生长势和分蘖能力都优于对照 ,其叶耳、叶枕、叶
舌、茎杆和籽粒也出现了供体的性状 ,均呈现红色。将
上述培矮 64S 变异株收获的种子进行播种 ,得到 M3 代
植株 ,其变异性状基本上能够稳定遗传 ,如生长势强 ,
植株高大 ,并且分蘖能力强 ,叶耳、叶枕、叶舌和茎杆仍
保留红色 ,变异株的穗子也比对照大 (如图 1) 。
其他 3 个水稻材料在当代筛选到变异株 ,FHS 是
将水稻种子直接浸泡于玉米基因组 DNA 中 ,在其后代
植株中得到 1 株变异株 ,得到的变异株如图 2 ,变异株
生长势和分蘖能力极强 ,株高比对照高 616cm ,茎杆粗
壮 ,叶色浓绿 ,叶片比对照长 612cm ,并且生育期延迟。
FHS 经 215 ×1017N + Πcm2 介导处理后 ,存活的当代植株
由于受到纹枯病的影响 ,逐渐死亡 ,仅有 1 株存活 ,表
现抗虫 ,且生长势较强 ,叶色浓绿 ,籽粒较大 ,出现芒尖
(如图 2) 。
图 2 　FHS变异株
Fig. 2 　Variant plants of FHS
a :FHS变异株 (左) 和对照 (右) ;b :FHS抗虫植株 ;c :抗虫植株 (左)和对照 (右)穗
a :Variant plant (left) and contrast plant (right) of FHS; b :Resisting plant of FHS; c :Spikes of resisting plant (left) and contrast plant (right) of FHS
　　99S 经 310 ×1017N + Πcm2 介导处理后 ,当代植株中
有 1 株变异明显 , 其生长势极强 , 植株比对照高
819cm ,叶色浓绿 ,叶片比对照长 516cm ,穗子、籽粒和
叶耳明显大于对照 ,且稃尖呈红色 (如图 3) 。
新稻 9 号经 215 ×1017N + Πcm2 介导处理后 ,其当代
植株中有 2 株变化比较明显 ,两株均无分蘖 ,茎杆直
立 ,1 株较高 ,1 株稍低 ,生长势弱于对照 ,但穗长和籽
粒均大于对照 ,籽粒呈红色且有红色芒尖 ,生育期提前
(如图 4) 。此外 ,FHS 和 FHSΠ圭 630 经 310 ×1017 N + Πcm2
处理的当代植株中均有 1 株晚熟且分蘖能力增强的植
株 ; FHSΠ圭 630 经 215 ×1017 N + Πcm2 介导处理的当代植
株中有 1 株稃尖呈红色 ,籽粒微呈褐黄色。
图 3 　99S变异株
Fig. 3 　Variant plants of 99S
a :99S变异株 (右)和对照 (左) ;b :99S变异株 (右)和对照 (左)穗 ;c :99S变异株 (右)和对照 (左)的叶耳
a :Variant plant (right) and contrast plant (left) of 99S; b :Sprikes of variant plant (right) and contrast plant (left) of 99S;
c :Auricle of variant plant (right) and contrast plant (left) of 99S
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图 4 　新稻 9 号变异株
Fig. 4 　Variant plants of Xin29
a :新稻 9 号变异株 (左) 和对照 (右) ;b :新稻 9 号变异株 (上)和对照 (下)穗
a :Variant plant (left) and contrast plant (right) of Xin29 ; b :Sprikes of variant plant (above) and contrast plant (under) of Xin29
213 　叶绿素含量测定
根据农艺学性状初步筛选得到的变异株 ,对其叶
绿素含量进行了测定。由表 1 可以看出 ,所有植株叶
绿素 a 的浓度都比 b 高 ,变异株叶绿素总含量均比对
照材料高 ,且差异明显。其中 99S 经 310 ×1017 N + Πcm2
介导处理后获得的变异株的叶绿素总含量比对照高
48167 %。培矮 64S 的叶绿素含量相对于其他材料低
一些 ,主要原因是种植较晚 ,在此情况下 ,培矮 64S 介
导处理获得的 M3 代材料叶绿素含量仍然比对照高
19176 %。原因可能是经过离子束生物技术的介导作
用 ,玉米 DNA 有关片段与水稻基因组 DNA 发生整合 ,
导致水稻个别植株表现出玉米的高光效特性。
表 1 　变异植株和对照的叶绿素含量
Table 1 　Chlorophyll content of variant plants
材料
materials
处理
treatment
OD 色素浓度
pigment concentration (mgΠL) 叶绿素含量pigment content (mgΠg·FW)
OD663 OD645 Ca Cb a b a + b
培矮 64S
Pei′ai 64S
FHS
99S
新稻 9 号
Xin29 CK 01392 01145 415883 114859 111471 013715 115186M3 01466 01175 514474 118266 113619 014567 118186CK 01820 01332 915209 318376 213802 019594 313396浸泡处理 01874 01365 1011179 412642 215295 110661 315956介导处理 B 01998 01412 1115663 417642 218916 111911 410827CK 01695 01285 810598 312739 210150 018185 218335介导处理 C 11118 01485 1019762 518743 217441 114686 412127CK 01680 01265 719231 218861 119808 017215 217023介导处理 B 01864 01354 1010205 410631 215051 110158 315209
注 :B :介导处理注入剂量 215 ×1017N + Πcm2 ; C :介导处理注入剂量 310 ×1017N + Πcm2 。下表同。
Note : B :treatment transfered by ion beam at 215 ×1017N + Πcm2 ; C :treatment transfered by ion beam at 310 ×1017N + Πcm2 . The same as following table.
表 2 　变异植株同工酶酶活力分析
Table 2 　Isoenzyme activities of variant plants were analyzed
材料
materials
处理
treatment
ΔA470
POD
(U 3 g - 1min - 1) ΔA240 CAT(U 3 g - 1min - 1) A0 - As SOD(U 3 g - 1)
培矮 64S
Pei′ai64S
FHS
99S
新稻 9 号
Xin29 CK 01030 750 01027 135 01614 29612M3 01036 900 01029 145 01637 30713CK 01035 880 01040 200 01625 30115浸泡处理 01062 1550 01039 195 01444 21412介导处理 B 01072 1800 01042 210 01637 30713CK 01044 1100 01043 215 01328 15812介导处理 C 01081 2030 01032 160 01586 28217CK 01065 1630 01044 220 01512 24619介导处理 B 01031 780 01041 205 0141 21217
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214 　同工酶酶活力分析
研究了离子束注入后水稻抽穗前后剑叶过氧化物
酶 (POD) 、过氧化氢酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD)
的同工酶酶活力变化。结果表明 ,经玉米 DNA 浸泡处
理和离子束介导处理不同水稻材料获得的变异株 ,
POD、CAT和 SOD 的变化规律不一致 ,各种酶活力的变
化也没有一定规律 ,但是变异株 3 种酶活力与对照之
间均有明显差异 (表 2) 。
215 　AFLP 分析
选用 16 对选择性扩增引物组合对 2 份水稻材料
的 2 个样品进行扩增 ,其中培矮 64S 和 FHS 分别有 15
对和 14 对引物组合扩增出清晰可辨的条带。阴性对
照扩增效果与样品基本相当 ,而阳性对照玉米扩增的
条带数相对少一些。从清晰条带的引物组合中分别筛
选出 6 对差异条带扩增明显的引物组合 ,进行差异条
带的分析。如图 5 ,培矮 64S 的变异植株 M3 代与阴性
对照之间 ,6 对引物组合均有差异条带 (见图 5 中方
框) ,并且差异显著 ,试验重复性好。至于变异株与阳
性对照之间的差别 ,只有 P2AAG和 M2CTG组合变异株
与阳性对照之间的条带存在相关性。由图 6 可知 ,
FHS的变异植株与阴性对照之间 , 6 对引物组合中有
5 对出现明显的差异条带 (见图 6 中方框) ,并且试验
重复性好。本实验结果表明 ,样品与阴性对照相比 ,条
带差异主要表现在条带的增加或者减少 ,差异显著 ,
图 5 　培矮 64S变异株 M3 和对照 AFLP选择性扩增银染电泳图谱
Fig. 5 　Selectivity extended bands of Pei′ai 64S in M3
选择性扩增引物依次为 P2AAC和 M2CTT ,P2AAG分别与 M2CAA ,M2CAC ,M2CAT ,M2CTA ,M2CTG的组合
M: Marker ( ФХ174 Hinc Ⅱ) ,1 :变异株 ,2 :阴性对照 ,3 :阳性对照 (下图同)
Selectivity extended primer pairs were P2AAC + M2CTT , P2AAG+ M2CAA , P2AAG+ M2CAC , P2AAG+ M2CAT , P2AAG+ M2CTA and P2AAG+ M2CTG1
M: marker , 1 : variant plant ;2 : feminine contrast plant ; 3 : masculine contrast plant (the same as the following Fig)
图 6 　FHS变异株和对照 AFLP选择性扩增银染电泳图谱
Fig. 6 　Selectivity extended bands of FHS in M3
选择性扩增引物依次为 P2AAC和 M2CTT ,P2AAG分别和 M2CAA ,M2CAG,M2CAT ,M2CTG,M2CTT的组合
Selectivity extended primer pairs were P2AAC + M2CTT , P2AAG+ M2CAA , P2AAG+ M2CAG, P2AAG+ M2CAT , P2AAG+ M2CTG and P2AAG+ M2CTT
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并且重复性好 ,与阳性对照之间的相关性不太强。原
因可能是经过离子束的介导作用之后 ,水稻的基因组
发生了一些变化 ,整合了玉米 DNA 片段 ,至于片段大
小 ,还有待进一步对差异条带进行回收 ,取得确凿证
据。
3 　讨论
低能离子束介导转基因技术是创建于我国的一种
新的物理遗传转化技术 ,已成功地将目的基因导入水
稻获得状基因植株[16 ] 。借助离子束介导等方法转移
活性裸露 DNA 大分子已成为当前基因工程研究的热
点。这可能由于低能离子不仅在细胞的表面造成可修
复的机械损伤成为外源 DNA 进入细胞内的通道 ,而且
正电离子与靶细胞的电荷交换使微孔通道积累正电
荷 ,能吸引带负电荷的外源 DNA 分子进入细胞 ,同时
离子束的动量、能量效应造成细胞内基因组 DNA 可修
复的损伤 ,增加了外源 DNA 重组和插入细胞基因的几
率 ,引起后代更为广泛的变异 ,为育种工作提供了更为
丰富的种质资源。
通过离子束介导玉米基因组 DNA 转入水稻 ,对获
得的变异株进行生理生化指标的测定结果表明 ,变异
株有可能整合了玉米的基因片段 ,不同程度地表现出
供体的性状。对变异株的 AFLP 扩增结果进行分析 ,
扩增条带与阴性对照相似率很高 ,而与玉米的相似率
很低 ,说明外源 DNA 导入植物后 ,后代的基因组结构
与 DNA 受体高度相似 ,这与动物材料的试验结果一
致[15 ] 。经离子束介导获得的变异株扩增条带与阴性
对照存在明显的差异条带 ,出现了新增带、缺失带、增
强带和减弱带等 ,这些差异带提示外源 DNA 可能已经
整合到受体的基因组中 ,同时为进一步寻找转基因的
分子证据提供了帮助。
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